산가수분해법과 칼럼크로마토그라피법을 이용하여 레반올리고당과 저분자량 레반을 생산하였다. 레반에 대한 산가수분해반응은 시간의존적으로 비례적으로 진행되었으며, 다른 미생물 유래의 레반을 사용시에도 동일한 결과를 나타내었다. 레반 올리고당의 제조를 위한 최적화된 조건은 5% 레반을 0.38 M 황산, 95$^{\circ}C$, 4분간 처리하였을 때였으며, 최종생산물로 중합도 3-6의 레반 올리고당을 얻었다. 생성된 레반을 올리고당을 탄소 원으로 이용하여 두 젖산 생성균주(Lactobacillus plantaurm KCTC 3104와 Pedioccccus pentosaceus KCTC3507)의 생장배지에 첨가하고 레반 자체를 첨가한 배지와 비교시, 뚜렷한 생육촉진효과와 pH 감소효과가 나타났다.
산가수분해법과 칼럼크로마토그라피법을 이용하여 레반 올리고당과 저분자량 레반을 생산하였다. 레반에 대한 산가수분해반응은 시간의존적으로 비례적으로 진행되었으며, 다른 미생물 유래의 레반을 사용시에도 동일한 결과를 나타내었다. 레반 올리고당의 제조를 위한 최적화된 조건은 5% 레반을 0.38 M 황산, 95$^{\circ}C$, 4분간 처리하였을 때였으며, 최종생산물로 중합도 3-6의 레반 올리고당을 얻었다. 생성된 레반을 올리고당을 탄소 원으로 이용하여 두 젖산 생성균주(Lactobacillus plantaurm KCTC 3104와 Pedioccccus pentosaceus KCTC3507)의 생장배지에 첨가하고 레반 자체를 첨가한 배지와 비교시, 뚜렷한 생육촉진효과와 pH 감소효과가 나타났다.
Levan oligosaccoharides and low molecular weight levin were produced from levin by acid hydrolysis and following column chromatography. Levan hydrolysis was progressed proportionally as increased incubation time. In terms of levan hydrolysis reaction, no differences were found from the sources of le...
Levan oligosaccoharides and low molecular weight levin were produced from levin by acid hydrolysis and following column chromatography. Levan hydrolysis was progressed proportionally as increased incubation time. In terms of levan hydrolysis reaction, no differences were found from the sources of levan. Optimum hydrolysis conditions for the formation of levan oligosaccharides were, 0.38 M H$_2$S0$_4$; and incubation at 95$\^{C}$ for 4 min. The purified products were determined as the mixture of oligosaccharides (degree of polymerization (DP) of 3-6), Two of lactic acid-producing bacteria, Lactobacillus plantarum KCTC 3104 and Pediococcus pentosaceus KCTC 3507, were studied in vitro for their ability to metabolize levin oligosaccharides. Apparently, the growth of both cells were increased by levin oligosaccharide diet, compared with those of levan diets, suggesting that levan oligosaccharides may be beneficial in selectively growth of lactic acid-producing bacteria.
Levan oligosaccoharides and low molecular weight levin were produced from levin by acid hydrolysis and following column chromatography. Levan hydrolysis was progressed proportionally as increased incubation time. In terms of levan hydrolysis reaction, no differences were found from the sources of levan. Optimum hydrolysis conditions for the formation of levan oligosaccharides were, 0.38 M H$_2$S0$_4$; and incubation at 95$\^{C}$ for 4 min. The purified products were determined as the mixture of oligosaccharides (degree of polymerization (DP) of 3-6), Two of lactic acid-producing bacteria, Lactobacillus plantarum KCTC 3104 and Pediococcus pentosaceus KCTC 3507, were studied in vitro for their ability to metabolize levin oligosaccharides. Apparently, the growth of both cells were increased by levin oligosaccharide diet, compared with those of levan diets, suggesting that levan oligosaccharides may be beneficial in selectively growth of lactic acid-producing bacteria.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 산분해법에 의하여 저분자량의 레반과 레반 올리고당을 생성하는 공정의 최적화를 위하여 산가수분해 조건과 분리공정에 대한 연구를 수행하였다. 또한, 생산된 레반 올리고당을 유산균 배양 실험을 통하여 유산균 생육 촉진 여부를 조사하였다.
제안 방법
45 m 여과막으로 여과한 다음, 여액 50 L를 고속액체크로마토그라피 (HPLC, Backman, USA)에 주입하여 정량하였다. HPLC 분석조건은 50℃로 유지시킨 칼럼 (lonpak KS-802, Shodex사 제품)을 이용하여 증류수를 0.4 mL/min의 속도로 홀려 주었고, 굴절율 (refractive index)에 의해 검출하였다. 필요에 따라서, Sugar Pak 1(6.
TLC분석은 시료 1 L 취하여 Silica gel 60 F254(Merck) TLC plate에 집적하여 전개 용매(1-propanol: ethyl acetate : water = 45 : 35 : 20)로 두 번 전개하고 건조한 후 ureaphosphoric acid 발색 시약으로 프락토 올리고당의 성분을 확인 하였다.
레반을 형성하는 β-2,6 결합은 이눌린의 결합구조인 β-2,1 결합구조와 비교시에 열처리와 산처리에 가수분해가 쉽게 진행되므로(3), 산의 종류에 따른 레반의 가수분해 효과를 관찰하고자 pH 2로 조절된 염산, 옥살산, 황산을 사용하여 레반을 산 가수분해 후에 TLC로 분석한 결과를 Figure 1에 나타내었다. 가수분해에 사용한 세가지 산 중에서 황산의 가수분해능이 가장 우수하게 나타났으므로, 가수분해조건을 보다 세분화하기 위하여 황산을 0.30, 0.38, 0.45 M의 농도에서 미리 온도를 85℃, 90℃, 95℃로 조절된 water-bath에서 4분간 가수분해를 실시하였다. 반응 후 NaOH를 가하여 pH를 중화시켜서, 5배의 알코올을 가한 후 원심분리하여 상층액과 침전물을 분획하여, 상층액에서의 환원당의 양을 측정하였다 (Table 1).
5 g, K2HPO4 1 g, KH2PO4 1 g, NaHCO3 10 g, NaCl 2 g였다. 가압살균된 배지용액을 냉각 후에 필터로 여과된 당용액들을 최종농도 0.5%(w/v)로 첨가하였다. 배양실험을 위하여, 전날 계대 배양된 신선한 배양액을 변형된 PYF 배지에 접종하였으며, 37℃에서 20-25시간 배양하였으며, 흡광도 600 nm에서 균체의 농도를 측정하였다.
2 mL/min으로 하여 실온에서 굴절율에 의해 시료를 분석하였다. 과당, 포도당, 서당, 프락토-올리고당 등 각 표준당을 각 농도별로 20 L loop에 주입하여 검출하였으며, 각 농도별에 따른 peak 면적을 이용하여 표준곡선을 작성하였다.
pentosaceus KCTC 3507) 생육배지에 탄소원으로 레반 올리고당을 공급하였다. 당 종류에 따른 생육정도를 비교하기 위하여, 물, 레반, 포도당, 레반 올리고당을 탄소원으로 첨가하였다. 배양시간에 따른 미생물의 생육정도와 발효에 따른 pH 변화를 측정한 결과를 Figure 5에 나타내었다.
pentosaceus KCTC 3507) 생육배지에 탄소원으로 레반 올리고당을 공급하였다. 당 종류에 따른 생육정도를 비교하기 위하여, 물, 레반, 포도당, 레반 올리고당을 탄소원으로 첨가하였다. 배양시간에 따른 미생물의 생육정도와 발효에 따른 pH 변화를 측정한 결과를 Figure 5에 나타내었다.
따라서, 본 연구에서는 산분해법에 의하여 저분자량의 레반과 레반 올리고당을 생성하는 공정의 최적화를 위하여 산가수분해 조건과 분리공정에 대한 연구를 수행하였다. 또한, 생산된 레반 올리고당을 유산균 배양 실험을 통하여 유산균 생육 촉진 여부를 조사하였다.
레반 올리고당을 제조하기 위하여 열처리, 산종류, 산의 농도와 반응시간에 대한 효과를 비교하였다. 레반을 형성하는 β-2,6 결합은 이눌린의 결합구조인 β-2,1 결합구조와 비교시에 열처리와 산처리에 가수분해가 쉽게 진행되므로(3), 산의 종류에 따른 레반의 가수분해 효과를 관찰하고자 pH 2로 조절된 염산, 옥살산, 황산을 사용하여 레반을 산 가수분해 후에 TLC로 분석한 결과를 Figure 1에 나타내었다.
45 M의 농도에서 미리 온도를 85℃, 90℃, 95℃로 조절된 water-bath에서 4분간 가수분해를 실시하였다. 반응 후 NaOH를 가하여 pH를 중화시켜서, 5배의 알코올을 가한 후 원심분리하여 상층액과 침전물을 분획하여, 상층액에서의 환원당의 양을 측정하였다 (Table 1). 5% 레반 수용액은 불투명한 회색이었으나, 0.
5%(w/v)로 첨가하였다. 배양실험을 위하여, 전날 계대 배양된 신선한 배양액을 변형된 PYF 배지에 접종하였으며, 37℃에서 20-25시간 배양하였으며, 흡광도 600 nm에서 균체의 농도를 측정하였다.
본 실험에서 획득된 레반 올리고당의 장내유산균의 생육 촉진 효과를 조사하기 위하여 2가지의 유산균의 (£. plantarum KCTC 3104와 P. pentosaceus KCTC 3507) 생육배지에 탄소원으로 레반 올리고당을 공급하였다. 당 종류에 따른 생육정도를 비교하기 위하여, 물, 레반, 포도당, 레반 올리고당을 탄소원으로 첨가하였다.
산종류에 따른 산 가수 분해 효과를 비교하기 위하여, 세 가지의 산을 사용하였으며, 이들 산 용액의 pH는 1.6-2.0으로 조절하였다. 산가수분해 반응은 5% 레반 수용액에 0.
하지만, 레반 올리고당은 상기의 유기용매 처리와 원심분리법에 의하여 침전되지 않는다. 이러한 용해도 차이의 특성을 이용하여 에탄올을 5배 가한 후에 원심분리법으로 (5,000 rpm, 10분) 레반 올리고당과 저분자량 레반을 선택적으로 분리하였다. 레반 올리고당 의 분리공정을 간략하게 Figure 3에 나타내었다.
한편, 레반 올리고당을 제조하기 위해서, 원심분리 후에 회수된 상층액을 60℃로 설정된 회전식 증발기로 농축시킨 후에, 칼럼 크로마토그라피법을 사용하였다. 이를 위하여 Silica gel을 유리칼럼 (3×50 cm) 에 충진시킨 후, 전용량에 대해 1-5%의 시료액을 용출, 분획 하였다. 용출액은 클로르포름-에탄올-물 (3-3-2)으로 하였고, 분취된 획분은 동결건조하여 중합도 3-6의 올리고당을 얻었다.
38 M 황산 용액에서 95℃에서 4분간 반응한 후, 5배의 에탄올을 첨가한 후, 원심분리법에 (5,000 rpm, 10분) 의하여 침전물(저분자량레반)과 상층액(레 반올리고당)으로 분리하였다. 저분자량의 레반을 제조하기 위하여, 침전물을 동결건조 하였다. 한편, 레반 올리고당을 제조하기 위해서, 원심분리 후에 회수된 상층액을 60℃로 설정된 회전식 증발기로 농축시킨 후에, 칼럼 크로마토그라피법을 사용하였다.
4 mL/min의 속도로 홀려 주었고, 굴절율 (refractive index)에 의해 검출하였다. 필요에 따라서, Sugar Pak 1(6.5x300 mm) 칼럼을 사용하여 이동상을 물로 유속을 0.2 mL/min으로 하여 실온에서 굴절율에 의해 시료를 분석하였다. 과당, 포도당, 서당, 프락토-올리고당 등 각 표준당을 각 농도별로 20 L loop에 주입하여 검출하였으며, 각 농도별에 따른 peak 면적을 이용하여 표준곡선을 작성하였다.
본 실험의 결과로부터 보다 큰 중합도의 레반 올리고당을 제조하기 위해서는 황산의 농도를 감소하거나 반응온도를 조절함으로써 가능하리라 사료된다. 한편, 레반의 크기와 구조에 따른, 산가수 분해율을 비교하기 위하여 두 종류의 미생물(Z. mobilis 혹은 P. aurantiaca) 유래의 levansucrase 로 부터 합성된 레반을 수용액 상태로 만든후에 인공위액을 이용하여 산가수분해 하였다. 두 레반 공히 산 가수분해 시간에 비례하여 레반의 가수분해가 진행되었다 (Figure 2).
대상 데이터
본 실험에 사용한 레반은 Zymomonas mobilis 혹은 Pseudomonas aurantiaca S-4380 유래의 levansucrase을 이용하여 생산하였으며, (주)리얼바이오텍 (한국생명공학연구원내 소재, 대전)에서 제공 받아 사용하였다 염산과 황산은 특급시료를 사용하였다. Fructooligosaccharides는 Wako사 제품을 사용하였고 그 외의 시약은 특급 시약을 사용하였다.
일반적으로, 식물체 유래의 레반은 과당의 결합이 주로 직선상태로 이루어져 있는 반면에, 미생물 유래의 레반은 가지구조로 형성되어 있다(3). 본 실험에 사용한 레반은 Z. rtiobiHs와 P. awaMaca에서 유래되었으며, 분자량은 6백만과 70만, 그리고 레반의 가지정도는 각각 12%와 6%로 매우 상이한 구조를 가지고 있다(8). 따라서, 본 연구 결과로부터 레반의 산 가수 분해는 레반의 구조와 크기에 큰 영향 없이 진행된다고 결론 지었다.
본 실험에 사용한 레반은 Zymomonas mobilis 혹은 Pseudomonas aurantiaca S-4380 유래의 levansucrase을 이용하여 생산하였으며, (주)리얼바이오텍 (한국생명공학연구원내 소재, 대전)에서 제공 받아 사용하였다 염산과 황산은 특급시료를 사용하였다. Fructooligosaccharides는 Wako사 제품을 사용하였고 그 외의 시약은 특급 시약을 사용하였다.
mobilis 유래의 levansucrase를 이용하여 생합성되었으며, 레반의 평균 중합도는 6×106 이상으로, 완전히 분해시에는 과당과 극소량의 포도당으로만 이루어져 있었다. 본 실험에 사용한 레반의 구성성분은 식품개발연구원에서 분석하였으며, 탄수화물 95.6%, 회분 0.2%, 수분 4.2%으로 구성되었다. 레반의 점도는 온도가 증가함에 따라 점도가 감소하는 일반적인 다당류의 특성을 나타내었으며 온도가 10℃에서 50℃로 증가함에 따라 4% (w/v) 레반수용액의 점도는 약 67% 감소하였다.
실험에 사용한 균주로는 Lactobacillus plantarum KCTC 3104와 Pediococcus pentosaceus KCTC 3507였으며, 균주의 배양을 위하여 변형된 PYF 배지를 사용하였다. 변형된 PYF 배지조성은 1 리터당 Yeast Extract 10 g, Peptone 5 g, Tryptone 5 g, L-cystein hydrochloride hydrate 0.
이론/모형
0)를 가한 후, 90℃에서 5분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위하여 50 mM NaOH로 pH를 중성화 시킨 후에 TLC 법으로 분석하였다. 환원당 및 총당의 함량은 DNS법 및 Anthrone법으로 측정하였다.
산가수분해법과 칼럼크로마토그라피법을 이용하여 레반 올리고당과 저분자량 레반을 생산하였다. 레반에 대한 산가수 분해반응은 시간의존적으로 비례적으로 진행 되었으며, 다른 미생물 유래의 레반을 사용시에도 동일한 결과를 나타내었다.
저분자량의 레반을 제조하기 위하여, 침전물을 동결건조 하였다. 한편, 레반 올리고당을 제조하기 위해서, 원심분리 후에 회수된 상층액을 60℃로 설정된 회전식 증발기로 농축시킨 후에, 칼럼 크로마토그라피법을 사용하였다. 이를 위하여 Silica gel을 유리칼럼 (3×50 cm) 에 충진시킨 후, 전용량에 대해 1-5%의 시료액을 용출, 분획 하였다.
반응을 정지시키기 위하여 50 mM NaOH로 pH를 중성화 시킨 후에 TLC 법으로 분석하였다. 환원당 및 총당의 함량은 DNS법 및 Anthrone법으로 측정하였다.
성능/효과
awaMaca에서 유래되었으며, 분자량은 6백만과 70만, 그리고 레반의 가지정도는 각각 12%와 6%로 매우 상이한 구조를 가지고 있다(8). 따라서, 본 연구 결과로부터 레반의 산 가수 분해는 레반의 구조와 크기에 큰 영향 없이 진행된다고 결론 지었다.
레반을 탄소원으로 공급시에는 미생물의 생육정도는 당을 첨가하지 않은 군과 비슷한 양상을 보였으며 이는 분자량이 큰 레반은 장내 미생물에서 탄소원으로 이용이 제한된다는 다른 연구자의 결과와 일치된다(12) (Figure 5). 레반 올리고당을 탄소원으로 공급하였을 때는 포도당을 이용한 발효정도 (흡광도 변화와 pH변화)와 매우 유사하게 나타나, 본 실험에서 제조된 레반 올리고당이 유산균의 발효에 이용이 되었다는 것을 보여 주었다. 예를 들면, 장내균총에 많이 존재하는 L.
2%으로 구성되었다. 레반의 점도는 온도가 증가함에 따라 점도가 감소하는 일반적인 다당류의 특성을 나타내었으며 온도가 10℃에서 50℃로 증가함에 따라 4% (w/v) 레반수용액의 점도는 약 67% 감소하였다. 하지만, 수용액 상태의 레반은 50℃에서는 점차 가수분해가 일어나 단당류로 분해 되었고, 8% 농도에서는 수화가 되지 않았다.
38 M 황산을 95℃에서 4분간 가열하였을 때, 물처럼 투명한 특성을 나타내었다. 상층액을 이용한 TLC 분석결과에서는 단당류, 이당류를 포함한 올리고당, 다당류의 혼합형태로 존재하였으며, 황산의 농도를 증가시키거나 반응온도를 증가시에는 올리고당의 함량은 감소되고 상대적으로 단당류의 농도가 증가하였다. 따라서, 산업적으로 널리 사용되는 올리고당인 중합도 3-6의 레반 올리고당을 우선적으로 제조하는 조건은 5% 레반 수용액을 0.
38 M 황산, 95℃, 4분간 처리하였을 때 였으며, 최종생산 물로 중합도 3-6의 레반 올리고당을 얻었다. 생성된 레반 올리고당을 탄소원으로 이용하여 두 젖산 생성균주(Lactobacillus plantarum KCTC 3104와 Pediococcus pentosaceus KCTC 3507)의 생장배지에 첨가하고 레반 자체를 첨가한 배지와 비교시, 뚜렷한 생육촉진효과와 pH 감소효과가 나타났다.
저분자량 및, 레반 올리고당 생산을 위해 사용된 레반은 Z.mobilis 유래의 levansucrase를 이용하여 생합성되었으며, 레반의 평균 중합도는 6×106 이상으로, 완전히 분해시에는 과당과 극소량의 포도당으로만 이루어져 있었다. 본 실험에 사용한 레반의 구성성분은 식품개발연구원에서 분석하였으며, 탄수화물 95.
후속연구
결론적으로, 본 연구결과는 레반 올리고당을 이용한 장내 유산균 생육촉진제의 효능을 보여 주었으며, 또한, 다양한 생리기능이 예상되는 저분자량의 레반제조에 유용한 정보를 제공하리라 기대된다.
하지만, 이들의 연구는 중합도 380-1600인 레반에 제한되며, 중합도 380이하 혹은 1600 이상에서의 항암효과는 연구되지 않았다. 따라서, 본 연구에서 제시된 저분자량의 레반 생성 방법과 상업적으로 이용이 가능한 다양한 크기의 막여과 장치를 이용한다면, 레반의 분자량 조절이 가능할 것이다.
38 M 황산으로 95℃ 에서 4분으로 결정하였다 (Table 1). 본 실험의 결과로부터 보다 큰 중합도의 레반 올리고당을 제조하기 위해서는 황산의 농도를 감소하거나 반응온도를 조절함으로써 가능하리라 사료된다. 한편, 레반의 크기와 구조에 따른, 산가수 분해율을 비교하기 위하여 두 종류의 미생물(Z.
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