Poly-Iysine이 tagging된 hEGF와 angiogenin(6L10ESA)의 융합단백질의 고체상 재접힘이 heparin-Sepharose colullln에서 수행되었을 때, untagging 단백질(E5h)의 기존의 액상 재접힘 방법과 비교하여 재접힘 수율은 약 13배 정도 증가하였다. 게다가 poly-Iysine tagging된angiogenin은 heparin에 친화도를 높여주므로 2.5배에서 3배 정도의 흡탁 수율이 증가한다. 재접힘 수율은 고체상 반응으로 인해 높은 재현성을 보였다. 재접힘 공정시간은 대략 8배 단축되었다. 고체상 재전힘된 단백질은 자신의 생물학적 역가를 유지하였다. 따라서 이 연구는 고체상 재접힘 방법이 분자간의 상호작용을 억제하여 응집현상을 현저히 줄였기 때문에 기인한 결과로 생각된다. 따라서 응집으로 인한 재접힘 수율이 낮은 단백질의 재접힘 긍정에 고체상 재접힘 공정을 사용하면 높은 재접힘 수율을 얻을 수 있다.
Poly-Iysine이 tagging된 hEGF와 angiogenin(6L10ESA)의 융합단백질의 고체상 재접힘이 heparin-Sepharose colullln에서 수행되었을 때, untagging 단백질(E5h)의 기존의 액상 재접힘 방법과 비교하여 재접힘 수율은 약 13배 정도 증가하였다. 게다가 poly-Iysine tagging된angiogenin은 heparin에 친화도를 높여주므로 2.5배에서 3배 정도의 흡탁 수율이 증가한다. 재접힘 수율은 고체상 반응으로 인해 높은 재현성을 보였다. 재접힘 공정시간은 대략 8배 단축되었다. 고체상 재전힘된 단백질은 자신의 생물학적 역가를 유지하였다. 따라서 이 연구는 고체상 재접힘 방법이 분자간의 상호작용을 억제하여 응집현상을 현저히 줄였기 때문에 기인한 결과로 생각된다. 따라서 응집으로 인한 재접힘 수율이 낮은 단백질의 재접힘 긍정에 고체상 재접힘 공정을 사용하면 높은 재접힘 수율을 얻을 수 있다.
A fusion protein, consisting of a human epidermal growth factor as the recognition domain and human angiogenin as the toxin domain, can be used as a targeted therapeutic against breast cancer cells among others. The fusion protein was expressed as an inclusion body in recombinant E. coli, yet when t...
A fusion protein, consisting of a human epidermal growth factor as the recognition domain and human angiogenin as the toxin domain, can be used as a targeted therapeutic against breast cancer cells among others. The fusion protein was expressed as an inclusion body in recombinant E. coli, yet when the conventional solution-phase refolding process was used the refolding yield was very low due to severe aggregation, probably because of the opposite surface charge resulting from the vastly different pl values of each domain. Accordingly the solid-phase refolding process, which exploits the ionic interactions between a solid matrix and the protein, was tried, however the ionic binding yield was also very low regardless of the resins and pH conditions used. Therefore, to provide a higher affinity toward the solid matrix, six Iysine residues were tagged to the N-terminus of the hEGF domain. When cation exchange resins, such as heparin- or CM-Sepharose, were used as the matrix, the adsorption capacity increased 2.5~3-fold and the subsequent refolding yield increased nearly 15-fold compared to the conventional process. A similat result was also obtained when an Ni-NTA metal affinity resin was used.
A fusion protein, consisting of a human epidermal growth factor as the recognition domain and human angiogenin as the toxin domain, can be used as a targeted therapeutic against breast cancer cells among others. The fusion protein was expressed as an inclusion body in recombinant E. coli, yet when the conventional solution-phase refolding process was used the refolding yield was very low due to severe aggregation, probably because of the opposite surface charge resulting from the vastly different pl values of each domain. Accordingly the solid-phase refolding process, which exploits the ionic interactions between a solid matrix and the protein, was tried, however the ionic binding yield was also very low regardless of the resins and pH conditions used. Therefore, to provide a higher affinity toward the solid matrix, six Iysine residues were tagged to the N-terminus of the hEGF domain. When cation exchange resins, such as heparin- or CM-Sepharose, were used as the matrix, the adsorption capacity increased 2.5~3-fold and the subsequent refolding yield increased nearly 15-fold compared to the conventional process. A similat result was also obtained when an Ni-NTA metal affinity resin was used.
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문제 정의
고체상 재접힘된 단백질은 자신의 생물학적 역가를 유지하였다. 따라서 이 연구는 고체상 재접힘 방법이 분자간의 상호작용을 억제하여 응집 현상을 현저히 줄였기 때문에 기인한 결과로 생각된다. 따라서 응집으로 인한 재접힘 수율이 낮은 단백질의 재접힘공정에 고체상 재접힘 공정을 사용하면 높은 재접힘 수율을 얻을 수 있다.
이것은 poly-lysine의 강한 양이온성을 이용하여 양이온 교환수지에 대한 친화력을 향상시키기 위함이다. 본 논문에서는 6L10E5A 의 고체상 재접힘 공정의 적용과 기존의 액상 재접힘 공정과 비교하여 서술하고자 한다.
제안 방법
이는 angiogenin 이 분자량이 크고 또한 pl 값이 매우 높기 때문에 이온교환수지의 흡착능을 높이기 위해서 양이온 교환수지를 선택하였다. 6L10E5A 내포체를 다양한 pH (6, 7, 8, 9, 10)에서 여러가지 resin(CM~Sepharose, Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, and heparin- Sepharose)에 적용하였다. Figure 4는 흡착수율이 양이온 교환수지에 더 강한 친화도를 가지는 poly-lysine 이 붙음으로써 크게 개선됨을 보여준다.
E5A가 여러가지 담체에 대해서 흡착 능력이 떨어지기 때문에 우리는 흡착 능력을 높이기 위해서 여섯 개의 lysine 잔기들은 E5A(6L10EA5)의 N-말단에 붙어서 양이온 교환수지에 결합력을 높게 만들어 주었다. Angiogenin(14 kDa, pl>9.
Heparin-Sepharose로부터 분류된 peak의 용출물은 투석을 거치고 RNase의 생활성을 확인하였다. 생활성은 다른 미생물로부터 정제된 angiogenin 대비 65%를 나타내었다.
회수했다. SDS-PAGE(16%)과 Western blotting을 사용하여 목적단백질의 발현을 체크하였고 발현된 양은 scanning densitometer를 사용하여 정량하였다. 회수한 세포는 파쇄 버퍼(100 mM sodium phosphate, 1% Tween 20, pH 7.
이는 친화작용으로부터 재조합 h旧GF를 정재하는데 사용된다. 같은 실험 조건에서 흡착능력의 비교를 위해서 Ni-NTA resin에 6L10E5A의 비교실험 하였다. pH 7과 pH 9 사이에서 흡착 수율은 70(±5%)에서 일정하였다.
고체상 재접힘을 위해 우선 두 용해된 단백질 E5A와 6L10E5A에 대한 적당한 고체 담체의 선정을 위해 흡착조건과 평형 흡착능을 다양한 pH, ionic strengths에서 테스트하였 匸}. CM-Sepharose, Q-Sepharose, DEAE-Sepharose와 phenyl- Sepharose는 Amersham pharmacia Biotech(Uppsala Sweden) 에서 구입하였다.
그러므로 응집현상을 해결하기 위해 고체상 재접힘 공정 (solid-phase refolding)을 개발하였다. 기본적으로 고체상 재접힘 공정은 3단계로 구성된다.
네 가지 종류의 이온 교환수지 (CM-Sepharose, heparin- Sepharose, Q-Sepharose and DEAE-Sephrose) 들을 다양한 pH (6-10)에서 시험하였다. 각각의 경우마다 흡착 수율은 다양하지만, 흡착 능력은 모든 경우에 있어 30%(0.
위한 전단부위가 포함된다. 본 연구에서는 고체상 재접힘의 수율 향상을 위하여 6개의 lysine과 절단부위인 factor Xa protease의 인식부위를 tagging하였다(6L10E5A). 이것은 poly-lysine의 강한 양이온성을 이용하여 양이온 교환수지에 대한 친화력을 향상시키기 위함이다.
여섯 개의 lysine 잔기들은 재접힘 공정 후에 factor Xa로절단반응을 시킨 후 이온교환 칼럼으로 미반응 융합단백질, 절단된 융합단백질 그리고 lysine 잔기로 각각 용출시 분리하고자 한다.
또한 흡착능력은 이온강도에 영향을 받지 않았다(50, 100, 200, 300 and 400 mM이 시험 되었다). 융합단백질이 양전하와 음전하를 둘다 가지고 있는 것을 감안하면서, pH 7.0에서 같은 부피의 CM-Sepharose와 DEAE- Sepharose를 혼합한 resin을 시험해봤다. 그러나 흡착 수율은 여전히 40% 이하였다.
5)보다 훨씬 큰 domain을 가지고 있고 융합단백질의 중요한 전기적 힘을 나타내므로 음이온 교환수지보다 양이온 교환수지가 선택되었다. 이는 angiogenin 이 분자량이 크고 또한 pl 값이 매우 높기 때문에 이온교환수지의 흡착능을 높이기 위해서 양이온 교환수지를 선택하였다. 6L10E5A 내포체를 다양한 pH (6, 7, 8, 9, 10)에서 여러가지 resin(CM~Sepharose, Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, and heparin- Sepharose)에 적용하였다.
이번 연구에서 융합단백질(E5A)은 E. 卽〃에서 내포체 형태로 발현시켰고 여러 전통적인 재생공정을 적용해 보았다. 기존의 희석과 투석에 의한 재접힘공정은 단백질간 상호작용에 의한 응집현상으로 재접힘 수율이 4.
용출물에서 재접힘 된 6L10E5A의 RNase 생활성은 tRNA 분석법을 사용하여 측정하였다(4). 재접힘 수율은 칼럼 용출물 내의 6L10E5A의 질량을 용액화된 내포체의 질량으로 나누어 계산하였다.
이 과정에서 흡착된 융합단백질은 resin표면에 부착된 상태에서 고체상 재접힘 되었다. 재접힘후 0~2 M NaCl 농도에서 25분 동안 선형적인 기울기를 가지는 용출 버퍼(50 mM sodium phosphate containning 2 M NaCl, pH 7.0)를 사용하여 단백질을 용출 하였다. Figure 1은 고체상 재접힘 절차와 조건들의 흐름도를 보여준다.
최적의 resin과 실험조건을 찾은 후에 충진된 칼럼(5 mL bed volume)에서 고체상 재접힘 공정을 수행하였다. Resin에 6L10E5A를 흡착한 후에 세척용액(50 mM sodium phosphate, pH 7.
대상 데이터
CM-Sepharose, Q-Sepharose, DEAE-Sepharose와 phenyl- Sepharose는 Amersham pharmacia Biotech(Uppsala Sweden) 에서 구입하였다. 이때 resin의 부피는 0.
본 연구에서는 EGF를 coding하는 유전자로서 hEGF발현벡터 pTE105를 사용하였고, human angiogenin의 유전자로서 human liver cDNA library로부터 얻은 angiogenin을 plasmid pRSET A에 cloning한 균주를 이용하였다. Plasmids pTEA의구조는 E.
이론/모형
5 mg 의 내포체를 1 mg/mL 농도로 용해된 내포체 용액을 loading 하였다. 내포체 용해액이 loading된 resin을 5분간 저속 교반하고 자연침강 시킨 후 상등액을 취하여 Bradford assay법에 의해 단백질의 농도를 측정하여 흡착량을 계산하였다.
Figure 1은 고체상 재접힘 절차와 조건들의 흐름도를 보여준다. 용출물에서 재접힘 된 6L10E5A의 RNase 생활성은 tRNA 분석법을 사용하여 측정하였다(4). 재접힘 수율은 칼럼 용출물 내의 6L10E5A의 질량을 용액화된 내포체의 질량으로 나누어 계산하였다.
E5A와 6L10E5A의 분자량은 21 kDa과 22 kDa 이다. 자세한 발효와 발현 과정은 논문에 제시된 방법을 따랐다< 10).
성능/효과
Poly-lysine이 tagging된 hEGF와 angiogenin(6L10E5A)의 융합단백질의 고체상 재접힘이 heparin-Sepharose column에서 수행되었을 때, untagging 단백질(E5A)의 기존의 액상 재접힘방법과 비교하여 재접힘 수율은 약 13배 정도 증가하였다. 게다가 poly-lysine tagging 된angiogenine heparin 에 친화도를 높여주므로 2.
이는 가장 큰 흡착 능력을 보였다. Poly-lysine이 붙어있지 않은 때의 흡착 수율은 약 38% 정도라는 사실에 주목하면, lysine이 붙어있을 때는 이온 상호작용을 증가시키기 때문에 heparhi의 흡착능력을 증대시킨다고 결론지을 수 있다. 다시 말하면 양이온 poly-lysine이 붙어있으면 pH 6에서 heparin에 대한 양이온 angiogenin의 고유의 친화도를 더 강하게 만든다.
첫째 단백질간에 상호작용을 구조적으로 피할 수 있기 때문에 응집현상을 최소화 할 수 있다. 둘째재접힘공정 중 상대적으로 높은 농도를 유지할 수 있다. 이것은 주어진 담체에 대해 단백질의 흡착능에 의존한다.
생활 성값은 고체상 재접힘된 6L10E5A가 생물학적 활성을 유지하고 있음을 보여준다. 또한 hEGF와 angiogenin을 각각 Western blots으로 발현정도를 확인되었다.
생활성은 다른 미생물로부터 정제된 angiogenin 대비 65%를 나타내었다. 생활 성값은 고체상 재접힘된 6L10E5A가 생물학적 활성을 유지하고 있음을 보여준다. 또한 hEGF와 angiogenin을 각각 Western blots으로 발현정도를 확인되었다.
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