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문제 정의
- 다음으로, 각각의 구조단백질이 infectious viral particle 생성에는 어떠한 영향을 끼치는 지를 분석하기 위해서 다음과 같은 실험을 수행하였다. 각각의 recombinant viral RNA가 transfection 된 세포에서 infectious viral particle이 생성되었다면, transfection 된 세포에서 얻어진 상증액에 infectious virion이 존재한다.
- 3B). 다음으로, 합성된 recombinant viral RNA로부터 바이러스 자가복제로 인해 단백질이 발현되는 지의 여부를 평가하였다. 이를 위해 recombinant viral RNA를 MDBK 세포에 transfection시킨 후, 10% polyacr ylamide gel electrophoresis# 이용하여 cell lysate의 모든 단백질을 분리하였으며, BVDV 바이러스에 특이적으로 반응하는 anti- NS3 단클론항체를 사용하여 western blot analysis를 수행하였다 (Fig.
- 더 나아가, 위에서 얻어진 실험결과를 토대로 바이러스의 구조단백질 모두가 제거된 viral replicon (NADLcIns-/pac//S)을 재조합하려고 하였다. 이를 위해서 각각의 구조단백질을 제거할 때 삽입한 Hind III를 이용하여 viral replion cDNA clone을 재료 및 방법에서 자세히 기술한 것과 같이 재조합하였다(Fig.
- 또한, BVDV의 경우 바이러스을 조직배양세포에 감염 시 cytopathogenicity를 나타내면서 세포를 사멸시키는 cyto- pathic NADL strain과, 사멸시키지 않는 noncytopathic NAD- Lclns- strain의 isogenic virus pair0]] 대한 infectious cDNA clone을 합성하는 데 성공함으로써, 이들 cDNA clone (pNAD- Lclns-와 pNADL)들을 토대로 다양한 종류의 포유동물세포 유전자 발현 system을 개발하고자 하였다. 특히, 이번 연구에서는 바이러스의 자가복제에 필요한 최소한의 genetic element를 가진 BVDV의 viral replicon을 사용하여, 원하는 유전자를 T7 RNA polymerase를 사용하여 in vitro transcription으로 얻은 RNA molecule로부터 발현을 시작하는 RNA-launched gene expression system으로 개발하려고 하였다.
- 이 연구에서 개발된 BVDV viral replicon이 permissive celF인 MDBK 세포이외에, 다른 non-permissive 세포에서도 원하는 유전자의 발현이 이루어지는 것을 알아보려고 하였다. 먼저 이 실험을 위해서 pac 유전자가 아닌 luciferase 유전자를 가진 recombinant viral replicon (NADLcIns-/7"c/ziS)을 Fig.
- 이 연구에서는 RNA 바이러스중에서 Flaviviridae family에 속하는 pestivirus의 BVDV를 이용하여 다양한 종류의 단백질을 여러 종류의 포유동물세포에서 원하는 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 개발하려고 하였다. 먼저, BVDV infectious cDNA molecular clone pNADLcIns-를 이용하여 puromycin 항생제에 저항성을 나타내는 pac 유전자를 바이러스의 genome상에 바이러스의 자가복제시 발현되도록 recombinant infectious cDNA clone pNADLcIns-/pac을 성공적으로 개발하였다(Fig.
- 재조합된 infectious cDNA molecular clone으로부터 바이러스의 자가복제시 삽입된 selective marker pac 유전자가 발현하는지의 여부를 분석하기 위해서 다음과 같은 실험을 하였다. 먼저 MDBK 세포를 각각 NADLcIns-^c 바이러스로 감염시킨 후 0.
- 또한, BVDV의 경우 바이러스을 조직배양세포에 감염 시 cytopathogenicity를 나타내면서 세포를 사멸시키는 cyto- pathic NADL strain과, 사멸시키지 않는 noncytopathic NAD- Lclns- strain의 isogenic virus pair0]] 대한 infectious cDNA clone을 합성하는 데 성공함으로써, 이들 cDNA clone (pNAD- Lclns-와 pNADL)들을 토대로 다양한 종류의 포유동물세포 유전자 발현 system을 개발하고자 하였다. 특히, 이번 연구에서는 바이러스의 자가복제에 필요한 최소한의 genetic element를 가진 BVDV의 viral replicon을 사용하여, 원하는 유전자를 T7 RNA polymerase를 사용하여 in vitro transcription으로 얻은 RNA molecule로부터 발현을 시작하는 RNA-launched gene expression system으로 개발하려고 하였다.
제안 방법
- 먼저 infectious cDNA clone으로부터 T7 RNA polymerase를 사용하여 in vitro transcription을 통해 합"성된 다량의 viral RNA 중 1 ug를 전기영동 후, ethidium bromide로 염색을 통해 확인하였다(Fig. IB). 합성된 1-2 ug의 viral RNA를 MDBK세포에 electroporation 방법으로 transfection시킨 후, 32P 방사선 동위 원소로 metabollically labelling된 viral RNA를 탐지하여 viral RNA의 자가복제 유무를 확인하였다(Fig.
- 다시 준비하였다. 2.5 pg-5 ug의 viral replicon RNA 와 준비된 세포를 섞은 다음 0.4-cm electroporation cuvette (Bio-Rad)에 옮긴 후 300 V (750V/cm)와 960 uF에서 계속 두 번 이ectroporation을 실시하였다. 이후, 세포들은 8 ml의 10% horse serum을 포함한 DMEM으로 옮겨 배 양하였다.
- Primary antibody로 decoration된 membrane^ HRP-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibody로 염색하였다. Decoration^ BVDV 바이러스 NS3 단백질은 ECL 반응을 사용하여 발현유무를 분석하였다.
- 사용하였다. Fig. 1A에 나타난 것과 같이, BVDV의자가복제 유무를 손쉽게 알기 위해서 selective marker인 puro mycin acetyltransferase (pac) 유전자를 바이러스가 복제할 때만 발현이 되도록 DNA 재조합 기술를 이용하여 재합성하였다. 재료 및 방법에 자세하게 설명한 것과 같이, 재합성시 Pac 단백질의 N-말단을 정확하게 발현시키기 위해서 세포의 ubiquitin (ubi)유전자를 pac 유전자의 5' 말단에 inframe으로 삽입하였다(Fig.
- Infectious cDNA clone pNADLcINs-/pac을 이용하여 BVDV 각각의 구조단백질(C, E0, El, E2)들을 PCR를 통해 in-frame deletion을 가진 recombinant cDNA clone을 합성하였다. PCR 반응 시 사용할 oligo primer들은 다음과 같다.
- Infectious cDNA clone에 삽입된 pac 유전자가 바이러스 자가복제 시 Pac 단백질의 발현유무를 알아보기 위해서 focus assay를 수행하였다(Fig. 2). 이 실험을 위해서 먼저 nep strain인 NAD-Leins-/pac 바이러스를 MDBK 세포에 감염후 0.
- Viral RNA로부터 translation된 결과 만들어진 바이러스 단백질의 발현유무를 분석하는 방법으로 viral replicon RNA의 자가복제 여부를 분석하였다. Transfection 이후 72 시간이 경과하였을때, transfbctiori된 세포의 cell lysate를 sample buffer를 이용하여 lysis시켰다.
- 먼저 PCR 증폭으로 cloning을 하여 염기서열를 확인하였다. PCR 증폭 단계에서 각각의 말단에 제한효소 자리 Sph I과 Sac I을 삽입하였으면, 최종적인 cloning 단계에서 이들 제한효소를 이용하여 infectious cDNA clone pNADLcIns.
- 12 시간이 경과한 이후, 10 ^.g/ml puromycin과 10% horse serum이 포함된 D-MEM으로 selection 을 하였다. Selection이 시작된지 3-4 일 경과하였을 때, 7.
- 5% overlay agar 를 덮었다. 감염후 72 시간이 경과한 다음, 감염된 세포를 고정 시키고, crystal violet으로 살아남은 세포들을 염색하였다(Fig. 2, 2). 실험결과, mock-infection^ 세포와 비교해 보았을 때, nep strain의 NADLcIns-/pac 바이러스가 감염된 세포에서 예상했던 대로 cytopathic effect는 전혀 나타나지 않았다(Fig.
- 1, 2). 개발된 full-length infectious cDNA clone을 토대로 바이러스의 자가복제에 필요하지 않는 유전자들을 제거하기 위해서 바이러스 자가복제에 필수적인 genetic element를 deletion analysis로 분석하였다. 분석결과, BVDV 바이러스의 구조단백질 capsid, E0, El, E2 단백질 모두가 자가복제에는 필요하지 않다는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 각각의 recombinant viral RNA가 transfection 된 세포에서 infectious viral particle이 생성되었다면, transfection 된 세포에서 얻어진 상증액에 infectious virion이 존재한다. 따라서, trausfbetion후 얻어진 조직배양액을 가지고 MDBK 세포를 감염시킨 후 puromycin으로 selection함으로써 infectious virion의 생성 여부를 분석하였다(Fig. 4B). 이 실험 결과 Fig.
- 1C). 또한, trans- fection된 MDBK 세포에서의 바이러스 단백질의 발현 여부를 분석하기 위해서 BVDV NS3 단백질에 특이하게 반응하는 anti-NS3 단클론항체를 이용하여 western blotting# 통해서 알 수 있었다(Fig. ID).
- 또한, 각각의 recombinant viral RNA 를 transfection^] 킨 MDBK 세포를 사용하여 삽입된 selected marked pac 유전자의 발현 여부를 분석하였다. 이 실험을 위해서 transfection된 MDBK 세포를 puromycin 항생제를 첨가하거나 또는 대조군으로 첨가하지 않고 관찰하였다(Fig.
- 개발하려고 하였다. 먼저, BVDV infectious cDNA molecular clone pNADLcIns-를 이용하여 puromycin 항생제에 저항성을 나타내는 pac 유전자를 바이러스의 genome상에 바이러스의 자가복제시 발현되도록 recombinant infectious cDNA clone pNADLcIns-/pac을 성공적으로 개발하였다(Fig. 1, 2). 개발된 full-length infectious cDNA clone을 토대로 바이러스의 자가복제에 필요하지 않는 유전자들을 제거하기 위해서 바이러스 자가복제에 필수적인 genetic element를 deletion analysis로 분석하였다.
- 바이러스의 E0 단백질의 유전자를 제거할 경우(pNADLcIns-/pac/△C), 5'-GAT CTC GAG TCC GGA TGC TAC AAT AGT-3, , 및 5'-GAT AAG CTT GTT CCA CTG TGT TAT GTT-3', 5'-GAT AAG CTT GGC AAG CAG CTC GGG ATA-3', 5'-GAT CTC GAG CAG CTG TTG TCA GCT CCA3를 사용하여 제거될 양쪽 부위들을 증폭하고, 새로운 HM III자리를 삽입하였다. 바이러스의 E1 단백질의 유전자를 제거할 경우(pNADLcIns-pac), 5'-GAT CTC GAG GGG CCC CTG CAA CTT TGA-3, , 및 5'-GAT AAG CTT TTT GCG ATC GAC ATC ACA-3', 5'-GAT AAG CTT GAG GTA CTA CTA CTT TCT-3', 5'-GAT CTC GAG GGC CGG TCC GTT CAG CAG3를 사용하여 제거될 양쪽 부위들을 증폭하고, 새로운 Hind III자리를 삽입하였다. 바이러스의 E2 단백질의 유전자를 제거할 경우(pNADLcIns-/pac/△E2), 5'- GAT CTC GAG CAG CTG AAG TAA TAC CAG-3', 및 5'- GAT AAG CTT GGC ATA CGA GAA TTC AGG-3', 5'-GAT AAG CTT TGG TTT GAC CTG GAG GTG-3', 5'-GAT CTC GAG CTT TAC GCT CTC CTC CCT3를 사용하여 제거될 양쪽 부위들을 증폭하고, 새로운 HM III자리를 삽입하였다.
- 바이러스의 E1 단백질의 유전자를 제거할 경우(pNADLcIns-pac), 5'-GAT CTC GAG GGG CCC CTG CAA CTT TGA-3, , 및 5'-GAT AAG CTT TTT GCG ATC GAC ATC ACA-3', 5'-GAT AAG CTT GAG GTA CTA CTA CTT TCT-3', 5'-GAT CTC GAG GGC CGG TCC GTT CAG CAG3를 사용하여 제거될 양쪽 부위들을 증폭하고, 새로운 Hind III자리를 삽입하였다. 바이러스의 E2 단백질의 유전자를 제거할 경우(pNADLcIns-/pac/△E2), 5'- GAT CTC GAG CAG CTG AAG TAA TAC CAG-3', 및 5'- GAT AAG CTT GGC ATA CGA GAA TTC AGG-3', 5'-GAT AAG CTT TGG TTT GAC CTG GAG GTG-3', 5'-GAT CTC GAG CTT TAC GCT CTC CTC CCT3를 사용하여 제거될 양쪽 부위들을 증폭하고, 새로운 HM III자리를 삽입하였다. 이렇게 증폭된 바이러스의 DNA 단편들은 일반적인 DNA 재조합 기술을 사용하여 pRS2 subcloning vector에서 염기서열을 확인한 후 pNADLcIns-의 infectious cDNA clone에 재조합하였다.
- 약 1 의 wild type 또는 recombinant cDNA plasmid를 Sda I 제한효소를 이용하여 절단함으로써 in vitro transcription시 필요한 run-off site를 만들었다. 이후, 제한효소 반응액은 200 ug/ ml proteinase K와 0.
- 있는 유전자들로 나눌 수 있다. 위 실험 결과 재조합된 pac selective marker를 가진 infectious cDNA clone을 이용하여 바이러스 구조단백질이 바이러스의 자가복제에 필수적인 지의 여부를 알기 위해서 각각의 구조단백질을 infectious cDNA clone상에서 각 단백질의 topology를 신중히 고려하여 제거하였다(Fig. 3A). 이렇게 재조합된 recombinant cDNA clone을 주형으로 사용하여 T7 RNA polymerase# 이용하여 재료 및 방법에 자세히 기술한 것과 같이 in vitro transcriptioir을 하여 다량의 recombinant viral RNA를 합성하였다(Fig.
- 제거된 바이러스의 염기서열 부위는 각 단백질의 topology를 신중히 고려하여 결정되었다. 위에서 바이러스의 각 구조단백질이 deletion된 네 가지의 viral replicon들과 함께, 바이러스의 구조단백질(C, E0, El, E2) 모두가 deletion된 viral replicon을 재조합하기 위해서 pNADLcIns-/pac/4C와 pNADLcIns-/pac/△E2의 in-fiame deletion 단계에서 새로이 삽입된 HM III 제한효소자리를 이용하여 pRS2 subcloning vector를 거쳐 pNADLcIns-/pac/△S (Fig. 5)라고 하는 viral replicon을 재조합하였다.
- 분리된 RNA는 70% ethanol를 사용하여 salt를 제거한 후, 20ul nuclease-free dHQ에 녹였다. 이 결과 합성된 RNA는 denaturing formalde-hyde-agarose gel를 사용하여 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다.
- virus (2)가 있다. 이 발현벡터 또한 infectious cDNA clone을 이용하여 구조단백질을 제거함으로써 개발되었다. 하지만, Sindbis virus의 경우, 바이러스의 자가복제시 발생하는 cytopathogenicity 때문에 경우에 따라서는 원하는 유전자의 기능연구에 적합하지 않다(2).
- 여부를 분석하였다. 이 실험을 위해서 transfection된 MDBK 세포를 puromycin 항생제를 첨가하거나 또는 대조군으로 첨가하지 않고 관찰하였다(Fig. 4A). Puromycin을 첨가하였을 경우, 항생제를 첨가하지 않았을 경우와 마찬가지로 mock- transfbctiori 된 세포를 비롯하여 wild type NADLcIns-/pac, NADLcIns-/pac/AC 및 NADLcIns-/pac qc/E0, NADLcIns-/pac/E2의 recombinant viral RNA가 transfec- tion된 세포들 모두 사멸하지 않고 잘 자라는 것을 알 수 있었다 (Fig.
- 5A). 이렇게 만들어진 viral replicon NADLcIns/pac/△S으로부터 in vitro transcription을 통해 viral RNA를 합성하였으며, 합성된 viral RNA의 자가복제 유무를 분석하기 위해서 MDBK 세포에 transfection시킨 후 pac gene의 발현을 puromycin selection으로 분석하였다(Fig. 5B). 실험결과, BVDV viral replicon RNA가 transfection된 세포는 puromycin이 첨가된 배양액에서 사멸하지 않고 colony를 형성하면서 자라는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 3A). 이렇게 재조합된 recombinant cDNA clone을 주형으로 사용하여 T7 RNA polymerase# 이용하여 재료 및 방법에 자세히 기술한 것과 같이 in vitro transcriptioir을 하여 다량의 recombinant viral RNA를 합성하였다(Fig. 3B). 다음으로, 합성된 recombinant viral RNA로부터 바이러스 자가복제로 인해 단백질이 발현되는 지의 여부를 평가하였다.
- 바이러스의 E2 단백질의 유전자를 제거할 경우(pNADLcIns-/pac/△E2), 5'- GAT CTC GAG CAG CTG AAG TAA TAC CAG-3', 및 5'- GAT AAG CTT GGC ATA CGA GAA TTC AGG-3', 5'-GAT AAG CTT TGG TTT GAC CTG GAG GTG-3', 5'-GAT CTC GAG CTT TAC GCT CTC CTC CCT3를 사용하여 제거될 양쪽 부위들을 증폭하고, 새로운 HM III자리를 삽입하였다. 이렇게 증폭된 바이러스의 DNA 단편들은 일반적인 DNA 재조합 기술을 사용하여 pRS2 subcloning vector에서 염기서열을 확인한 후 pNADLcIns-의 infectious cDNA clone에 재조합하였다. 이 결과 바이러스의 capsid, 및 EO, El, E2의 염기서열중에서 nt.
- 다음으로, 합성된 recombinant viral RNA로부터 바이러스 자가복제로 인해 단백질이 발현되는 지의 여부를 평가하였다. 이를 위해 recombinant viral RNA를 MDBK 세포에 transfection시킨 후, 10% polyacr ylamide gel electrophoresis# 이용하여 cell lysate의 모든 단백질을 분리하였으며, BVDV 바이러스에 특이적으로 반응하는 anti- NS3 단클론항체를 사용하여 western blot analysis를 수행하였다 (Fig. 3C). Western blot 결과, wild type NADLcIns-/pac과 마찬가지로 recombinant viral RNA NADLcIns-/pac 및 NADLc- Ins-^acZdEO, NADLcIns-/pac/△El, NADLcIns-4?<2c/4E2 모두 바이러스 NS3 단백질을 발현함을 알 수 있었다(Fig.
- 하였다. 이를 위해서 각각의 구조단백질을 제거할 때 삽입한 Hind III를 이용하여 viral replion cDNA clone을 재료 및 방법에서 자세히 기술한 것과 같이 재조합하였다(Fig. 5A). 이렇게 만들어진 viral replicon NADLcIns/pac/△S으로부터 in vitro transcription을 통해 viral RNA를 합성하였으며, 합성된 viral RNA의 자가복제 유무를 분석하기 위해서 MDBK 세포에 transfection시킨 후 pac gene의 발현을 puromycin selection으로 분석하였다(Fig.
- 1A에 나타난 것과 같이, BVDV의자가복제 유무를 손쉽게 알기 위해서 selective marker인 puro mycin acetyltransferase (pac) 유전자를 바이러스가 복제할 때만 발현이 되도록 DNA 재조합 기술를 이용하여 재합성하였다. 재료 및 방법에 자세하게 설명한 것과 같이, 재합성시 Pac 단백질의 N-말단을 정확하게 발현시키기 위해서 세포의 ubiquitin (ubi)유전자를 pac 유전자의 5' 말단에 inframe으로 삽입하였다(Fig. 1A) (19).
- Transfection 이후 72 시간이 경과하였을때, transfbctiori된 세포의 cell lysate를 sample buffer를 이용하여 lysis시켰다.전체단백질들을 SDS-polyacrylamide gel electropho- resis로 분리한 후, nitrocellulose membrane에 transfer한 다음, primary antibody로 mouse anti-NS3 단클론항체를 사용하여 nitrocellulose membrane을 decoration하였다. Primary antibody로 decoration된 membrane^ HRP-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibody로 염색하였다.
- IB). 합성된 1-2 ug의 viral RNA를 MDBK세포에 electroporation 방법으로 transfection시킨 후, 32P 방사선 동위 원소로 metabollically labelling된 viral RNA를 탐지하여 viral RNA의 자가복제 유무를 확인하였다(Fig. 1C). 또한, trans- fection된 MDBK 세포에서의 바이러스 단백질의 발현 여부를 분석하기 위해서 BVDV NS3 단백질에 특이하게 반응하는 anti-NS3 단클론항체를 이용하여 western blotting# 통해서 알 수 있었다(Fig.
- 합성된 viral repl icon RNA는 DOTAP lipofection reagent (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 를 사용하여 transfDction시키거나, capacitance extender# 가진 gene pulser (Bio-Rad, Hercules, US A)를 사용하여 electroporation 시킴으로써 인위적으로 MDBK, HeLa, 및 BHK 세포 내로 삽입시켰다.
대상 데이터
- BHK (hamster kidney cell) 세포는 10% fetal bovine serum 및 vitamine, L-glutamine, penicillin/streptomycin이 들어 있는 a-MEM 배지에 배양하였다. HeLa (human cervix cancer cell) 세포는 10% fetal bovine serum 과 penicillin/ streptomycin이 들어있는 D-MEM 배지에 배양하였다. 세포배양 시 사용한 모든 재료들은 Gibco BRL Life Tech.
- MDBK (bovine kidney cell) 세포는 10% horse serum 및 sodium pyruvate, penicillin/streptomycin0] 들어 있는 D-MEM 배지에 배양하였다. BHK (hamster kidney cell) 세포는 10% fetal bovine serum 및 vitamine, L-glutamine, penicillin/streptomycin이 들어 있는 a-MEM 배지에 배양하였다.
- 이 연구에서는 최근에 성공적으로 합성된 BVDV의 infectious cDNA molecular clone인 noncytopathic (nep) strain의 pNADL- cIns-(7)를 사용하였다. Fig.
- 최근에 성공적으로 합성된 BVLN 의 infectious cDNA molecular clone인 pNADLcIns- (7)을 이번 연구에 사용하였다. Infectious cDNA 이one pNADLcINs-/pac을 재합성하기 위해서 ubi-pac-EMCV IRES cassette를 pRS2 subclong vector0!] 먼저 PCR 증폭으로 cloning을 하여 염기서열를 확인하였다.
성능/효과
- 2, 1-2). Cytopathogenicity를 나타내지 않는 nep strain의 바이러스 자가복 제 유무는 BVDV 바이러스 항원에 특이하게 반응하는 antiBVDV antiserum (a49)을 사용한 immunostaining 실험 결과 알 수 있었다(Fig. 2, 3-4).
- 4A). Puromycin을 첨가하였을 경우, 항생제를 첨가하지 않았을 경우와 마찬가지로 mock- transfbctiori 된 세포를 비롯하여 wild type NADLcIns-/pac, NADLcIns-/pac/AC 및 NADLcIns-/pac qc/E0, NADLcIns-/pac/E2의 recombinant viral RNA가 transfec- tion된 세포들 모두 사멸하지 않고 잘 자라는 것을 알 수 있었다 (Fig. 4A). 따라서, Western blot 실험결과와 마찬가지로, 각 구조단백질을 제거하였을 경우에 viral RNA replication에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
- pac 유전자를 가진 infectious cDNA clone을 이용하여 BVDV 각각의 구조단백질을 deletion한 recombinant viral RNA는 replication-competent하다는 것을 transfection된 세포를 puromy cin 항생제로 selection함으로써 알 수 있었다(Fig. 1). 또한, transfection된 세포의 배양액을 이용하여 naive MDBK 세포를 다시 infection함으로써, capsid 뿐 만이 아니라 세 개의 바이러스당단백질(EO, El, E2) 모두 infectious viral particle 형성에 관여함을 알 수 있었다(Fig.
- 바이러스 감염 후 48 시간이 경과한 다음, 10 /ig/ml 농도의 puromycin0] 첨가된 배양액을 사용하여 3 일간 배양하였다. 그 결과, nep strain인 NADLcIns-/pac 바이러스가 감염된 세포는 puromycin 항생제에 저항성이 있는 세포들이 colony를 형성하면서 성장하였으며(Fig. 2, 6), 전혀 감염되지 않은 세포는 항생제에 의해서 사멸하였다(Fig. 2, 5). 따라서, 이 실험 결과로 infectious cDNA clone에 삽*입된 pac 유전자가 BVDV 바이 러스의 복제시 발현됨을 알 수 있었다.
- 이렇게 합성된 BVDV viral replicon은 유전자발현 벡터로써 pac 유전자 대신에 원하는 유전자를 삽입함으로써 가능하였다. 그 예로, 이 연구 결과에서 나타난 것과 같이 luciferase 유전자를 viral replicon에 삽입함으로써 삽입된 유전자의 발현정도를 시간 별로 정량적으로 분석할 수 있었다(Fig. 6). 또한, 이렇게 개발된 viral replicon은 BVDV의 permissive 세포인 MDBK 뿐 만 아니라, HeLa와 BHK 세포에서도 MDBK 세포에서와 같이 원하는 유전자를 발현할 수 있었다.
- 일 이상 장기간 발현을 원할 때는 적합하지 않다. 그 원인은 아직 알 수 없으나, 시간이 지남에 따라 바이러스의 자가복제가 감소함을 실험결과 알 수 있었다(data not shown). 이것은 BVDV를 포함한 positive sense 바이러스가 복제시 중간물질로 생성되는 double-stranded RNA 때문에 interferon과 같은 세포의 defense mechanism인 것으로 주즉된다(14, 15).
- 5B, 4). 대조군으로 puromycin을 첨가하지 않은 경우 mock- transffection된 세포(Fig. 5B, 1)와 viral replicon NADLcIns-/pac-transfection된 세포(Fig. 5B, 3) 모두 자라는 것을 알 수 있었다. 또한 예상했던 대로 mock-trasnfbction된 세포는 puromycin을 첨가했을 때 모두 사멸하는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 3, 4). 따라서, BVDV 바이러스의 구조단백질 모두를 pNADLcIns-/pac cDNA clone상에서 제거함으로써 pNADLcIns-/pac/△Sviral replicon을 성공적으로 합성하였다(Fig. 5). 이렇게 합성된 BVDV viral replicon은 유전자발현 벡터로써 pac 유전자 대신에 원하는 유전자를 삽입함으로써 가능하였다.
- 4A). 따라서, Western blot 실험결과와 마찬가지로, 각 구조단백질을 제거하였을 경우에 viral RNA replication에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
- 4B, 8, 9, 11, 12). 따라서, 바이러스 구조단백질 capsid 뿐만이 아니라, E0, El, E2 단백질 모두 infectious viral particle 생성에 필요하다는 것을 알 수 있었다.
- 2, 5). 따라서, 이 실험 결과로 infectious cDNA clone에 삽*입된 pac 유전자가 BVDV 바이 러스의 복제시 발현됨을 알 수 있었다.
- 6B). 따라서, 이 연구결과 개발된 BVDV의 viral replicon은 MDBK 및 HeLa, BHK 세포와 같은 포유동물 세포에서 다양한 종류의 단백 질 발현이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
- 5B, 3) 모두 자라는 것을 알 수 있었다. 또한 예상했던 대로 mock-trasnfbction된 세포는 puromycin을 첨가했을 때 모두 사멸하는 것을 알 수 있었다(Fig. 5B, 2).
- 1). 또한, transfection된 세포의 배양액을 이용하여 naive MDBK 세포를 다시 infection함으로써, capsid 뿐 만이 아니라 세 개의 바이러스당단백질(EO, El, E2) 모두 infectious viral particle 형성에 관여함을 알 수 있었다(Fig. 2). E0 단백질의 경우, 당단백질이 RNase 기능을 가지고 있다는 것은 알려져 있지만(13), 바이러스의 replication cycle중에서 어떠한 역할을 하는 지는 아직 밝혀진 바가 없다.
- 6). 또한, 이렇게 개발된 viral replicon은 BVDV의 permissive 세포인 MDBK 뿐 만 아니라, HeLa와 BHK 세포에서도 MDBK 세포에서와 같이 원하는 유전자를 발현할 수 있었다.
- 개발된 full-length infectious cDNA clone을 토대로 바이러스의 자가복제에 필요하지 않는 유전자들을 제거하기 위해서 바이러스 자가복제에 필수적인 genetic element를 deletion analysis로 분석하였다. 분석결과, BVDV 바이러스의 구조단백질 capsid, E0, El, E2 단백질 모두가 자가복제에는 필요하지 않다는 것을 알 수 있었다(Fig. 3, 4). 따라서, BVDV 바이러스의 구조단백질 모두를 pNADLcIns-/pac cDNA clone상에서 제거함으로써 pNADLcIns-/pac/△Sviral replicon을 성공적으로 합성하였다(Fig.
- 5B). 실험결과, BVDV viral replicon RNA가 transfection된 세포는 puromycin이 첨가된 배양액에서 사멸하지 않고 colony를 형성하면서 자라는 것을 알 수 있었다(Fig. 5B, 4). 대조군으로 puromycin을 첨가하지 않은 경우 mock- transffection된 세포(Fig.
- 2, 2). 실험결과, mock-infection^ 세포와 비교해 보았을 때, nep strain의 NADLcIns-/pac 바이러스가 감염된 세포에서 예상했던 대로 cytopathic effect는 전혀 나타나지 않았다(Fig. 2, 1-2). Cytopathogenicity를 나타내지 않는 nep strain의 바이러스 자가복 제 유무는 BVDV 바이러스 항원에 특이하게 반응하는 antiBVDV antiserum (a49)을 사용한 immunostaining 실험 결과 알 수 있었다(Fig.
- 4B). 이 실험 결과 Fig. 4B에서 나타난 것과 같이, wild type NADLcIns-z^tzc viral RNA를 trans- fection시킨 세포에서 얻어진 배양액을 다시 감염하였을 경우, 감염된 세포들이 항생제가 첨가된 배양액에서 사멸하지 않고 자라는 것을 알 수 있었다. 하지만, 각각의 바이러스 구조 단백질이 제거된 recombinant viral RNA가 transfection^ 세포에서 얻어진 배양액을 가지고 다시 감염하였을 경우, 감염된 세포가 자라지 않는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 이 연구결과 개발된 BVDV viral replies은 원하는 단백질을 일시적으로 발현하는 transient expression에는 적합하지만, 4-5 일 이상 장기간 발현을 원할 때는 적합하지 않다. 그 원인은 아직 알 수 없으나, 시간이 지남에 따라 바이러스의 자가복제가 감소함을 실험결과 알 수 있었다(data not shown).
후속연구
- 이것은 BVDV를 포함한 positive sense 바이러스가 복제시 중간물질로 생성되는 double-stranded RNA 때문에 interferon과 같은 세포의 defense mechanism인 것으로 주즉된다(14, 15). 따라서, BVDV의 viral replicon을 이용하여 원하는 단백질의 장기간 발현을 위한 stable expression vector의 개발을 위해서는 세포의 defense mechanism을 피할 수 있는 방법을 고안해야 할 것으로 생각된다.
- 하지만, Sindbis virus의 경우, 바이러스의 자가복제시 발생하는 cytopathogenicity 때문에 경우에 따라서는 원하는 유전자의 기능연구에 적합하지 않다(2). 이와는 달리, 이 연구결과 개발된 BVDV의 viral replicon을 유전자 발현벡터로 사용할 경우, 바이러스 자가복제로 인한 cytopathogenicity/]- 나타나지 않음으로 원하는 단백질의 기능연구 및 여러 단백질 간의 상호작용을 분석하는 데 적절하다고 판단된다.
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