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문제 정의
- 1. 본 연구를 통하여 제주 연안의 대표적 갯녹음 지역인 성산과 강정의 해양세균의 분포를 밝힘으로서 갯녹음 지역에서의 미생물 생태계에 대한 기초자료를 부분적으로나마 제시하였다. 성산의 갯녹음지역의 해수에서는 Pseudomonas 균주가 우세하게 존재하는 것으로 조사되었으며, 대표적인 균으로는 Pseudomonas mandeli와 Pseudomonas tolaasii (또는 Pseudo monas corrsgaM)였다.
- 1. The whitening sea areas of Ganjeong and Seongsan, Jeju-do marked in dotted line was used for analysis of bacterial communities in this study.
- 따라서, 이러한 갯녹음 지역에서 특정 환경에서 가장 빠르게 적응해서 생존해 나갈 수 있는 미생물의 생태계를 파악하는 것은 갯녹음 현상에 따른 해양생태계의 변화를 좀 더 이해하고 갯녹음의 해결책에 대한 방안을 도출시킬 수 있다는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다. 본 연구에서는 갯녹음의 현상을 이해하기 위한 노력의 일환으로, 갯녹음이 일어난 성산과 강정지역의 해수에 존재하는 세균군을 조사하여, 향후 갯녹음 표품의 세균군을 분석하는데 있어 기초자료를 얻기위해 수행하였다.
제안 방법
- 95°C 5 분간 변성 후 95°C, 1 분-55℃, 1 분-72℃ 1 분의 주기로 33 번 순환한 후 최종 72℃에서 10 분간 extension하였다. 1% agarose 젤에서 전기영동하여 예상되는 DNA 증폭산물을 확인하고, 16S rRNA clonal library를 만드는데 사용하였다. 기타 언급하지 않은 방법은 이미 알려진 방법(7)에 따라 수행하였다.
- 성산 및 강정에서 얻은 형질전환된 수 많은 clone중 각 25 개를 임의적으로 선별한 후 T7 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 DNA sequencing을 수행 하였다. DNA sequencing은 ABI 377 자동염기서열 분석기를 이용하였다. 기타, 언급하지 않은 방법은 Maniatis방법(9)에 따라 수행하였다.
- 다양한 해양 미생물로부터 기원되었을 것으로 생각되는 회수 된 PCR산물을 pGEM-T vector에 ligation한 후 E. coli JM109를 형질전환하였다. 성산 및 강정에서 얻은 형질전환된 수 많은 clone중 각 25 개를 임의적으로 선별한 후 T7 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 DNA sequencing을 수행 하였다.
- 2와 같은 장치를 이용하여 2 주일 동안 멸균된 슬라이드글라스를 해수에 위치시켜 여러 가지 부착물을 획득하였다. 또한 주기적으로 해수를 채취하여 4℃에 보관하고, 표품 채취의 마지막 날에 같은 지역에서 온 모든 표품(슬라이드글라스 부착물 및 해수)을 모아서 원심분리하여 모아진 표품을 세균군의 분석을 위한 시료로 사용하였다(Fig. 3). 준비된 해수를 포함하는 표품에서 나타나는 세균군의 분석은 Fig.
- 밝혀진 염기서열의 분석은 DNA star program과 GenBank의 blast search의 database를 이용하였다. 염기의 계통학적 관계를 밝히기 위하여, 이미 알려진 방법 (8)에 따라 Lasergene의 Me- galign program을 이용하여 분석하였으며, 이 때 Clustal method에 의해 수행하였다.
- coli JM109를 형질전환하였다. 성산 및 강정에서 얻은 형질전환된 수 많은 clone중 각 25 개를 임의적으로 선별한 후 T7 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 DNA sequencing을 수행 하였다. DNA sequencing은 ABI 377 자동염기서열 분석기를 이용하였다.
- 확인된 DNA를 10ml cesium chloride 용액에서 녹인 후 ethidium bromide# 첨가하고, 102, 000Xg에서 20 시간 동안 초원심분리하였다. 초원심분리 후, genomic DNA band를 회수하고, cesium chloride와 ethidium bromide를 제거하기 위하여 0.05 (Am membrane filter를 이용하여 30 분간 투석하였다. 투석 후 DNA액을 회수하고, 16S rRNA를 증폭하기 위한 표품으로 사용하였다.
- 해수의 수질분석은 해양환경공정시험방법(2)에 따라 수온, pH, 염분의 농도, 용존산소량(DO), 화학적산소요구량(COD), 부유물 질(SS)의 농도, 총질소량(암모니아성 질소, NH/-N; 아질산성질소, NO/-N; 질산성질소, NO3-N), 총인 (PO43-P) 농도 등을 조 사하였다.
대상 데이터
- 16S rRNA를 증폭하는데 27f와 1522r primer set와 함께, 다양한 농도(10 ng〜100 ng)의 DNA를 사용하였다. 95°C 5 분간 변성 후 95°C, 1 분-55℃, 1 분-72℃ 1 분의 주기로 33 번 순환한 후 최종 72℃에서 10 분간 extension하였다.
- 2. Several sterilized slide glasses were prepared and fixed as shown in panels A and B. Panels C and D show samples attached to a slide glass withdrawn from the whitening sea areas of Gangjeong and Seongsan, respectively after two-weeks of slide submergence.
- The percentage occurrence of a specific bacterial organism in both areas of Gangjeong and Seongsan was determined based on the num ber of appearance of a specific 16S rDNA nucleotide sequence of twenty five clones analyzed in this study.
- 본 실험을 위한 대상 해역은 갯녹음이 심하게 일어난 것으로 알려져 있는 성산과 강정의 두 지역의 해수를 사용하였다. 본 연구에서 사용할 표품은 해수의 운동에 의해 자연스럽게 이동되는 미생물을 얻기 위하여, Fig.
- 특히, 환경오염이 심한 토양이나 강 혹은 하천에서 우세하게 나타나는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서 사용한 성산의 해수표품은 폐수가 많이 흘러내리는 곳으로 심하게 갯녹음 현상이 일어난 곳에서 채취하였다. 따라서, Pseudomonas 균주의 우세한 분포는 갯녹음 지역 수질의 환경오염과 밀접한 관계가 있을 것으로 추정된다.
- 본 실험을 위한 대상 해역은 갯녹음이 심하게 일어난 것으로 알려져 있는 성산과 강정의 두 지역의 해수를 사용하였다. 본 연구에서 사용할 표품은 해수의 운동에 의해 자연스럽게 이동되는 미생물을 얻기 위하여, Fig. 2와 같은 장치를 이용하여 2 주일 동안 멸균된 슬라이드글라스를 해수에 위치시켜 여러 가지 부착물을 획득하였다. 또한 주기적으로 해수를 채취하여 4℃에 보관하고, 표품 채취의 마지막 날에 같은 지역에서 온 모든 표품(슬라이드글라스 부착물 및 해수)을 모아서 원심분리하여 모아진 표품을 세균군의 분석을 위한 시료로 사용하였다(Fig.
이론/모형
- 8)에서 두 번 세척한 후 핵산을 분리하는데 사용하였다. PhenoVchloroform 용출기법을 이용하여 DNA를 얻고 1% agarose 젤 전기영동법으로 DNA를 확인하였다. 확인된 DNA를 10ml cesium chloride 용액에서 녹인 후 ethidium bromide# 첨가하고, 102, 000Xg에서 20 시간 동안 초원심분리하였다.
- DNA sequencing은 ABI 377 자동염기서열 분석기를 이용하였다. 기타, 언급하지 않은 방법은 Maniatis방법(9)에 따라 수행하였다.
- 밝혀진 염기서열의 분석은 DNA star program과 GenBank의 blast search의 database를 이용하였다. 염기의 계통학적 관계를 밝히기 위하여, 이미 알려진 방법 (8)에 따라 Lasergene의 Me- galign program을 이용하여 분석하였으며, 이 때 Clustal method에 의해 수행하였다.
성능/효과
- 2. 강정지역에서는 Alcanivorax, Paracoccus, Damselae, Pseu domonas, Rhodovulum, Silicibacter, Sulfltobacter, Roseobacter 등 여러 세균의 분포가 확인되었으며, 기타 미동정된 다양한 균주의 발견은 이 지역의 세균상이 성산지역보다 다양하다는 사실을 보 여주었다.
- 3. 갯녹음 지역인 강정과 성산 해수의 8 월(표품 채집시기)의 수온, 염분의 농도, pH, 용존산소량은 매우 비슷한 것으로 조사 되어, 수온이나 염분의 농도, 또는 pH보다는 다른 원인에 의하여 두 갯녹음 지역에 분포하는 세균 군의 차이를 가져왔음을 제시 해 주었다.
- 4). Alcanivorax, Paracoccus, Damselae, Pseudomonas, Rhodovulum, Silicibacter, Sulfitobacter, Roseobacter 등의 분포가 확인되었다. Alcanivorax sp.
- 1). Fig. 2에서 보이는 것처럼, 본 연구를 위해 표품을 채집한 시기인 2001년 8월에, 두 지역에서 갯녹음 현상이 광범위하게 이루어지고 있음을 관찰할 수 있었다. 이들 갯녹음으로 인해 나타 나는 가장 큰 피해는 무엇보다도 해양생물 다양성의 감소이다.
- 강정 갯녹음 지역 해수의 세균 표품에서 얻어진 해수 DNA를 사용하여 얻어진 16S rRNA의 clone들에 대한 염기서열 분석을 통해 강정지역에서는 Pseudomonas^: 비롯한 다양한 세균의 분포가 확인되었다(Table 1 및 Fig. 4). Alcanivorax, Paracoccus, Damselae, Pseudomonas, Rhodovulum, Silicibacter, Sulfitobacter, Roseobacter 등의 분포가 확인되었다.
- 5). 그 다음으로, Pseudomonas mandelii로 약 24%, Pseudo monas extremorientalis가 4%의 빈도로 나타났다. 일반적으로 Pseudomonas는 다양한 환경에서 생존할 수 있는 능력을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
- 국립수산진흥원의 조사한 바에 따르면, 1999 년 현재, 제주지역의 연안어장의 약 20%가 이러한 갯녹음 현상으로 인하여 경제적 피해를 비롯한 여러 가지 문제를 야기하고 있는 것으로 알려져 있다(1). 그 중, 본 연구에서 조사한 강정지역을 중심으로 한 서귀포 지역 연안의 약 36%가, 성산, 표선을 비롯한 남제주군 연안 어장의 약 31%가 갯녹음으로 인한 심각한 피해를 보고 있는 것으로 나타났다(Fig. 1). Fig.
- 따라서, Pseudomonas 균주의 우세한 분포는 갯녹음 지역 수질의 환경오염과 밀접한 관계가 있을 것으로 추정된다. 두 지역 해수의 부유 물질농도(SS)는 성산지역에서 훨씬 높게 나타난 반면, 총질소량, 화학적 산소요구량(COD) 등은 약간의 차이는 있었으나 두 지역 세균 생태계의 차이를 가져올 만한 요인으로는 여겨지지 않았다 (Table 2). 따라서, 해수를 구성하는 조사된 요인 외에 다른 환경 요인이 세균분포상의 차이를 가져올 가능성도 있으며, 이의 확인을 위한 지속적인 연구가 필요하다고 사료된다.
- 본 연구에서 사용한 성산의 해수표품은 폐수가 많이 흘러내리는 곳으로 심하게 갯녹음 현상이 일어난 곳에서 채취하였다. 따라서, Pseudomonas 균주의 우세한 분포는 갯녹음 지역 수질의 환경오염과 밀접한 관계가 있을 것으로 추정된다. 두 지역 해수의 부유 물질농도(SS)는 성산지역에서 훨씬 높게 나타난 반면, 총질소량, 화학적 산소요구량(COD) 등은 약간의 차이는 있었으나 두 지역 세균 생태계의 차이를 가져올 만한 요인으로는 여겨지지 않았다 (Table 2).
- 성산의 갯녹음 지역 해수에서는 Pseudomonas 균주가 우세하게 존재하는 것으로 조사되었으며, 대표적인 균으로는 Pseudomonas tolaasii로 조사한 clone의 44%를 차지하였다(Fig.5). 그 다음으로, Pseudomonas mandelii로 약 24%, Pseudo monas extremorientalis가 4%의 빈도로 나타났다.
- 본 연구를 통하여 제주 연안의 대표적 갯녹음 지역인 성산과 강정의 해양세균의 분포를 밝힘으로서 갯녹음 지역에서의 미생물 생태계에 대한 기초자료를 부분적으로나마 제시하였다. 성산의 갯녹음지역의 해수에서는 Pseudomonas 균주가 우세하게 존재하는 것으로 조사되었으며, 대표적인 균으로는 Pseudomonas mandeli와 Pseudomonas tolaasii (또는 Pseudo monas corrsgaM)였다.
- Alcanivorax sp.와 가장 가까운 유연관관계를 보인 종이 약 20%로 가장 많이 나타났고 Pseudomonas 16%, Sulfitobacter 8%의 순으로 나타났다. 하지만, 약 48%의 clone이 동정되지 않아 이에 대한 자세한 분석의 필요성이 제기 되어졌다.
후속연구
- 4. 본 연구에서 이루어진 세균군의 분석은 여러 가지 제한적인 여건 때문에 각 지역에서 얻은 많은 16S rRNA clone 중 25 clone들을 임의적으로 선별하여, 그 clone들에 대한 분석을 기초로 하여 도출해낸 결과로 전체적인 한 생태계내의 세균의 분포를 설명하기에는 미흡한 점이 있음을 기억해 둘 필요가 있다. 그럼에도 불구하고, 본 연구에서 얻어진 결과는 처음으로 갯녹음 지역의 세균 분포에 대한 분석을 시도하여 갯녹음 지역의 세균 생태에 대한 자료를 얻어냄으로서, 그 의의가 크다 하겠다.
- 두 지역 해수의 부유 물질농도(SS)는 성산지역에서 훨씬 높게 나타난 반면, 총질소량, 화학적 산소요구량(COD) 등은 약간의 차이는 있었으나 두 지역 세균 생태계의 차이를 가져올 만한 요인으로는 여겨지지 않았다 (Table 2). 따라서, 해수를 구성하는 조사된 요인 외에 다른 환경 요인이 세균분포상의 차이를 가져올 가능성도 있으며, 이의 확인을 위한 지속적인 연구가 필요하다고 사료된다.
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