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문제 정의
- Salmonella typhimuriurrS 이용한 돌연변이원성 검증 감마선이 조사된 대상 생약재(황기, 백출, 승마)의 열수 추출물이 Salmonella typhimurium TA98과 TA100 균주의 복귀 돌연변이 집락 형성에 미치는 영향을조사하였다. 예비실험 결과 본 시 료들은 균주 생 장억 제를 거의 나타내 지 않음이 확인되 었다.
- 본 연구에서는 생약재의 가공 . 저장 및 유통을 위한 안전한 위 생화 기 술로 감마선 조사기 술의 적용 가능성을 검 토하기 위한 일환으로 감마선 조사 황기, 백출, 승마의 유전 독성 학적 안전성 을 검증하고자 하였다.
- 생물 산업적 이용 증대에 따라 생약재의 안전한 위생화 기술이 요구되고 있다. 본 연구에서는 생약재의 위 생화 기술로서 방사선 조사기법의 활용 가능성을 검토하기 위 하여 , 감마선을 조사한 생약재 3종에 대한 유전독성 학적 안전성을 평가하고자 하였다. 공시 재료는 오염유기체 완전 구제 선량인 10 kGy의 감마선을 조사시 킨 황기, 백출 및 승마로 하였으며 , 각각의 열수 추출물의 유전독성을 in vitro 시 험으로 평가하였다.
- 본 연구에서는 생약재의 가공 . 저장 및 유통을 위한 안전한 위 생화 기 술로 감마선 조사기 술의 적용 가능성을 검 토하기 위한 일환으로 감마선 조사 황기, 백출, 승마의 유전 독성 학적 안전성 을 검증하고자 하였다. 황기는 다년초로써 전국에 분포하고, 원기 부족, 다한증, 당뇨, 강장 등 생약 및 식품에 이용하며, 백출은 삽주의 뿌리로 위장염, 신경통 및 부종 등에 사용되고, 승마는 다년초 식물로 근경을 발한, 해열 및 두통 등에 사용하는 생약재이다(13).
제안 방법
- 유전독성 평가는 Salmonella typhimurium TA98 및 TA100 균주를 이용한 복귀 돌연변이 시험(Ames test)과 Chinese hamster ovary(CHO) 세포를 이용한 in vitro 소핵 유발시험으로 시행하였다. 각각의 시험은 S9 mix를 첨가한 대사 활성화 시스템과 첨가하지 않은 비활성화 시스템으로 구분하여 실시하였으며, 시료의 최고 처리 농도는 복귀돌연변이 시험에서는 5 mg/plate로, 소핵 유발시험 에서는 50%의 세 포증식 억 제를 나타내는 농도(1 mg/mL)로 하였다. 복귀 돌연변이 시험 결과 대사 활성화 및 비활성화의 경우 모두에서 각 시료에 의한 복귀변이 집락수의 증가를 인정할 수 없었으며, 각 용량단계에서 감마선 조사군과 비조사군 간의 차이도 볼 수 없었으므로 음성으로 판정하였다.
- 본 연구에서는 생약재의 위 생화 기술로서 방사선 조사기법의 활용 가능성을 검토하기 위 하여 , 감마선을 조사한 생약재 3종에 대한 유전독성 학적 안전성을 평가하고자 하였다. 공시 재료는 오염유기체 완전 구제 선량인 10 kGy의 감마선을 조사시 킨 황기, 백출 및 승마로 하였으며 , 각각의 열수 추출물의 유전독성을 in vitro 시 험으로 평가하였다. 유전독성 평가는 Salmonella typhimurium TA98 및 TA100 균주를 이용한 복귀 돌연변이 시험(Ames test)과 Chinese hamster ovary(CHO) 세포를 이용한 in vitro 소핵 유발시험으로 시행하였다.
- 직접법의 경우에는 곧바로(간접 법 의 경우에는 30분간 37℃에서 예비 배양한 후) his-tidine/biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 mL 가하고 3초간 vortex하여 minimal glucose agar plate 상에 부어 평판고화시 킨 후 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 복귀 변이 집 락을 계수하였다. 돌연변이 유발성의 판정은 원저의 제시에 따라 복귀 돌연변이 집 락수가 용매대조군의 2배 이상이면서 용량 의존성을 갖는 경우를 양성으로 하였다. 또한 직접법의 경우에는 4- nitro-a-phenylenediamine(NPD)와 sodium azide를, 간접법의 경우에는2-aminofhiorene(2-AF)을 양성대조물질로 하여 실험의 적합 여부를 판정하였다.
- 예비 실험에서 대상 시료인 황기 , 백출 승마의 열수 추출물은 CHO세포 배양에 고농도로 첨가하였을 때 세포증식 억제를 나타내었다. 따라서, 본 시험에서는 독성시험 기준에 따라50%의 세포증식 억제를 보인 1 mg/mL을 최고 농도로 하여 3단계 농도에서 각 시료에 의한 세포 분열 중유전독성 유발여부를 시험하였다. 각 시료별로 binucleated cells 내의 소핵유발에 대한 시험결과를 Table 4, 5, 및 6에 나타내었다.
- 돌연변이 유발성의 판정은 원저의 제시에 따라 복귀 돌연변이 집 락수가 용매대조군의 2배 이상이면서 용량 의존성을 갖는 경우를 양성으로 하였다. 또한 직접법의 경우에는 4- nitro-a-phenylenediamine(NPD)와 sodium azide를, 간접법의 경우에는2-aminofhiorene(2-AF)을 양성대조물질로 하여 실험의 적합 여부를 판정하였다.
- 물질대사를 활성화시키지 않는 직접법의 경우는 standard plate incorporation test星 S9 mix로 물질대사를 활성화시키는 간접법의 경우에는 top agar를 pouring하기 전에 균 배양액을 30분간 예비 배양한 후 plate에 도포하는 preincubation test로 시 행하였다. 시험관에 인산완충용액 0.
- 물질과 함께 첨가하고 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 hypotonic 용액 (75 mM KC1) 2 mL을 가하여 1분 30초간 세포를 팽윤시 킨 다음, 고정 액 (methanol: acetic acid, 3 :1과 6 : 1)으로 2회 고정시킨 후 공기 건조시켜 세포표본을 만들었다. 세포들의 핵을 염 색하기 위하여 3% Giemsa 염색액으로 17분간 염 색하고 건조한 후 광학현미 경으로 1000배에서 관찰하였다.
- 각각의 시험은 S9 mix를 첨가한 대사 활성화 시스템과 첨가하지 않은 비활성화 시스템으로 구분하여 실시하였으며, 시료의 최고 처리 농도는 복귀돌연변이 시험에서는 5 mg/plate로, 소핵 유발시험 에서는 50%의 세 포증식 억 제를 나타내는 농도(1 mg/mL)로 하였다. 복귀 돌연변이 시험 결과 대사 활성화 및 비활성화의 경우 모두에서 각 시료에 의한 복귀변이 집락수의 증가를 인정할 수 없었으며, 각 용량단계에서 감마선 조사군과 비조사군 간의 차이도 볼 수 없었으므로 음성으로 판정하였다. 소핵 유발시험에서도 음성대조군 및 감마선 조사군과 비조사군 모두 각 용량 단계에서 세포 내에 생성된 소핵의 빈도가 3% 이하로 나타남에 따라, 시료에 의한 소핵의 유발을 인정할 수 없었으므로 음성으로 판정하였다.
- 예비실험 결과 본 시 료들은 균주 생 장억 제를 거의 나타내 지 않음이 확인되 었다. 본 실험에서는 의약품 등의 독성시험 기준에 따라 최고농도를 5mg/plate로 하여 5단계의 용량으로 시험 하였으며, 복귀돌연변이 집 락수에 대한 실험결과를 시료별로 Table 1, 2 및 3에 각각 나타내었다.
- 생약재의 방사선 조사는 한국원자력연-了■소에 소재하는 감마선 조사시설(Co 60, 10만 Ci)을 이용하여 실온에서 시간당 2 kGy의 선 량율로 10 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 하였다. 감마선 조사 및 비 조사 생 약재 30 g에 약 10배 량의 증류수를 가하여 약탕기에서 2시간씩 3회 열수 추출하고 여과와 원심분리를 거친 후 감압 농축하여 실험시료로 사용하였다.
- 배양액을 제거하고 hypotonic 용액 (75 mM KC1) 2 mL을 가하여 1분 30초간 세포를 팽윤시 킨 다음, 고정 액 (methanol: acetic acid, 3 :1과 6 : 1)으로 2회 고정시킨 후 공기 건조시켜 세포표본을 만들었다. 세포들의 핵을 염 색하기 위하여 3% Giemsa 염색액으로 17분간 염 색하고 건조한 후 광학현미 경으로 1000배에서 관찰하였다. 간접법 에서는 같은 방법으로 세포를 배양한 후, 시험물 질 과 20°-6 S9 mix를 첨가하여 6시 간동안 배 양한 다음, 신선한 배 지 로 교환하고 Cyt B를 첨가하여 18시간 동안 더 배양한 후 세포표본을 만들고 염색하였다.
- 복귀 돌연변이 시험 결과 대사 활성화 및 비활성화의 경우 모두에서 각 시료에 의한 복귀변이 집락수의 증가를 인정할 수 없었으며, 각 용량단계에서 감마선 조사군과 비조사군 간의 차이도 볼 수 없었으므로 음성으로 판정하였다. 소핵 유발시험에서도 음성대조군 및 감마선 조사군과 비조사군 모두 각 용량 단계에서 세포 내에 생성된 소핵의 빈도가 3% 이하로 나타남에 따라, 시료에 의한 소핵의 유발을 인정할 수 없었으므로 음성으로 판정하였다. 따라서 감마선이 조사된 각각의 시료는 직접 및 간접 돌연변이 원으로 작용하지 않으며 세포유전 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
- 시료는 증류수로 희석하였으며 시료첨가는 배양용량의 1/ 10로 하였고, 음성 대조물질로는 증류수를, 양성 대조물질로는 직접법에서는 mitomycin C(0.1 Hg/mL), 간접법에서는 DMSO에 녹인 benzo[a]pyrene(0.02 mg/mL)을 사용하였다.
- 시험방법은 직접법의 경우 CHO 세포 5X1O4개를 culture dish(0 60 mm) 에 파종하여 2일간 배 양한 후, Fenech와 Morley(18)의 cytokinesis-block(CB) method에 따라 세포질의 분열을 억제하는 물질인 cytochalasin B(Cyt-B; 3 Ug/rnL)를 시험 물질과 함께 첨가하고 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 hypotonic 용액 (75 mM KC1) 2 mL을 가하여 1분 30초간 세포를 팽윤시 킨 다음, 고정 액 (methanol: acetic acid, 3 :1과 6 : 1)으로 2회 고정시킨 후 공기 건조시켜 세포표본을 만들었다.
- 공시 재료는 오염유기체 완전 구제 선량인 10 kGy의 감마선을 조사시 킨 황기, 백출 및 승마로 하였으며 , 각각의 열수 추출물의 유전독성을 in vitro 시 험으로 평가하였다. 유전독성 평가는 Salmonella typhimurium TA98 및 TA100 균주를 이용한 복귀 돌연변이 시험(Ames test)과 Chinese hamster ovary(CHO) 세포를 이용한 in vitro 소핵 유발시험으로 시행하였다. 각각의 시험은 S9 mix를 첨가한 대사 활성화 시스템과 첨가하지 않은 비활성화 시스템으로 구분하여 실시하였으며, 시료의 최고 처리 농도는 복귀돌연변이 시험에서는 5 mg/plate로, 소핵 유발시험 에서는 50%의 세 포증식 억 제를 나타내는 농도(1 mg/mL)로 하였다.
- 1 mL을 넣어 가볍 게 vortex하였다. 직접법의 경우에는 곧바로(간접 법 의 경우에는 30분간 37℃에서 예비 배양한 후) his-tidine/biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 mL 가하고 3초간 vortex하여 minimal glucose agar plate 상에 부어 평판고화시 킨 후 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 복귀 변이 집 락을 계수하였다. 돌연변이 유발성의 판정은 원저의 제시에 따라 복귀 돌연변이 집 락수가 용매대조군의 2배 이상이면서 용량 의존성을 갖는 경우를 양성으로 하였다.
대상 데이터
- 하였다. 감마선 조사 및 비 조사 생 약재 30 g에 약 10배 량의 증류수를 가하여 약탕기에서 2시간씩 3회 열수 추출하고 여과와 원심분리를 거친 후 감압 농축하여 실험시료로 사용하였다.
- 생약재는 건조된 것으로 황기(Astragali Radix: the root of Astragalus merrtbranaceus Bunge, 한국 제 천산)、백출(Atrac tylodes Rhizoma: the root of Atractlodes japonica Koid zumi, 한국 영 천산) 및 승마(Cimicifugae Rhizoma: the root of Cimicifuga heracieifolia Komarov, 중국산)를 경동시장에 서구입하였다.
- 시험 에 사용된 동물세포는 Chinese hamster ovary(CHO) 세포주로 ATCC(Manassas, VA) 에서 구입하였으며, GIBCO BRL Inc.의 RPMI 1640 배 지 에 HEPES buffer 15 mM, fetal bovine serum 10%, penicillin-streptomycin 50 lig-50 unit/ mL을 첨가시킨 완전배지를 사용하여 배양하였다.
- 시험 에 사용된 박테 리 아 균주는 Salmonella typhimurium TA98과 TA100으로 Ames 교수로부터 직접 분양 받았으며, histidine 요구성 , deep rough( 液z) 특성 , UV에 대한 민감도(uurB 돌연변이 ), R-factor에 의한 ampicillin 또는 tetracycline 내성 등의 유전형질을 확인한 후 시험에 사용하였다.
이론/모형
- 소핵(MN)의 판독은 Almassy 등(19)의 기준에 따랐으며 세포핵 분열 후의 Cyt-B에 의한 세포질 분열 봉쇄로 생성된 1, 000개의 binucleated CB세포들 중 소핵을 갖는 세포를 계수하였다.
성능/효과
- 각 실험에서 음성 대조군의 복귀변이 집 락수는 TA98의 경우 15~24개, TA100의 경우 122~ 184로서 문헌(14, 15, 20)에 나타난 범위 (TA98의 경우 20~50개, TA100의 경우 120~ 200) 내에 포함되 었으며, 양성 대조 화합물에 의해 복귀 돌연변이 집락수가 현저히 증가하여 본 실험이 적합하게 수행되었음이 확인되었다.
- 57%)로서 문헌(23-25)에 나타난 수준이 었고, 양성 대조 화합물 처리 시 소핵 수가 5배 이상 현저히 증가하여 본 실험 이 적합하게 수행되었음을 확인할 수 있었다. 감마선 조사 황기의 열수 추출물에 대한 시험(Table 4)에서 대사 활성화시키지 않은 직접법 및 대사 활성화 간접법의 경우 모두, 적용농도인 1.0~0.1 mg/mL의 범위에서 2~3%의 소핵형 성 빈도를 나타냄으로써, 음성 대조군과 비교해 볼 때 시 료가소핵 형성을 유발시키지 않음을 알 수 있었다. 감마선 조사의 백출 및 승마의 열수 추출물에 대한 시험(Table 5, 6)에서도 적용 시험농도 범위에서 모두 거의 같은 결과를 나타내어, 각 시료가 소핵을 유발시키지 않음을 알 수 있었다.
- 결과적 으로, CHO세포를 이용한 in vitro 소핵 유발성 시 험에서 감마선조사 황기, 백출 및 승마의 열수 추출물이 음성으로 판정됨에 따라, 세포 핵 분열시 직접 또는 간접적으로 유전적 이상을 유발시 키지 않는 것으로 사료된다. 이 결과는 Ha 등 (20)이 CHL(Chinese hamster lung fibroblast) 세포를 이용한 염색체 이상 시험에서 방사선조사 백삼분말의 유전독성학적 안전성을 입증한 결과와 일치하였으며, Kang 등(21, 22)이 염색체 이상 시험과 설치류에서의 소핵시험 등으로 방사선 조사 쇠고기 및 닭고기의 유전독성학적 안전성을 입증한 보고와 일치하였다.
- 결과적으로 감마선이 조사된 황기, 백출, 승마의 열수 추출물은 복귀변이 집락수를 증가시키지 않았으므로 직접 및 간접 변이 원으로 작용하지 않는 것으로 판정되었다. 이 결과는 Sa/ monella typhimurium의 복귀돌연변이 시험에서 방사선 조사된 백삼분말(20), 쇠고기(21), 닭고기(22) 등의 유전독성학적 안전성을 입증한 보고와 일치하였匸]■.
- 소핵 유발시험에서도 음성대조군 및 감마선 조사군과 비조사군 모두 각 용량 단계에서 세포 내에 생성된 소핵의 빈도가 3% 이하로 나타남에 따라, 시료에 의한 소핵의 유발을 인정할 수 없었으므로 음성으로 판정하였다. 따라서 감마선이 조사된 각각의 시료는 직접 및 간접 돌연변이 원으로 작용하지 않으며 세포유전 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 향후, 생체 내 유전독성시험, 만성독성시험 및 생식독성시험 등의 추가적인 in vivo 실험이 행하여진다면 감마선 조사 생약재의 안전성을 보다 명확히 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.
- 예비 실험에서 대상 시료인 황기 , 백출 승마의 열수 추출물은 CHO세포 배양에 고농도로 첨가하였을 때 세포증식 억제를 나타내었다. 따라서, 본 시험에서는 독성시험 기준에 따라50%의 세포증식 억제를 보인 1 mg/mL을 최고 농도로 하여 3단계 농도에서 각 시료에 의한 세포 분열 중유전독성 유발여부를 시험하였다.
- 집락 형성에 미치는 영향을조사하였다. 예비실험 결과 본 시 료들은 균주 생 장억 제를 거의 나타내 지 않음이 확인되 었다. 본 실험에서는 의약품 등의 독성시험 기준에 따라 최고농도를 5mg/plate로 하여 5단계의 용량으로 시험 하였으며, 복귀돌연변이 집 락수에 대한 실험결과를 시료별로 Table 1, 2 및 3에 각각 나타내었다.
- 음성대조군의 경우 1,000개의 binucleated cells 중에 형성된 소 핵은 22±5.7개 (2.2±0.57%)로서 문헌(23-25)에 나타난 수준이 었고, 양성 대조 화합물 처리 시 소핵 수가 5배 이상 현저히 증가하여 본 실험 이 적합하게 수행되었음을 확인할 수 있었다. 감마선 조사 황기의 열수 추출물에 대한 시험(Table 4)에서 대사 활성화시키지 않은 직접법 및 대사 활성화 간접법의 경우 모두, 적용농도인 1.
- 이상에서 살펴본 바와 같이, 저자 등은 1차적으로 두 가지 in vitro 유전독성 시험 즉 Salmonella typhimurium을 이용한 돌연변이원성 시험과 포유류 배양세포를 이용한 소핵 유발성 시험을 시행하여 감마선 조사 황기, 백출 및 승마의 열수 추출물의 유전독성 학적 안전성을 확인하였다. 유전독성의 평가는 지표가 다른 여러가지 시험계에서 얻은 결과로부터 종합적으로 판정되어야 한다고 사료되므로, 이외의 시험관 내 시험 및생 체내 시험 이 추가로 시 행되어야 할 것으로 생각된다.
후속연구
- 생리활성물질을 함유하고 있는 천연소재의 식품 . 생물 산업적 활용의 증가에 따라 식품에 사용 가능한 천연 동 ・ 식물 소재들을 구체적으로 “사용가능원료(주원료, 부원료, 제한적 원료”와 "사용불가 원료로 식품공전에서 분류 등재함으로써 식품산업 계의 이용 근거가 되고 있으며 향후 사용 가능한 소재들이 추가될 전망이다. 이와 같이 생약재 등 천연소재들의 수요증가에 따라 원료 및 제품의 안전한 저장 .
- 유전독성의 평가는 지표가 다른 여러가지 시험계에서 얻은 결과로부터 종합적으로 판정되어야 한다고 사료되므로, 이외의 시험관 내 시험 및생 체내 시험 이 추가로 시 행되어야 할 것으로 생각된다. 나아가서 만성 독성 시험 및 생식독성 시험 등이 추가된다면 감마선 조사생 약재의 안전성을 명 확히 밝힐 수 있을 것으로 사료 된다.
- 유전독성 학적 안전성을 확인하였다. 유전독성의 평가는 지표가 다른 여러가지 시험계에서 얻은 결과로부터 종합적으로 판정되어야 한다고 사료되므로, 이외의 시험관 내 시험 및생 체내 시험 이 추가로 시 행되어야 할 것으로 생각된다. 나아가서 만성 독성 시험 및 생식독성 시험 등이 추가된다면 감마선 조사생 약재의 안전성을 명 확히 밝힐 수 있을 것으로 사료 된다.
- 따라서 감마선이 조사된 각각의 시료는 직접 및 간접 돌연변이 원으로 작용하지 않으며 세포유전 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 향후, 생체 내 유전독성시험, 만성독성시험 및 생식독성시험 등의 추가적인 in vivo 실험이 행하여진다면 감마선 조사 생약재의 안전성을 보다 명확히 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.
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