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문제 정의
- 하지만, 들깨잎에 병을 일으키는 Alteraria속균에 관한 보고는 국내외에서 찾아볼 수 없었다. 따라서, 본 논문에서는 Alteraria속균에 의한 들깨 잎마름병의 발생과 병원균의 형태 및 배양적 특성에 관해 보고하고자 한다.
제안 방법
- 공시균주 SD1 균주의 들깨에 대한 병원성을 검정하기 위하여 접종원으로 균사절편과 영양원을 첨가한 분생포자 현탁액을 사용하였다. 균사절편을 이용한 접종실험 에서는 직경 8mm의 균사절편을 잎뒷면에 부착하여 관찰하였다.
- 공시균주 SD1 균주의 정확한 동정을 위해 배지 종류와 온도별로 균총의 모양과 색깔을 관찰하였고, 특히 Alternaria 속의 가장 특징적인 분류기준인 분생포자의 크기와 모양, beak의 유무, 종격막과 횡격막 및 사선격막의 수를 중점적으로 관찰하였다.
- 공시한 SD1 균주의 분생포자병 및 분생포자의 형태를 조사하기 위하여 PDA평판배지상에서 25℃, 암조건으로 3 주간 배양한 후 형성된 분생포자병 및 분생포자를 광학현미경으로 관찰하였으며, 배지종류에 따른 배양적 특성 조사를 위해 PDA, CMA(Corn Meal Agar, Difco, USA), V8A(V-8 juice Agar, Campbell soup company, USA) 배 지에 각각 암조건 및 형광등과 자외선을 15일간 조사한 후 균총의 형태를 조사하였다. 그리고 pH가 균사 생장에 미치는 영향을 조사하기 위해 pH 4~pH 10까지 pH 1단위로 보정된 PDA 평판배지에 SD1 균주를 이식하고 25℃ 와 30℃의 항온기에 암조건으로 9일간 배양하여 균사 생장률을 조사하였다.
- 그리고 pH가 균사 생장에 미치는 영향을 조사하기 위해 pH 4~pH 10까지 pH 1단위로 보정된 PDA 평판배지에 SD1 균주를 이식하고 25℃ 와 30℃의 항온기에 암조건으로 9일간 배양하여 균사 생장률을 조사하였다. 균사생장과 분생포자 형성에 대한 적온 조사를 위해 PDA평판배지 중앙에 SD1 균주의 균사 절편(직경 8mm)을 이식하여 각각 0℃ 에서 40℃까지 5 ℃ 간격의 항온기에 9일동안 보관하면서 균총직경을 조사하였으며, 이식 후 16일 후에 혈구 계산기를 이용하여 분생포자 형성량을 조사하였다.
- 사용하였다. 균사절편을 이용한 접종실험 에서는 직경 8mm의 균사절편을 잎뒷면에 부착하여 관찰하였다. 영양원을 첨가한 분생포자 현탁액을 이용한 검정에서는 영양원으로 PDB, 10% 토마토쥬스 및 살균수를 공시하고 여기에 PDA평판배지에서 3주간 배양하여 형성된 SD1 균주의 분생포자를 ml당 109개의 농도로 조정하여 각각 들깨 잎에 분무 접종하였다.
- 형태를 조사하였다. 그리고 pH가 균사 생장에 미치는 영향을 조사하기 위해 pH 4~pH 10까지 pH 1단위로 보정된 PDA 평판배지에 SD1 균주를 이식하고 25℃ 와 30℃의 항온기에 암조건으로 9일간 배양하여 균사 생장률을 조사하였다. 균사생장과 분생포자 형성에 대한 적온 조사를 위해 PDA평판배지 중앙에 SD1 균주의 균사 절편(직경 8mm)을 이식하여 각각 0℃ 에서 40℃까지 5 ℃ 간격의 항온기에 9일동안 보관하면서 균총직경을 조사하였으며, 이식 후 16일 후에 혈구 계산기를 이용하여 분생포자 형성량을 조사하였다.
- 영양원을 첨가한 분생포자 현탁액을 이용한 검정에서는 영양원으로 PDB, 10% 토마토쥬스 및 살균수를 공시하고 여기에 PDA평판배지에서 3주간 배양하여 형성된 SD1 균주의 분생포자를 ml당 109개의 농도로 조정하여 각각 들깨 잎에 분무 접종하였다. 들깨 생육단계별 병원성 검정에서는 각 6, 8, 10엽기를 가진 들깨에 앞선 병원성 검정 실험에서 효과적인 것으로 확인된 영양원을 첨가한 분생포자 현탁액을 사용하여 접종하였다. 이상의 병원성 검정에 이용된 들깨는 하우스내 묘상에 파종하여 40일간 재배한 후 실험 1주 전 폿트에 옮겨 심은 것을 사용하였으며, 접종한 모든 들깨는 상대습도 90%이상, 25±2℃의 생육상에 보관하면서 접종 8일 후부터 발병율을 조사하였으며, 이상의 모든 실험은 5포트씩 5반복으로 2회 실시하여 평균하였다.
- 들깨 재배 비닐하우스 내에서 잎가장자리에 마름 증상을 보이는 병든 들깨잎을 채집하고 발병 부위에서 병원균을분리하였다. 병든 조직절편을 5.
- 영양원으로 PDB(Potato Dextrose Broth, Difco, USA),10% 토마토쥬스(가야, 한국) 및 살균수를 공시하고 여기에 PDA평판배지 25℃, 암조건에서 3주간 배양하여 형성된 SD1 균주의 분생포자를 ml당 109개 농도로 희석한 분생포자 현탁액을 Hole-slide glass에 각각 300㎕씩 넣어서 Cover glass를 덮었다. 이것을 Petri dish내 U자 유리막 대위에 놓고 현탁액을 마르지 않게 하기 위해 살균수를 적당량 넣고 뚜껑을 덮어 25 ℃ 항온기에 보관하면서 12hr, 24hr, 36hr 후에 각각 분생포자의 발아율과 발아관 길이를 조사하였다.
- 균사절편을 이용한 접종실험 에서는 직경 8mm의 균사절편을 잎뒷면에 부착하여 관찰하였다. 영양원을 첨가한 분생포자 현탁액을 이용한 검정에서는 영양원으로 PDB, 10% 토마토쥬스 및 살균수를 공시하고 여기에 PDA평판배지에서 3주간 배양하여 형성된 SD1 균주의 분생포자를 ml당 109개의 농도로 조정하여 각각 들깨 잎에 분무 접종하였다. 들깨 생육단계별 병원성 검정에서는 각 6, 8, 10엽기를 가진 들깨에 앞선 병원성 검정 실험에서 효과적인 것으로 확인된 영양원을 첨가한 분생포자 현탁액을 사용하여 접종하였다.
- glass를 덮었다. 이것을 Petri dish내 U자 유리막 대위에 놓고 현탁액을 마르지 않게 하기 위해 살균수를 적당량 넣고 뚜껑을 덮어 25 ℃ 항온기에 보관하면서 12hr, 24hr, 36hr 후에 각각 분생포자의 발아율과 발아관 길이를 조사하였다.
- 병해가 심하게 발생되었다. 이러한 병반에서 병원균을 분리하여 병원성이 강하고 분생포자 형성이 많은 SD1 균주를 선발하여 형태 및 배양적 특성을 조사하고 이를 동정하였다. 공시한 SD1 균주와 비슷한 형태를 보이는Alternaria, Ulodadium, Stemphyliume- 균과 비교한 결과 비교적 곧은 분생포자병에 많은 분생포자가 나뭇가지 모양으로 길게 쇄생하고 있으며 분생포자의 형태, 격막수와 길이로 보아 Alteraria속 균임이 명백하였다.
- 들깨 생육단계별 병원성 검정에서는 각 6, 8, 10엽기를 가진 들깨에 앞선 병원성 검정 실험에서 효과적인 것으로 확인된 영양원을 첨가한 분생포자 현탁액을 사용하여 접종하였다. 이상의 병원성 검정에 이용된 들깨는 하우스내 묘상에 파종하여 40일간 재배한 후 실험 1주 전 폿트에 옮겨 심은 것을 사용하였으며, 접종한 모든 들깨는 상대습도 90%이상, 25±2℃의 생육상에 보관하면서 접종 8일 후부터 발병율을 조사하였으며, 이상의 모든 실험은 5포트씩 5반복으로 2회 실시하여 평균하였다.
대상 데이터
- 부산시 강동 지역의 들깨 재배 하우스 내에서 자연 발생한 본병의 병징은 처음에 잎 끝 부분에 검은 점무늬가 발생하여 점차 양쪽 가장 자리로 진전이 되어 검게 변하고 마르는 증세가 나타났으며, 심할 경우에는 양 가장자리에서 잎 안쪽으로 진전이 되고 간혹 잎 전체가 검은색으로 변하여 말라죽고 뒤틀려서 줄기에 매달려 있을 경우도 있었다(Fig. 1A). 그러나, 잎 전체가 검게 마르기 전에 대부분 탈락하는 경우가 많았다.
- 여기에서 형성된 분생포자로 현탁액을 만들고 물한천평판배지에 부어서 배양한 후 각각의 분생포자에서 신장한 균사를 PDA 평판배지에 이식하고 배양하였는데 이 과정을 수회 반복하여 순수 분리하였다. 잎가장자리 마름증상으로부터 SD1 등 12 균주를 분리하여 7℃ 저온배양기에 보존하면서 실험에 사용하였는데 예비실험 결과 병원성이 강하고 분생포자 형성이 많은 SD1 균주를 이하의 모든 실험에 공시하였다.
성능/효과
- 명백하였다[11]. Alteraria속내에서 형태가 유사한 다른 종과의 균총형태, 색깔 그리고 분생포자병의 형태, 분생포자 형태와 크기, beak유무 등을 타 연구자들의 동정 결과[2, 5, 8, 11]와 비교 검토한 결과 거의 일치되어 Alternaria altemata로 동정되었다(Table 1).
- 온도에 따라 약간의 차이를 보였다. CMA 배지 상에서는 균사가 거의 발달하지 않았고 흑색가루을 뿌려놓은 것 같이 보였으며, V8A 배지에서는 진한 흑색의 균총이 발달하였으나, PDA 배지에서보다는 균총의 발달이 덜하였고 분생포자는 V8A 배지에서 가장 많이 형성되었다. PDA 배지상에서 분생포자병은 주로 곧은 형태였고, 분생포자는 대략 7~8개의 긴 쇄생으로 형성되었으며, 진한 갈색으로 서양배 모양이었으며, 2~8개의 횡격막, 1~5개의종격막과 1~3개의 사선격막이 관찰되었다.
- 공시균주의 들깨에 대한 병원성을 검정한 결과, 균사 절편 접종실험에서는 접종한 잎의 앞면에 원형의 검은 병 반이 형성되었으며, 습도가 높을시에는 검은색의 균사가 많이 관찰되었다(Fig. IB). 분생포자 현탁액에 첨가한 영양원을 달리한 접종 실험에서 살균수에서는 발병율이 0%, PDB에서는 60%, 10% 토마토쥬스에서는 100%를 보였다(Table 3).
- 이러한 병반에서 병원균을 분리하여 병원성이 강하고 분생포자 형성이 많은 SD1 균주를 선발하여 형태 및 배양적 특성을 조사하고 이를 동정하였다. 공시한 SD1 균주와 비슷한 형태를 보이는Alternaria, Ulodadium, Stemphyliume- 균과 비교한 결과 비교적 곧은 분생포자병에 많은 분생포자가 나뭇가지 모양으로 길게 쇄생하고 있으며 분생포자의 형태, 격막수와 길이로 보아 Alteraria속 균임이 명백하였다. SD1 균주의 형태 및 배양적 특성이 Grogan et al.
- 공시한 SD1 균주의 형태 및 배양적 특성을 조사한 결과 PDA 배지에서 균총의 형태는 가는 솜털모양의 흑회색을 띄었으며, 온도에 따라 약간의 차이를 보였다. CMA 배지 상에서는 균사가 거의 발달하지 않았고 흑색가루을 뿌려놓은 것 같이 보였으며, V8A 배지에서는 진한 흑색의 균총이 발달하였으나, PDA 배지에서보다는 균총의 발달이 덜하였고 분생포자는 V8A 배지에서 가장 많이 형성되었다.
- 균사생장에 대한 적온을 조사한 결과, o℃와 4(rc에서는균사 생육이 정지되었으며, 20~35℃에서 생육이 왕성하였는데 25℃에서 가장 높았다(Fig. 3). 분생포자 형성은 균사생장적온과는 달리 30℃에서 분생포자 형성수가 가장 많았는데, 5℃에서 30℃까지 온도가 높을수록 분생포자 형성도 많은 경향을 나타내었다(Fig.
- 균사생장에 미치는 pH의 영향을 pH 4~pH 10까지 보정된 PDA 평판배지에서 조사한 결과, pH 4에서는 균사생장율이 낮았으나 pH 5~pH 10 사이에는 큰 차이가 없었다.
- 이런 병반으로부터 병원성이 강하고 분생포자 형성이 많은 SD1 균주를 분리하여 병원균의 형태 및 배양적 특성을 조사한 결과 PDA 평판배지에서 25℃, 암조건으로 배양할 경우 균사생장이 가장 왕성하였으며, 분생포자 형성량은 V8A 평판배지에서 가장 많았다. 또한 SD1 균주의 균사생장 적온은 25℃ 분생포자 형성 적온은 30℃였으며, 분생포자 현탁액에 첨가한 영양원에 따른 분생포자 발아율과 발아관의 신장은 10% 토마토쥬스에서 가장 양호하였는데 24시간 후 발아율은 거의 100%였으며, 36 시간 후 발아관 길이는 535.2㎛로 PDB보다 1.4배정도 길었다. 또한 SD1 균주의 병원성을 검정한 결과 10% 토마토쥬스를 첨가한 분생포자 현탁액으로 접종할 경우 자연 발병된 병징과 동일하였으며 발병율도 100%로서 PDB 분생포자 현탁액에서는 60%, 살균수에서는 전혀 발병되지 않았다.
- 4배정도 길었다. 또한 SD1 균주의 병원성을 검정한 결과 10% 토마토쥬스를 첨가한 분생포자 현탁액으로 접종할 경우 자연 발병된 병징과 동일하였으며 발병율도 100%로서 PDB 분생포자 현탁액에서는 60%, 살균수에서는 전혀 발병되지 않았다. 본 균주는 균총 형태와 색깔, 광학현미경을 이용한 형태적 특성과 몇 가지 배지 등을 이용한 배양적 특성 및 병원성 검정 결과에 따라 Alteraria alternata로 동정되었으며, 들깨 잎마름병으로 명명하였다.
- 이는 여러 기주에서 병원성을 유지하고, 생장하는 동안 여러가지 변이가 일어나서 발아온도와 Pathotype 이 서로 달라진 것으로 생각된다. 병원성 검정 실험에서 10% 토마토쥬스를 이용한 분생포자 현탁액에서는 발병율이 100%, PDB에서는 60%였고 살균수에서는 전혀 발병되지 않았는데, 분생포자 발아율과 발아관 길이를 조사한 실험에서도 10% 토마토쥬스에서 분생포자 발아율이 거의 100%를 보였고, 발아관 길이는 36시간 후 PDB보다 1.4배, 살균수보다 무려 7배정도 길어 병원성 검정 실험에서와 일치되었다. 또한, A.
- 본 SD1 균주의 분생포자의 횡격막, 종격막 및 사선 격막을 관찰하고 분생포자형태, 착색상태 및 분생포자병의 형태 등을 Simmons의 분류법에 의 거 검토 한 결과 Alternaria 속임이 명백하였다[11]. Alteraria속내에서 형태가 유사한 다른 종과의 균총형태, 색깔 그리고 분생포자병의 형태, 분생포자 형태와 크기, beak유무 등을 타 연구자들의 동정 결과[2, 5, 8, 11]와 비교 검토한 결과 거의 일치되어 Alternaria altemata로 동정되었다(Table 1).
- 또한 SD1 균주의 병원성을 검정한 결과 10% 토마토쥬스를 첨가한 분생포자 현탁액으로 접종할 경우 자연 발병된 병징과 동일하였으며 발병율도 100%로서 PDB 분생포자 현탁액에서는 60%, 살균수에서는 전혀 발병되지 않았다. 본 균주는 균총 형태와 색깔, 광학현미경을 이용한 형태적 특성과 몇 가지 배지 등을 이용한 배양적 특성 및 병원성 검정 결과에 따라 Alteraria alternata로 동정되었으며, 들깨 잎마름병으로 명명하였다.
- 분생포자 현탁액에 첨가한 영양원 종류별 분생포자 발아율과 발아관 길이를 조사한 결과, 10% 토마토쥬스에서분생포자 발아율과 발아관의 신장이 가장 양호하였는데, 24시간 후 발아율은 100%로서 PDB 92.0% 보다 높았으며, 발아관 길이는 36시간 후 535.2㎛로서 PDB보다 1.4배 정도 길었다. 그러나 살균수에서는 발아율과 발아관의 신장이매우 저조하였다(Table 2).
- IB). 분생포자 현탁액에 첨가한 영양원을 달리한 접종 실험에서 살균수에서는 발병율이 0%, PDB에서는 60%, 10% 토마토쥬스에서는 100%를 보였다(Table 3).
- 3). 분생포자 형성은 균사생장적온과는 달리 30℃에서 분생포자 형성수가 가장 많았는데, 5℃에서 30℃까지 온도가 높을수록 분생포자 형성도 많은 경향을 나타내었다(Fig. 4).
- 발생되었다. 이런 병반으로부터 병원성이 강하고 분생포자 형성이 많은 SD1 균주를 분리하여 병원균의 형태 및 배양적 특성을 조사한 결과 PDA 평판배지에서 25℃, 암조건으로 배양할 경우 균사생장이 가장 왕성하였으며, 분생포자 형성량은 V8A 평판배지에서 가장 많았다. 또한 SD1 균주의 균사생장 적온은 25℃ 분생포자 형성 적온은 30℃였으며, 분생포자 현탁액에 첨가한 영양원에 따른 분생포자 발아율과 발아관의 신장은 10% 토마토쥬스에서 가장 양호하였는데 24시간 후 발아율은 거의 100%였으며, 36 시간 후 발아관 길이는 535.
후속연구
- Rotem(1994)에 따르면 Alteraria속균은 보통 적당한 온도 조건에서 1~3시간 안에 발아하여 부착기를 형성하고 주로 기공이나 상처를 통해 조직내부로 침입하는 것으로 알려져 있는데, 본 실험에서 나타난 병 징의 결과를 이와 관련해 생각해 볼 때, 공시한 SD1 균주는 분생포자가 기공보다는 잎 가장자리에 분포하는 수공을 통해주로 침입하므로서 가장자리부터 증상이 나타난 것으로 추측된다. 또한, 본 증상이 분생포자 현탁액에 첨가한 영양원에 의한 약해로 의심되어 분생포자를 첨가하지 않은 PDB나 10% 토마토쥬스만을 잎에 처리하여 여러 차례 검정하였는데 그 결과, 어떤 약해나 생리적인 병 증상도 나타나지 않아 이는 SD1 균주가 잎 가장자리 수공을 통한 침입에 활성이 높게 변이된 pathotype으로 생각되나 이는 추측일 뿐 이에 관한 좀더 확실한 연구가 수반되어야 할 것으로 생각된다.
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