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문제 정의
- 따라서 본 연구는 로타바이러스를 억제하는 생리 활성물질을 개발하고 식품첨가물로서의 적용 가능성을 확인하기 위한 기초자료로 이용하기 위하여 수행하였으며, 이에 많은 생리적 기능성을 갖고 있다고 알려진 키토산 유래 물질 중 수용성 키토산과 키토산 올리고당의 당 함량을 식품가공 공정 중 반드시 필요한 열처리 전 . 후 변화가 생기는지, 또한 어린이 바이러스성 설사증의 주요 원인인 human rotavirus (HRV)의 세포감염에 억제 효과를 나타내는지를 확인하였다.
- 키틴의 탈아세틸화로 얻어지는 화합물인 키토산과 키토 올리고당은 다양한 생리활성 기능을 나타내므로 생물의학적인 응용에 많은 관심이 집중되고 있다. 본 연구는 키토 올리고당과 수용성 키토산의 열처리 후 올리고당 함량의 변화와 어린이 바이러스성 설사를 유발하는 HRV(human rotavirus)의 MA-104 세포 감염에 억제 작용을 나타내는지 확인하기 위하여 수행하였다. 그 결과 열처리 후 비색법으로 측정한 올리고당의 함량은 수용성 키토산의 경우 62.
제안 방법
- 본 실험에 사용한 로타바이러스의 감염 가를 측정하기 위하여 HRV Wa와 S2를 1"~10, 까지 희석하여 0.7% agarose가 함유된 배지에 6일간 배양한 후 neutral red staining에 의해 원형으로 탈색된 부분의 plaque forming unit(PFU) 수를 관찰하였으며, 그 결과 Wa는 1.2x10。PFU/iM 이었고, S2는 3.0x10" PFU5이었다.
- )를 각각 1시간 동안 반응시켰다. AEC staining solution은 N, N-dimethylformamide (Sigma, No.D-4254) m(, 당 4mg의 3- amino-9-ethylcarbazole (Sigma, No.A-5754)이 첨가된 것과 0.05M sodium acetate buffer(pH 5.2), hydrogen peroxide(3:7:0.01)를 혼합하여 각 well 에 60以씩 첨가하였고 상온에서 10여분간 반응 시켜 염색한 후 현미경 (Olympus TE-3000, Japan)상에서 사진 촬영하였으며, inhibitor를 첨가하지 않은 대조 구와 비교하여 바이러스 감염률을 계산하였다.
- Inhibitor로 첨가된 sample과 바이러스를 제거한 뒤 10% formalin을 이용하여 세포를 고정하였으며 다시 1% triton X니 00을 각 well 에 60 以씩 넣었고 상온에서 4분간 정치 후, 로타바이러스에 특이적 단 클론 항체인 1B2와 2차 항체로 affinity purified antibody peroxidase HRP goat anti-mouse(IgG)(Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD.)를 각각 1시간 동안 반응시켰다. AEC staining solution은 N, N-dimethylformamide (Sigma, No.
- 2N 탄산나트륨을 가하여 50皿로 만든 액 21戒과 혼합한 후 961C 에서 1시간 가열하고 흐르는 물에 냉각시켰다. 다시 96%(v/v) ethyl alcohol 20i戒을 가하고 p-dimet- hylaminobenzaldehyde 1.6g에 HC1 3m£ 그리고 96%(v/v) ethyl alcohol 30i戒을 가하여 만든액 2 皿을 가해서 혼합한 후 실온에서 2시간 방치한 다음에 530nm에서 흡광도를 5회 반복하여 측정하였다.
- 5i戒 넣어 5% CCh incubator에서 37 P 에서 1시간 동안 흡착시켰다. 바이러스 액을 제거하고 agarose와 무혈청 M199(x2)를 1:1로 혼합하여 각 well마다 4i戒씩 첨가하였고, agarose가 굳은 후에 5% CO2 incubator에서 37 P 에서 6일 동안 배양하였다. 배양 후 neutr히 red(GIBCO, USA)로 7시간 동안 염색하여 fluorescent light box 위에서 plague 수를 계수하였다
- 바이러스 액을 제거하고 agarose와 무혈청 M199(x2)를 1:1로 혼합하여 각 well마다 4i戒씩 첨가하였고, agarose가 굳은 후에 5% CO2 incubator에서 37 P 에서 6일 동안 배양하였다. 배양 후 neutr히 red(GIBCO, USA)로 7시간 동안 염색하여 fluorescent light box 위에서 plague 수를 계수하였다
- 시료의 D-glucosamine 추출은 0.04g의 시료를 물에 녹여 중화시키고 glass filter(3G3)로 여과한 후 검액을 1師砒로 하였다. 이때 지방 성분 이 있는 시료는 탈지한 후 사용하였으며, 검액 10i现에 HCl 7祝과 H2O 31戒을 가하고 혼합 시 킨 후 5戒을 취하여 탈기밀봉 후 105P에서 24시간 반응으로 시료를 glucosamine으로 분해하였다.
- 04g의 시료를 물에 녹여 중화시키고 glass filter(3G3)로 여과한 후 검액을 1師砒로 하였다. 이때 지방 성분 이 있는 시료는 탈지한 후 사용하였으며, 검액 10i现에 HCl 7祝과 H2O 31戒을 가하고 혼합 시 킨 후 5戒을 취하여 탈기밀봉 후 105P에서 24시간 반응으로 시료를 glucosamine으로 분해하였다. 분해된 시료는 601 감압 하에 농축하여 HCl과 压0를 제거한 후 증류수에 녹여 사용하였다.
- 키토산 유래 물질의 열처리 후 HRV의 MA- 104 세포감염 억제실험에서는 처리1의 경우 63 P 에서 5~30분까지 5분 간격으로, 처리2의 경우 900에서 2~10분까지 2분 간격으로 시료를 취하여 이것을 HRV의 inhibitor로 이용하였으며 대조구로는 열처리하지 않은 표준물질을 이용하였고 그 결과는 Fig. 4과 5에 나타내었다.
- 키토올리고당 및 수용성 키토산의 항 로타 바이러스성을 확인하기 위하여 HRV Wa와 S2에 키토올리고당과 수용성 키토산을 각각 농도 1.0 ~ 0.001 %로 계단 희석하여 첨가하고 MA-104 세포에 감염시킨 후 키토올리고당과 수용성 키토산이 첨가되지 않은 대조 구와 비교하여 HRV 의 감염 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 Fig. 2과 3에 나타내었다.
- . 후 변화가 생기는지, 또한 어린이 바이러스성 설사증의 주요 원인인 human rotavirus (HRV)의 세포감염에 억제 효과를 나타내는지를 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 키토올리고당 및 수용성 키토산(Kunpgng Bio, Korea)은 한국보건산업진흥원으로부터 제공받아 사용하였으며, 올리고당의 정량에 사용된 D-glucosamine 표준품은 N-acethyl-D-glucosamine(Sigma Chem. Co., USA) 을 이용하였다.
- )에서 증식시킨 후 사용하였다. 세포의 증식과 유지는 M199에 불활성화시킨 7%의 Fetal bovine serum(FBS: GIBCO, USA)과 1% L-glutamin penicillin streptomycin(L-GPS: Irvine scientific. Santa Anna. CA.)을 혼합하여 75cm2 크기의 T-flask에서 매일 배지를 교환하면서 3~4일 후에 완전한 monolayer가 형성된 세포를 계대 배양하여 사용하였다.
- 실험에서 사용한 바이러스로는 표준 HRV Wa(Gl, P1A)와 S2(G2, P1B)를 Chiarini 등 (1983)의 방법에 의하여 3차례 계대배양 시킨 후 -20P에서 냉동 보관하며 사용하였다
- 아 Medium 199 Earl's salts(No. 9466 : Irvine scientific. Santa Anna. CA.)에서 증식시킨 후사용하였다. 세포의 증식과 유지는 M199에 불활성화시킨 7%의 Fetal bovine serum(FBS: GIBCO, USA) 과 1% L-glutamin penicillin
- 타바이러스의 감염 또는 증식을 위한 배양 세포로는 Macaccus Rhesus monkey kidney cell(MA-104 세포)로 미국 Stanford University 의과대학의 Dr. Greenberg Lab으로부터 분양받아 Medium 199 Earl's salts(No. 9466 : Irvine scientific. Santa Anna. CA.)에서 증식시킨 후 사용하였다. 세포의 증식과 유지는 M199에 불활성화시킨 7%의 Fetal bovine serum(FBS: GIBCO, USA)과 1% L-glutamin penicillin streptomycin(L-GPS: Irvine scientific.
데이터처리
- 흡광도를 이용한 열처리 전후 키토올리고당과 수용성 키토산의 올리고당 함량 변화를 Fig. 에 나타내었으며, 각각의 흡광도 최고치와 최저치를 제외한 3회에 해당하는 수치의 percent- age로 평균土표준편차를 표시하였다. 그 결과 열처리하기 전 키토올리고당은 59.
이론/모형
- HRV 의 역가분석은 Ruggeri 와 Greenberg (1991)의 방법에 의하여 6 well culture plate를 이용한 plaque assay로 수행하였다. 활성화시킨 HRV S2와 Wa를 1俨~ 까지 희석하여 MA- 104 세포의 monolayer가 형성된 6 well plate의 각 well에 0.
- Kaljot 등(1988)의 방법을 응용한 AEC staining method에 따라 실시하였으며, MA-104 세 포를 96 well plate에 monolayer가 형성되도록 배양하였고, 바이러스는 2회에 걸쳐 활성화시 켜 이용하였다. 각각의 시료는 1g을 멸균증류수 49血! 로 용해하여 0.
- 열처리에 의한 키토올리고당과 수용성 키토산의 올리고당 함량 변화를 확인하기 위하여 90℃ dry oven에서 1시간 동안 열처리한 후, 열처리 전후의 당 함량 변화를 UV spectro- photometer(UVIKON 933, Italy)를 이용한 비색법으로 측정하였다(식품공전, 2000).
성능/효과
- 본 연구는 키토 올리고당과 수용성 키토산의 열처리 후 올리고당 함량의 변화와 어린이 바이러스성 설사를 유발하는 HRV(human rotavirus)의 MA-104 세포 감염에 억제 작용을 나타내는지 확인하기 위하여 수행하였다. 그 결과 열처리 후 비색법으로 측정한 올리고당의 함량은 수용성 키토산의 경우 62.67 %에서 60.45%로 약 2% 정도, 키토 올리고당은 59.48%에서 54.31%로 약 5% 정도 감소하였다. 키토산 유래물질의 항로타바이러스성 탐색은 AEC staining으로 측정하였으며, 수용성 키토산 은 농도 0.
- 에 나타내었으며, 각각의 흡광도 최고치와 최저치를 제외한 3회에 해당하는 수치의 percent- age로 평균土표준편차를 표시하였다. 그 결과 열처리하기 전 키토올리고당은 59.48%이며 이를 90(:에서 I 시간 열처리한 것은 54.31%로 약 5% 정도 감소하였다 또 수용성 키토산은 62.67%이며 열처리한 것은 60.45%로 약 2% 정도 감소하였다. 키토올리고당과 수용성 키토산 모두 올리고당의 손실이 있었으나 수용성 키토산에서는 그 감소가 경미한 반면 키토올리고당에서는 상대적으로 감소량이 높았다.
- 결국 이는 Uchida 등(1988) 및 박 U999)이 보고한 키토산은 고분자 화합물보다는 가수분해가 다소 일어난 것(수용성 키토-산)이 더 높은 항균성을 나타내지만 가수분해가 진행되어 갈 수록항균력이 떨어진다고 발표한 결과와 일맥상통하였다. 본 로타바이러스 억제 실험에서도 HRV의 종류에 따라 다소간의 차이는 있으나 수용성 키토산이 키토올리고당보다 HRV 의 MA-104 세포감염을 억제하는 것으로 나타났다.
- 처리에 의한 수용성 키토산은 HRV의 감염억제능력에 차이를 보이지 않았다. 열처리하지 않은 0.25%의 수용성 키토산은 HRV S2에 대해서 91.89%의 억제 효과를 나타냈으며, 처리 1의 경우 90.69-92.71%, 처리2의 경우 90.77- 92.91%의 감염 억제율을 나타내었고 HRV Wa 는 처리1의 경우 88.71-92.01%, 처리2의 경우 88.69~91.75%의 감염 억제율을 보여 열처리흐｝ 지 않은 대조 구와 비교하여 유의차가 있다고 볼 수 없다. 따라서 수용성 키토산은 열처리가 HRV의 감염억제에 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.
- 키토 올리고당은 HRV의 세포 감염에 억제효과가 없었다. 열처리한 시료의 경우, 수용성 키토산과 키토올리고당 모두 열처리가 HRV 의 감염 억제에 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 따라서 중합도가 높은 수용성 키토산 은 열처리를 거치는 식품에 첨가하여도 그 기능이 크게 감소하지 않으므로 향후 식품첨가물로서 이용 가능성이 클 것으로 사료된다.
- 처리에 의한 수용성 키토산은 HRV의 감염억제능력에 차이를 보이지 않았다. 열처리하지 않은 0.
- 31%로 약 5% 정도 감소하였다. 키토산 유래물질의 항로타바이러스성 탐색은 AEC staining으로 측정하였으며, 수용성 키토산 은 농도 0.125% 이상에서 HRV S2의 세포 감염 에 있어 90% 이상의 감염 억제 효과가 있었으며, HRV Wa의 경우 89% 이상의 억제 효과가 있었다. 키토 올리고당은 HRV의 세포 감염에 억제효과가 없었다.
- 45%로 약 2% 정도 감소하였다. 키토올리고당과 수용성 키토산 모두 올리고당의 손실이 있었으나 수용성 키토산에서는 그 감소가 경미한 반면 키토올리고당에서는 상대적으로 감소량이 높았다. 이는 키토올리고당의 중합도가 수용성 키토산과 비교하여 상대적으로 낮기 때문인 것으로 사료된다.
후속연구
- 열처리한 시료의 경우, 수용성 키토산과 키토올리고당 모두 열처리가 HRV 의 감염 억제에 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 따라서 중합도가 높은 수용성 키토산 은 열처리를 거치는 식품에 첨가하여도 그 기능이 크게 감소하지 않으므로 향후 식품첨가물로서 이용 가능성이 클 것으로 사료된다.
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