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문제 정의
- 따라서 본 연구는 우리 나라에서 오래 전부터 사육되어 오던 민족 고유의 재래가축인 한국재래 산양의 유전적 능력개량에 분자유전학적 기법의 접목을 위해 주요 유단백질인 β-casein 유전자의 유전자형 및 유전자빈도를 추정하여 집단의 유전적 구조를 분석하고, 이 유전자의 염기서열 분석에 의한 분자유전학적 특성을 구명하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초자료를 얻고자 수행하였다.
- 본 연구는 한국 재래 산양 112두와 유산양인 Saanen종 7두의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하고, PCR-RFLP 방법에 의해 β-casein 유전자의 특성을 분석하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 자료로 제공하고자 실시하였다. 한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 β-casein의 유전 자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다.
제안 방법
- PCR 반응에 의해 증폭되어진 유전자좌의 다형성을 확인하기 위해 사용한 제한효소와 혼합액은 PCR 증폭산물 10㎕에 0.1㎕(10000U/㎖)의 Mse I과 2.0㎕의 incubation buffer 및 7.9㎕의 dH2O로 이루어진 혼합액(10㎕)을 가하여 65℃에서 5시간 동안 처리하였다.
- PCR 반응으로 증폭한 유전자좌 증폭산물은 1% agarose gel(Hoefer Scientific Instruments, USA)에서 20V로 약 40분간 전기영동하여 결과를 보았고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 PCR 증폭산물을 확인하였다. 증폭산물을 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편들의 다형성을 확인하기 위해서 9% polyacrylamide gel에서 150V로 약 1시간 30분 동안 전기영동하였다.
- 2pmol primer, 8㎕ terminator ready reaction mix(Bigdye terminator, Perkin Elmer), 그리고 20 ㎕의 증류수로 구성하였다. Sequencing reaction products을 얻기 위한 PCR 온도 조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분으로 25회 반복 되게 하였으며 얻어진 sequencing reaction products 는 80㎕ distilled water, 10㎕의 3M NaOAc(pH 4.6), 250㎕의 95% ethanol, 그리고 70% ethanol로 정제하였다. 전기영동 후 PCR products sequence 의 분석은 DNA sequencing analysis software (Perkin Elmer Co.
- 그리고 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하였으며 젤의 조성은 dH2O, 40% acrylamide stock solution(acrylamide : bis-acrylamide = 19 : 1), 10×TBE(tris base, boric acid, Na2EDTA․2H2O), TEMED, 10% ammonium persulfate 등을 혼합하여 만들었다. Sequencing reaction의 조성은 50ng/㎕ template, 3.2pmol primer, 8㎕ terminator ready reaction mix(Bigdye terminator, Perkin Elmer), 그리고 20 ㎕의 증류수로 구성하였다. Sequencing reaction products을 얻기 위한 PCR 온도 조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분으로 25회 반복 되게 하였으며 얻어진 sequencing reaction products 는 80㎕ distilled water, 10㎕의 3M NaOAc(pH 4.
- β-casein 유전자의 발현조절부위의 염기서열은 ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer(Perkin Elmer Co.)를 이용하여 direct automated sequencing에 의해 분석하였다. 그리고 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하였으며 젤의 조성은 dH2O, 40% acrylamide stock solution(acrylamide : bis-acrylamide = 19 : 1), 10×TBE(tris base, boric acid, Na2EDTA․2H2O), TEMED, 10% ammonium persulfate 등을 혼합하여 만들었다.
- β-casein 유전자좌의 다형성을 분석하기 위하여 PCR 반응에 의해 증폭되어진 481bp의 단편을 제한효소 Bal Ⅰ으로 절단한 후 그 다형성을 확인하기 위해 3% agarose gel에 전기영동한 결과는 Fig. 2에 나타낸 바와 같다. Fig.
- β-casein 유전자좌의 증폭은 GeneAmp PCR System 2400(Perkin Elmer Co., USA)을 이용하여 증폭하였으며, 반응 혼합액의 양은 genomic DNA를 포함하여 sample당 25㎕로 적정하였다. 반응 혼합액의 조성은 10mM Tris-Cl(pH 8.
- )를 이용하여 direct automated sequencing에 의해 분석하였다. 그리고 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하였으며 젤의 조성은 dH2O, 40% acrylamide stock solution(acrylamide : bis-acrylamide = 19 : 1), 10×TBE(tris base, boric acid, Na2EDTA․2H2O), TEMED, 10% ammonium persulfate 등을 혼합하여 만들었다. Sequencing reaction의 조성은 50ng/㎕ template, 3.
- , USA)을 이용하여 증폭하였으며, 반응 혼합액의 양은 genomic DNA를 포함하여 sample당 25㎕로 적정하였다. 반응 혼합액의 조성은 10mM Tris-Cl(pH 8.3), 50mM KCl, 15mM MgCl2, 0.001% gelatin으로 구성된 10×PCR buffer와 dNTP mixture(TaKaRa Co., Japan), 10pmol primer, 50ng/㎕ genomic DNA, 5unit Taq DNA polymerase(TaKaRa Co., Japan) 을 혼합하였다. β-casein 유전좌위의 증폭을 위해 DNA 변성은 94℃에서 1분, primer 결합은 54℃에서 1분, 그리고 DNA 신장은 72℃에서 1분으로 설정하여 35cycles을 실시하였다.
- 6), 250㎕의 95% ethanol, 그리고 70% ethanol로 정제하였다. 전기영동 후 PCR products sequence 의 분석은 DNA sequencing analysis software (Perkin Elmer Co.) 프로그램을 이용하였다.
- 증폭산물을 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편들의 다형성을 확인하기 위해서 9% polyacrylamide gel에서 150V로 약 1시간 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 다형성을 확인하였다.
- PCR 반응으로 증폭한 유전자좌 증폭산물은 1% agarose gel(Hoefer Scientific Instruments, USA)에서 20V로 약 40분간 전기영동하여 결과를 보았고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 PCR 증폭산물을 확인하였다. 증폭산물을 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편들의 다형성을 확인하기 위해서 9% polyacrylamide gel에서 150V로 약 1시간 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 다형성을 확인하였다.
대상 데이터
- 한국재래산양의 유단백질의 유전적 다형성을 구명하기 위해 본 연구에 이용된 공시축은 충남 당진군 대호지면에서 사육중인 재래산양 55두와 유산양(Saanen)은 7두를 공시재료로 이용하였다. Genomic DNA 추출을 위한 혈액의 채취는 재래산양의 경정맥으로부터 혈액 10㎖을 진공 채혈관(vacuumtainer with lithium heparin)에 채취하여 실험에 이용하였다.
- 한국재래산양의 유단백질의 유전적 다형성을 구명하기 위해 본 연구에 이용된 공시축은 충남 당진군 대호지면에서 사육중인 재래산양 55두와 유산양(Saanen)은 7두를 공시재료로 이용하였다. Genomic DNA 추출을 위한 혈액의 채취는 재래산양의 경정맥으로부터 혈액 10㎖을 진공 채혈관(vacuumtainer with lithium heparin)에 채취하여 실험에 이용하였다.
이론/모형
- Genomic DNA는 혈액으로부터 분리된 leukocyte pellets를 이용하여 Maniatis 등(1982)과 Gibco BRL manual methods에 의해 분리하였다.
- β-casein 유전자좌의 증폭을 위해 사용된 primer는 Pappalardo 등(1990)에 의해 보고된 exon 2와 intron5을 증폭시킬 수 있는 forward primer로 5'-GAT GAA ACC TGC ACT CCT-3'과 reverse primer로는 5'-CTT CTT GTT GGT CTG TTG CT-3'을 이용하였다.
- 본 실험에 의해 확인된 β-casein 유전자좌위에 있어서 유전자빈도의 산출은 Pirchner(1983)의 simple gene counting법에 따라 다음과 같이 추정하였다.
- 재래산양 혈액으로부터 추출한 DNA를 Pappalardo 등(1996)에 의해 보고된 primer로 GeneAmp PCR system 2400(Perkin Elmer, USA) 을 이용하였으며, 유전자좌위의 증폭을 위한 PCR 온도조건은 94℃/1분, 59℃/1분, 92℃/1분을 1 cycle로 총 35 cycle을 수행하여 얻어진 β-casein유 전자좌의 증폭산물을 1% agarose gel에 전기영동한 결과는 Fig.1에 나타낸 바와 같다
성능/효과
- Fig. 3에 나타낸 바와 같이 β-casein의 intron 1 및 2의 일부와 exon2에 대한 염기서열을 GeneBank에 등록된 산양의 염기서열상의 차이를 비교하여 보면 분석된 총 481개의 염기서열중 intron 1의 일부와 exon2는 GeneBank에 등록된 산양과 재래산양간에 는 염기서열상에 차이를 보이지 않았으나, intron 2에서는 241, 204, 274, 323, 225, 326, 327, 325, 329, 330, 352bp 위치의 총 11개의 염기서열에서 차이를 보여 GeneBank에 등록된 산양과 재래산양간에는 97.71% 의 높은 염기서열의 상동성을 보였다.
- 한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 β-casein의 유전 자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다. β-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, β-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다. 유전자형 빈도에 있어서는 한국재래산 양에서 β-casein AB 및 BB의 빈도는 각각 6.
- β-casein 유전자의 유전자빈도에 있어서는 한국 재래산양에서 β-casein A와 B 유전자빈도가 각각 0.286 및 0.714로 B 유전자빈도가 A유전자 빈도에 비하여 다소 높게 나타났다. 이는 Pappalardo 등 (1996)이 Alpine, Malta 및 Southern Italy 산양집단에서 β-casein A 유전자 빈도는 각각 0.
- Pappalardo 등(1996)은 산양에서 β-casein의 유전자형은 AA, AB 및 BB 이 있다고 보고하였으나 본 연구의 재래산양에 있어서는 β-casein AB 및 BB형만 출현되고 AA형은 출현되지 않았는데 이는 A유전자빈도가 아주 낮고 sample의 수가 적었기 때문인 것으로 사료된다. β-casein의 유전자형 분포에 있어서는 한국재래산양에서 AB형이 6.25%이었고, BB형이 93.75%로 BB유전자형이 아주 높게 나타났다.
- β-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, β-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다. 유전자형 빈도에 있어서는 한국재래산 양에서 β-casein AB 및 BB의 빈도는 각각 6.25 및 93.75%이었고, 유산양인 Saanen 종은 각각 57.14 및 42.86%이었다. 유전자빈도에 있어서는 한국재래산양의 β-casein A 및 B의 빈도가 각각 0.
- 한편 GeneBank에 등록된 산양의 325, 326, 327, 328, 329 및 330bp 위치에 A염기가 한국재래산양에서는 T로 치환되어 있음을 확인할 수 있었고, GeneBank에 등록된 산양의 352bp 위치에 염기가 결실되어 있었으나, 한국재래산양에서는 염기 A가 삽입되어 있었다. 이상의 결과에서 GeneBank에 등록된 β-casein의 염기서열과 한국재래산양간에 기능을 갖고있는 exon2 염기서열에는 차이가 없이 잘 보존되어 있었으며, intron2에서만 11개의 염기 서열에서 차이를 보여 97.71%의 높은 상동성을 보였는데 이는 같은 종내의 품종으로서의 유전적 유사성이 아주 높은 것으로 사료된다.
- 379로 보고한 결과와 비교하였을 때 한국재래산양의 경우 β-casein A 유전자빈도가 아주 낮은 빈도를 보여, 유산양인 Saanen종과 Alpine 종과는 차이를 보였지만 Malta 및 Southern Italy 산양집단에서의 보고와 유사한 유전자 빈도의 결과를 보였다. 이상의 결과에서 한국재래산양은 β -casein A 유전자 빈도가 유산양인 Saanen종 및 다른 염소 품종보다는 아주 낮은 빈도를 보이는 것으로 사료된다.
- 본 연구는 한국 재래 산양 112두와 유산양인 Saanen종 7두의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하고, PCR-RFLP 방법에 의해 β-casein 유전자의 특성을 분석하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 자료로 제공하고자 실시하였다. 한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 β-casein의 유전 자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다. β-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, β-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다.
- 한편 GeneBank에 등록된 산양의 325, 326, 327, 328, 329 및 330bp 위치에 A염기가 한국재래산양에서는 T로 치환되어 있음을 확인할 수 있었고, GeneBank에 등록된 산양의 352bp 위치에 염기가 결실되어 있었으나, 한국재래산양에서는 염기 A가 삽입되어 있었다. 이상의 결과에서 GeneBank에 등록된 β-casein의 염기서열과 한국재래산양간에 기능을 갖고있는 exon2 염기서열에는 차이가 없이 잘 보존되어 있었으며, intron2에서만 11개의 염기 서열에서 차이를 보여 97.
- 2에서 보는 바와 같이 M은 pUC18 MSP I(Sigma USA)이며, 본 실험에서 β-casein 유전자좌는 절단되지 않은 상태의 481bp A유전좌단편과 197bp와 284bp의 두 단편을 나타내는 B유전자 좌위의 단편을 보였으며 Pappalardo 등(1996)이 보고한 결과와 일치하였다. 한편 한국재래산양 및 유산양에서 모두 β-casein 유전자형이 AB형 및 BB형만의 유전좌형만을 보 였는데 이는 β-casein A유전자빈도가 아주 낮고 샘풀의 크기가 작아서 AA 유전자형은 출현되지 않은 것으로 판단된다. β-casein의 유전자형을 개체별로 살펴보면 lane 3, 4, 7 및 8은 β-casein AB 형으로 Bal I 처리시 절단되지 않은 상태의 481bp의 A유전자단편과 197bp 및 284bp의 두 단편을 나타내는 B유전자 단편을 보였으며, lane 1, 2, 5 및 6은 197bp와 284bp의 B유전자 단편을 갖는 BB형을 나타내었다.
후속연구
- 71%의 상동성을 보였다. 따라서 한국재래산양의 β-casein 유전자의 다형성과 염기서열 분석에 의한 분자유전학적 특성의 규명은 한국재래 산양의 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 및 응용 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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