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문제 정의
- 한편 마늘은 cytochr-ome P450 효소의 활성도를 변화시키며,항산화 작용도 가지고 있어 화학물질로 인한 독성 및 암발생 과정을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 Sprague-Dawley계 랫트를 대조 식이군과 마늘 식이군으로 나누어 각각 트리클 로로에틸렌(2,000 ㎎/㎏ body weight)과 사염 화탄소(400 ㎎/㎏ body weight)를 1회 경구 투여한 후 CYP2E1, 지질 과산화 및 간손상 지표인 AST, ALT 활성도와 조직병리학적 소견을 관찰하여 이들 물질로 인한 간독성에 대한 마늘의 보호 효과를 살펴보았다.
- 이에 본 연구에서는 랫트를 마늘 식이를 한 군과 대조 식이군으로 나누고 트리클로로 에틸렌과 사염화탄소를 1회 경구투여하여 간세포 마이크로좀의 cytochrome P450 효소와 지 질 과산화를 간독성지표 및 조직병리학적 소견과 함께 관찰하여 , 할로겐화 탄화수소의 간손상 및 마늘의 방어 효과 기전을 규명하고자 한다.
제안 방법
- Cytochrome P450은 Omura와 Sato [48]의 방법에 따라 측정하였다. 0.3 机의 마이크로좀에 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) 완충액을 5.7 ml 넣어 2개의 cuvette에 2 등분 한 후 분광광도계 (UVKON 930, Kontron Inst.. Switzerland)로 450 nm와 500 nm에서 흡광도를 측정한 후 일산화탄소를 1분간 bubbling (1 bubble/sec) 시키고 Na&Q를 소량 넣어 450 nm와 500 nm에서 흡광도 차이를 측정하여 몰흡광계수 91 mM」cm」를 이용하여 계산하였다.
- Western immunoblot 분석은 Amersham사의 rat cytochrome P450 2E1 ECL western blotting kit를 이용하여 chemiluminescence 방법으로 실시하였고, 여기서 나온 결과는 Image analysis software (Bio-profil, France)를 이용하여 대조군에서 나타난 band를 기준으로 반정 량화하였다.
- 5%의 마늘을 섞어 주고, 대조 식이군은 AIN-93M diet만 4주간 식이시켰다. 각 군은 다시 대조군, 트리클로로에틸렌 투여군과 사염화탄소 투여군으로 나누어 트리클로로에틸렌 투여군은 2,000 ㎎/㎏의 용량을 com oil에 섞어 ]회 경구 투여하였고, 사염화탄소 투여군은 400 ㎎/㎏의 용량을 com oil에 섞어 경구 투여하였으며, 대조군은 동일한 양의 com oil을 경구투여 하였다.
- 간세포 마이크로좀은 Lambert와 Freedman [46] 의 방법을 다소 수정하여 분리하였다. 즉 실험동물을 희생시킨 후 즉시 간을 적출하여 4 莒이하로 냉각된 생리적 식염수로 2-3회 씻어 혈구를 제거하고 조직을 잘게 썰은 후, 0.
- 5) 용액을 4 배 용량 첨 가하여, Potter-Elvehjem 조직 분쇄기로 2회 균질화하였다. 균질화 된 간 조직은 680 xg에서 10 분간 원심분리(Centrikon T-124, Kontron Inst., Switzerland) 하여 그 상층액을 취하고 이를 12,000 xg에서 10 분간 원심분리하여 post-lysosomal 상층액을 얻은 뒤 다시 100,000 Xg에서 60 분간 초고속원심분리 (Optima XL-100K Ultracentrifuge, Beckman, U.S.A.) 하였다. 이렇게 하여 얻은 microsomal pellet는 0.
- 이때 마이크로좀의 단백질 함량은 2。ag/ml 정도 되 게 하였다. 분리한 마이크로 좀은 0.5 ml 씩 분주하여 -80 P에 보관한 후 단백질 및 cytochrome P450정량과 면역항체 실험을 수행하였다.
- 실험동물은 마늘 식이군과 대조 식이군으로 나누어,마늘 식이군은 AIN(American Institute of Nutrition)-93M diet에 0.5%의 마늘을 섞어 주고, 대조 식이군은 AIN-93M diet만 4주간 식이시켰다. 각 군은 다시 대조군, 트리클로로에틸렌 투여군과 사염화탄소 투여군으로 나누어 트리클로로에틸렌 투여군은 2,000 ㎎/㎏의 용량을 com oil에 섞어 ]회 경구 투여하였고, 사염화탄소 투여군은 400 ㎎/㎏의 용량을 com oil에 섞어 경구 투여하였으며, 대조군은 동일한 양의 com oil을 경구투여 하였다.
- 1 湖에 첨가하여 95 °c oil bath에서 30분간 가열시킨 후 즉시 냉각시켜 반응을 정지시켰다. 이 용액에 0.5 成의 증류수와 2.5 诚의 n-butanol와 pyridine 혼합액(15:l, v/v)을 넣어 30 초간 잘 혼합한 후, 1000 xg에서 15 분간 원심분리하여, 상층액을 형광광도계(excitation: 515 nm; emmission: 553 nm, SFM 25, Kontron Inst.. Switzerland)로 측정하였다.
- 이것을 5 ㎛ 두께로 절편을 만들어 hematoxylin-eosin으로 염색하여 광학현미경으로 관찰 하였다.
- 의 방법을 이용하여 TBARS assay을 통하여 측정하였다. 이때 시료는 간조직에 10 배 부피의 1.15 % KC1 용액을 첨가하여 Potter-Elvehjem 조직분쇄기로 2 회 균질화하여 사용하였으며, 8.1% SDS 0.1 ml, 20 % acetic acid 0.75 诚와 0.8% thi아)arbituric acid 0.75 点를 시 료 0.1 湖에 첨가하여 95 °c oil bath에서 30분간 가열시킨 후 즉시 냉각시켜 반응을 정지시켰다. 이 용액에 0.
- [46] 의 방법을 다소 수정하여 분리하였다. 즉 실험동물을 희생시킨 후 즉시 간을 적출하여 4 莒이하로 냉각된 생리적 식염수로 2-3회 씻어 혈구를 제거하고 조직을 잘게 썰은 후, 0.25 M sucrose, 25 mM KC1, 5 mM Mg Ch를 함유한 Tris-HCl (pH 7.5) 용액을 4 배 용량 첨 가하여, Potter-Elvehjem 조직 분쇄기로 2회 균질화하였다. 균질화 된 간 조직은 680 xg에서 10 분간 원심분리(Centrikon T-124, Kontron Inst.
- 혈중 AST와 ALT 활성도는 Sigma사의 diagnostic kit를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 각각의 실험군은 6 마리로 하였다.
- 본 연구에 사용된 실험동물은 3 주령의 APF (animal pathogen free) Sprague-Dawley 계 수컷 랫트로, (주)샘타코부터 분양 받아 1 주일 전부터 온도 23±2 ℃, 습도 50±5%, 채광 12 시간인 사육장에서 사육하여 특별한 이상이 없음을 확인한 다음 실험에 사용하였다. 실험동물은 마늘 식이군과 대조 식이군으로 나누어,마늘 식이군은 AIN(American Institute of Nutrition)-93M diet에 0.
이론/모형
- 간 조직 내 지질 과산화는 Ohkawa 등 [50] 의 방법을 이용하여 TBARS assay을 통하여 측정하였다. 이때 시료는 간조직에 10 배 부피의 1.
- 간세포 마이크로좀에 대한 전기영동은 Laemmli 등 [49]의 방법에 의해서 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE, 12 %)을 만든 후 시료 20 始을 loading하여 실시한 후, Schleicher & Schuell사의 nitrocellulose transfer membrane (Protran®)을 마이크로좀 단백질이 분리된 gel 위에 올려 놓고 100 V에서 1시간 30 분 동안 nitrocellulose transfer membrane으로 이적시켰다.
성능/효과
- 043). ALT 활성도도 사염화탄소 투여시에는318.8±55.6 IU/L로 대조군의 21.3±1.1 IU/L보다 현저하게 증가하였으며(p=0.005), 마늘 식이를 시킨 군에서는 72.8± 20.7 IU/L로 사염화탄소로 인한 간 손상을 감소시키는 것으로 나타났다
- 지질 과산화는 대조군에서는 마늘 섭취로 인한 감소가 나타나지 않았으나, 사염화탄소 투여 시에는 대조 식이군에서 현저하게 증가한 반면 마늘 식이군에서는 대조군과 차이가 없어, 마늘이 사염화탄소에 의한 지질 과산화를 억제시키는 것으로 나타났다. AST 및 ALT 활성도는 사염화탄소 투여 시 대조 식이군에서는 현저하게 증가하였으나, 마늘 식이군에서는 대조 식이군 보다 활성도가 감소하였다. 조직병리학적 소견에서도 사염화탄소 투여시 대조 식이 군에서는 소엽중심대에 괴사와 광범위한 공포 성 병변이 나타났으나, 마늘 식이 군에서는 세포 괴사는 관찰되지 않았고 국소적인 apoptosis와 공포성 병변만이 소엽중심대에서 나타났다.
- 대조 식이군에서 트리클로로에틸렌 투여군은 대조군과 차이가 없었으나, 사염화탄소 투여군에서는 현저하게 감소하였다(p=0.005).
- 대조군 중 마늘 식이를 섭취한 군에서는 CYP2E1 이 감소하였고, 사염화탄소 투여 시 대조 식이군이나 마늘 식이군 모두에서 CYP2E1 이 현저하게 감소하였으나 트리클로로에틸렌 투여 시에는 대조군과 차이가 없었다. 지질 과산화는 대조군에서는 마늘 섭취로 인한 감소가 나타나지 않았으나, 사염화탄소 투여 시에는 대조 식이군에서 현저하게 증가한 반면 마늘 식이군에서는 대조군과 차이가 없어, 마늘이 사염화탄소에 의한 지질 과산화를 억제시키는 것으로 나타났다.
- 대조군에서 마늘 식이 여부에 따른 지질 과산화의 차이는 관찰되지 않았다. 사염화탄소 투여시 대조 식이군에서는 0.28±0.05 mM/g liver wet weight로 대조군의 0.14±0.01 mM/g liver wet weight보다 증가하였으며(p=0.027), 이러한 사염화탄소에 의한 지질 과산화의 증가는 마늘 식이군에서는나타나지 않아 0.15±0.02 mM/g liver wet weight로 대조군과 차이가 없었다 (p=0.689). 트리클로로에틸렌 투여시에는 지질과산화의 증가를 관찰할 수 없었다.
- 대조군에서 마늘 식이로 인한 AST 및 ALT의 변화는 나타나지 않았다. 사염화탄소 투여시에는 AST가 424.2±56.2 IU/L로 대조군의 103.3±10.3 보다 현저히 증가하였으며(p=0.005), 마늘 식이를 시킨 군에서는 208.3 ±45.3 IU/L로 대조군보다는 증가하였으나 (p=0.042) 사염화탄소만 투여한 군보다는 감소하였다 (p=0.043). ALT 활성도도 사염화탄소 투여시에는318.
- 사염화탄소나 트리클로로에틸렌의 간독성 기전 중 하나로 설명되고 있는 지질 과산화를 측정한 결과 대조군에서 마늘 섭취로 인한 TBARS의 감소는 관찰할 수 없었다. Park과 Choi [54]는 0.
- 5 %의 마늘 본 실험결과 트리클로로에틸렌을 투여하였을 때에는 대조 식이군과 마늘 식이 군 모두에서 TBARS는 감소하지 않았지만 사염화탄소를 투여하였을 때, 대조 식이 군에서는 TBARS가 증가하였고, 마늘 식이 군에서는 TBARS가 대조군과 차이를 보이지 않아, 마늘이 사염 화탄소로 인한 지질 과산화에 보호 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 위의 결과는 지질 과산화에 대한 마늘의 보호효과는 마늘 자체의 항산화 작용에 의한 것이라기 보다는 사염화탄소의 대사 효소인 CYP2E1 의 활성을 억제시켜 대사 활성화가 덜 일어나게 되고 따라서 산화 스트레스가 감소한 것이라는 것을 시사한다.
- 조직병리학적 소견에서도 사염화탄소 투여시 대조 식이 군에서는 소엽중심대에 괴사와 광범위한 공포 성 병변이 나타났으나, 마늘 식이 군에서는 세포 괴사는 관찰되지 않았고 국소적인 apoptosis와 공포성 병변만이 소엽중심대에서 나타났다. 이들 결과로부터 마늘은 CYP2E1 활성도 억제를 통하여 사염화탄소의 대사 활성화를 저해하여, 지질 과산화를 감소시켜, 사염화탄소로 인한 간독성에 보호효과를 보이는 것으로 생각된다.
- 이러한 사염화탄소에 의한 간독성은 마늘 식이 군에서는 현저하게 감소하여 AST 및 ALT 활성도가 대조군보다는 증가하였으나 사염화탄소를 투여한 대조 식이 군보다는 유의하게 낮게 나타났고, 조직병리학적 소견상에서도 보호효과가 뚜렷하여 간세포의 괴사는 보이지 않았고, 일부 간세포에 apoptosis와 국소적인 공포성 병변만이 관찰되었다. Wong 등 [66]은 CYP2E1 knockout mice에서는 사염화탄소로 인한 AST나 ALT의 증가 및 간세포 괴사와 같은 간독성이 나타나지 않는다고 보고하였는데, 마늘 식이를 통하여 CYP2E1 이 억제된 본 연구에서도 비슷한 결과가 나타나, 사염화탄소의 독성에 있어서 CYP2E1 이 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다.
- 이번 연구에서도 마늘을 섭취한 랫트에서 대조 식이군보다 CYP2E1의 함량이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 간마이크로좀 cytochrome P450은 마늘 섭취에 따른 감소를 나타내지 않았다. 트리클로로 에틸렌 투여 시에는 대조 식이 군이나 마늘 섭취군 모두에서 CYP2E1 함량의 대조군과 차이가 없었다.
- 차이가 없었다. 지질 과산화는 대조군에서는 마늘 섭취로 인한 감소가 나타나지 않았으나, 사염화탄소 투여 시에는 대조 식이군에서 현저하게 증가한 반면 마늘 식이군에서는 대조군과 차이가 없어, 마늘이 사염화탄소에 의한 지질 과산화를 억제시키는 것으로 나타났다. AST 및 ALT 활성도는 사염화탄소 투여 시 대조 식이군에서는 현저하게 증가하였으나, 마늘 식이군에서는 대조 식이군 보다 활성도가 감소하였다.
- Lee 등 [61]은 트리클로로에틸렌을 경구 투여하면, CYP2E1의 활성도는 증가하며, 투여 후 12 시간에 최고를 이룬 뒤 서서히 감소하여 24 시간에는 정상수준으로 돌아온다고 하였다. 투여 후 24 시간에서 관찰한 이번 연구 결과에서 CYP2E1 이 정상 수준인 것은 트리클로로에틸렌 투여 후 증가하였다가 다시 정상 수준으로 돌아온 것으로 추정된다. CYP2E1 은 aceton과 같은 기질과 결합하면 cAMP-의존 단백질 분해를 억제하여 CYP2E1이 유도되는 것으로 알려졌으며 [62], 트리클로로 에틸렌과 결합하였을 때도 이와 비슷한 효과가 있다고 하였다 [61], 트리클로로 에틸렌 투여군에서 마늘 식이에 의한 CYP2E1의 감소를 보이지 않은 것은 아마도 이러한 기전에 의해 CYP2E1의 분해가 억제되기 때문으로 생각된다.
- 트리클로로에틸렌 및 사염화탄소의 간독성에 대한 마늘의 보호 효과를 확인하기 위하여 AST와 ALT의 활성도와 조직병리학적 소견을 관찰한 결과, 2,000㎎/㎏ body weight 용량의 트리클로로에틸렌 투여에 따른 간독성은 관찰할 수 없었으나, 400 ㎎/㎏ body weight 용량의 사염화탄소 투여 시에는 AST와 ALT의 활성도가 현저히 증가하였고, 소엽 중심대 간세포에 괴사 및 광범위한 공포성 병변이 나타나, 간독성이 사염화탄소에서 훨씬 강력함을 확인할 수 있었다. 이러한 사염화탄소에 의한 간독성은 마늘 식이 군에서는 현저하게 감소하여 AST 및 ALT 활성도가 대조군보다는 증가하였으나 사염화탄소를 투여한 대조 식이 군보다는 유의하게 낮게 나타났고, 조직병리학적 소견상에서도 보호효과가 뚜렷하여 간세포의 괴사는 보이지 않았고, 일부 간세포에 apoptosis와 국소적인 공포성 병변만이 관찰되었다.
후속연구
- 하지만 CYP2E1의 발현 양상이 사염화탄소와는 다르게 나타나, 그 독성에 대한 마늘의 효과 또한 다를 수 있으리라 생각되며, 따라서 마늘이 장기간에 걸친 트리클로로 에틸렌 투여로 인한 간독성 및 발암성에 보호효과가 있는지를 연구하는 것은 트리클로로 에틸렌의 독성 및 발암성 기전을 연구하는데 있어 중요한 단서를 제공할 수 있으리라 생각된다. 아울러 마늘이 phase I 약물 대사효소에 미치는 영향과 이로 인한 화학물질 독성의 보호 효과에 대한 연구도 필요하리라 생각된다.
- 하지만 CYP2E1의 발현 양상이 사염화탄소와는 다르게 나타나, 그 독성에 대한 마늘의 효과 또한 다를 수 있으리라 생각되며, 따라서 마늘이 장기간에 걸친 트리클로로 에틸렌 투여로 인한 간독성 및 발암성에 보호효과가 있는지를 연구하는 것은 트리클로로 에틸렌의 독성 및 발암성 기전을 연구하는데 있어 중요한 단서를 제공할 수 있으리라 생각된다. 아울러 마늘이 phase I 약물 대사효소에 미치는 영향과 이로 인한 화학물질 독성의 보호 효과에 대한 연구도 필요하리라 생각된다.
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