Objectives : The level of 4-hydroxyproline (4-Hyp) in human urine was measured using high performance liquid chromatography (HPLC) with a fluorescence detector. This method is useful for medical examinations and investigating the radicals induced by physical, chemical, mental stresses. This method i...
Objectives : The level of 4-hydroxyproline (4-Hyp) in human urine was measured using high performance liquid chromatography (HPLC) with a fluorescence detector. This method is useful for medical examinations and investigating the radicals induced by physical, chemical, mental stresses. This method is superior to many published several methods in terms of its low cost and ability to analyze many samples. Methods : The urine from workers in a tire manufacturing company (22 male pre- and post-shift workers) and 18 office-workers as controls were analyzed. Data concerning age, the cumulative drinking amount and the cumulative smoking amount was collected with a questionnaire. The optimum applied amount of dansyl-Cl, the optimum reaction temperature and time, the recoveries and the optimum pH of the eluent and buffer were determined.4-Hyp from human urine was derivatized with dansyl-Cl (dimethylamino-naphthalene-1-sulfonyl chloride) after removing the a-amino acid by a treatment with phthalic dicarboxaldehyde (OPA) and cleaned with Bond Elut C18 column. The 4-Hyp derivatives were separated on a reversed phase column by gradient elution with a phosphate buffer (5 mmol, pH 8.0) and acetonitrile, and detected by fluorescence measurements at 340 nm (excitation) and 538 nm (emission). Results : The detection limit for the urinary free 4-Hyp was $0.364{\mu}mol/l$. The recovery rate of 4-Hyp was 99.7%, and the effective pH of the phosphate buffer and borate buffer were 3.0 and 8.0, respectively. From statistical analysis, age, drinking and smoking did not affect the urinary free 4-Hyp in both the controls and workers. The range of urinary 4-Hyp in the controls, pre-shift, and post-shift workers were 0.33-16.44, N.D-49.06, and $0.32-56.27{\mu}mol/l$. From the pared-sample t-test, the urinary 4-Hyp levels in post-shift workers ($11.82{\pm}6.73\;nmmol/mg\;Cre$) were 2-fold higher than in pre-shift workers ($5.36{\pm}5.53\;nmol;/mg\;Cre$) and controls ($4.91{\pm}4.89\;nmol;/mg\;Cre$). Conclusions : This method was developed with high sensitivity, accuracy, and precision. The present method was effectively applied to analyze the urinary free 4-Hyp in both controls and workers.
Objectives : The level of 4-hydroxyproline (4-Hyp) in human urine was measured using high performance liquid chromatography (HPLC) with a fluorescence detector. This method is useful for medical examinations and investigating the radicals induced by physical, chemical, mental stresses. This method is superior to many published several methods in terms of its low cost and ability to analyze many samples. Methods : The urine from workers in a tire manufacturing company (22 male pre- and post-shift workers) and 18 office-workers as controls were analyzed. Data concerning age, the cumulative drinking amount and the cumulative smoking amount was collected with a questionnaire. The optimum applied amount of dansyl-Cl, the optimum reaction temperature and time, the recoveries and the optimum pH of the eluent and buffer were determined.4-Hyp from human urine was derivatized with dansyl-Cl (dimethylamino-naphthalene-1-sulfonyl chloride) after removing the a-amino acid by a treatment with phthalic dicarboxaldehyde (OPA) and cleaned with Bond Elut C18 column. The 4-Hyp derivatives were separated on a reversed phase column by gradient elution with a phosphate buffer (5 mmol, pH 8.0) and acetonitrile, and detected by fluorescence measurements at 340 nm (excitation) and 538 nm (emission). Results : The detection limit for the urinary free 4-Hyp was $0.364{\mu}mol/l$. The recovery rate of 4-Hyp was 99.7%, and the effective pH of the phosphate buffer and borate buffer were 3.0 and 8.0, respectively. From statistical analysis, age, drinking and smoking did not affect the urinary free 4-Hyp in both the controls and workers. The range of urinary 4-Hyp in the controls, pre-shift, and post-shift workers were 0.33-16.44, N.D-49.06, and $0.32-56.27{\mu}mol/l$. From the pared-sample t-test, the urinary 4-Hyp levels in post-shift workers ($11.82{\pm}6.73\;nmmol/mg\;Cre$) were 2-fold higher than in pre-shift workers ($5.36{\pm}5.53\;nmol;/mg\;Cre$) and controls ($4.91{\pm}4.89\;nmol;/mg\;Cre$). Conclusions : This method was developed with high sensitivity, accuracy, and precision. The present method was effectively applied to analyze the urinary free 4-Hyp in both controls and workers.
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문제 정의
이에 본 연구는 질병진단, 노화, 스트레 스의 연구에 유용하게 사용될 수 있는 소 변 중 유리형 4-Hyp을 ORA와 dansyl chloride를 이용하여 유도체화시켜서. HPLC 형광검출기를 이용하여 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 한다
제안 방법
OPA를 소변 중 a-아미노산에 반응시 켜 Bond Elut Cl8 칼럼에서 흡착 제거 한 dansyl-Cl를 유리 형 4-Hyp에 유도 체시켜서 HPLC/형광검출기(Em: 340 nm, Ex: 538 飾)로 분석하는 방법을 개발 하였다. 개발된 분석방법을 이용하여 병 원 근로자와 타이어생산 근로자들의 소 변 중 유리형 4-Hyp의 분석가능 여부를 확인한 결과, 대조군(0.
노출군은 타이어생산 공장에서 근무하 는 남성 근로자(22명)에 대해서 작업주기 (4일) 중 4일째 되는 날 작업 전과 후의 소변을 채취하였고, 대조군은 병원에서 근무하는 일반 사무직 근로자(남성 8명, 여성 10명)의 소변 중 유리형 4-Hyp을 분석하였다. 그리고 대상자의 일반적 특 성을 확인하기 위해 연령, 음주 및 흡연 양에 대한 설문조사를 실시하였다.
노출군은 타이어생산 공장에서 근무하 는 남성 근로자(22명)에 대해서 작업주기 (4일) 중 4일째 되는 날 작업 전과 후의 소변을 채취하였고, 대조군은 병원에서 근무하는 일반 사무직 근로자(남성 8명, 여성 10명)의 소변 중 유리형 4-Hyp을 분석하였다. 그리고 대상자의 일반적 특 성을 확인하기 위해 연령, 음주 및 흡연 양에 대한 설문조사를 실시하였다.
이 를 위해서는 반응에 사용되는 dansyl-Cl 의 양과 반응온도 및 시간이 중요한 변수 로 작용하며 , 반응에 불필요한 다른 아미 노산을 제거하기 위한 C18 칼럼에서의 회수율도 검출한계에 영향을 미칠 수 있 으며, 이동상의 종류와 반응에 사용되는 완충액(borate buffer)의 산도(pH)가 분 석에 영향을 줄 수 있다. 따라서 열거한 변수들의 조건을 변화시켜가면서 최적의 분석조건을 선정하였다.
모든 시 약은 특급(HPLC grade)을 사 용하였으며 증류수는 18 姻이상의 전도 도를 갖는 탈이온수 제조장치(Milipore, Milford, MA, U.S.A.)를 사용하여 증류 수를 만들었다. 유도체 시 약은 dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride(dansyl-Cl, HPLC grade, Fluka)와 o-phthaldehyde(phthalic dicarboxaldehyde, aidrich)를 사용하였으며 표준 물질은 trans-4-hydroxy-L-proline (Aldrich)을 사용하였다.
분석 기기는 자동시료주입기(Waters 717)와 두 개의 펌프(Waters 510)를 연 결하여 gradient 조건을 갖추었으며 형광 검출기(Waters 474)를 장착하여 분석하 였다. 칼럼 은 ODS hypersil column(200 X4.
이동상(phosphate buffer, 5 mmol) 의 pH를 3.0으로 고정하고, borate buffer (0.1 md, pH 8.0) 1 讯을 첨가한 후 dansyl-Cl의 몰 비 (4-Hyp/dansyl-Cl, W/W)를 변화(0〜1,200배)시켜가면서 반응률을 관찰하였다. Hyp에 대한 dansyl-Cl의 몰 비(4-Hyp/dansyl-Cl, W/W)가 증가될수록 반응이 현저히 증 가하였으며 몰 비가 120배에서 반응률이 가장 높았으며, 240배 이상부터는 몰 비 가 증가함에 따라 조금씩 감소되었으나 큰 변화는 없었다 (Figure 1).
이에 본 연구는 질병진단, 노화, 스트레 스의 연구에 유용하게 사용될 수 있는 소 변 중 유리형 4-Hyp을 ORA와 dansyl chloride를 이용하여 유도체화시켜서. HPLC 형광검출기를 이용하여 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 한다
분석 기기는 자동시료주입기(Waters 717)와 두 개의 펌프(Waters 510)를 연 결하여 gradient 조건을 갖추었으며 형광 검출기(Waters 474)를 장착하여 분석하 였다. 칼럼 은 ODS hypersil column(200 X4.6 mtn; Hewlett Packard)*]] TSK Guardgel ODS-80Ts(15 X3.2 mm; Tosoh)를 연결하였으며 column oven-g- 장 착하여 일정온도(2¥C)를 유지하였다.
3 ml 의 유속으로 용출하여 1 说씩 5개의 시험 관에 포집하였다. 포집된 용액 1 说을 취하여 dansyl-Cl로 유도체시킨 후 20 网 를 HPLC로 분석하여 회수율을 관찰하 였다. OPA로 반응시킨 용액을 C18 칼럼 에 분당 0.
표준물질의 농도 범위 10,20,50,100, 200, 500 佝晰 I 에서 선형추세 방정식은 3.145, 절편-10.786(y=3.145x - 10.786, 1=0.9999)이 었으며, blank sample을 10 회 분석하여 mean값과 표준편차(2 SD) 를 구하여 LLD(Lower Limit of Detection, 0.267 “mol/ I )를 구하고 spiked sample을 10회 분석하여 BLD (Biological Limit of Detection, LLD + 2Sspk)를 구한 결과 0.364 卩碱 I 이었다 (Figure 2).
대상 데이터
유도체 시 약은 dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride(dansyl-Cl, HPLC grade, Fluka)와 o-phthaldehyde(phthalic dicarboxaldehyde, aidrich)를 사용하였으며 표준 물질은 trans-4-hydroxy-L-proline (Aldrich)을 사용하였다. 고체상흡착에 사용된 칼럼은 Bond Elut LC-18 (100 nw/cc, S니pelcoclean, U.S.A.)을 시■용하 였다.
)를 사용하여 증류 수를 만들었다. 유도체 시 약은 dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride(dansyl-Cl, HPLC grade, Fluka)와 o-phthaldehyde(phthalic dicarboxaldehyde, aidrich)를 사용하였으며 표준 물질은 trans-4-hydroxy-L-proline (Aldrich)을 사용하였다. 고체상흡착에 사용된 칼럼은 Bond Elut LC-18 (100 nw/cc, S니pelcoclean, U.
데이터처리
수집된 자료의 처리와 분석은 윈도우 용 SPSS(version 10.0)을 이용하였으며, 일반적 특성과의 상관성을 관찰하기 위 해 단순상관분석을 실시하였다.
성능/효과
여액과 초기 용출액(1 ")을 합한 용액 (1차 용출액)을 분석한 결과 99% 이상의 회수율을 얻었으며, 2차 용출액(2 ml), 3 차 용출액(3 机)에서는 각각 0.31%, 0.07%이었으며 4차 용출액(4 祖)부터는 검출되지 않았다 (Figure 3).
4-Hyp 농도 소변 중 유리형 4-Hyp에 대한 작업 전 과 작업 후에 대하여 대응표본 t-검정을실시한 결과 작업 전(5.36±5.53 nmol/mg Cre)보다 작업 후(11.82±16.73 nmol/mg Cre) 소변에서 약 2배 높았으며 (p=0.132), 대조군(4.91 土4.89 nmol/mg Cre)은 작업 전과 비슷하였다. 크레아티 닌을 보정하기 전의 결과에서는 대조군 (4.
실험결과 70°C 에서 20분 이상 반응시킬 경우 반응율이 감소되는 것으로 보아 dansyl-Hyp은 고 온에서 안정성이 떨어지는 것으로 생각 된다. Dansyl-Cl의 양은 몰 비를 기준으 로 4-Hyp의 120배에서 충분한 반응이 이루어졌으며 300배 이상에서는 오히려 반응률이 감소되었다. 이는 dansyl-Cl의 peak가 너무 커서 dansyl-Hyp의 peak 가 중첩되어 과소 평가된 것으로 생각된 다.
OPA를 소변 중 a-아미노산에 반응시 켜 Bond Elut Cl8 칼럼에서 흡착 제거 한 dansyl-Cl를 유리 형 4-Hyp에 유도 체시켜서 HPLC/형광검출기(Em: 340 nm, Ex: 538 飾)로 분석하는 방법을 개발 하였다. 개발된 분석방법을 이용하여 병 원 근로자와 타이어생산 근로자들의 소 변 중 유리형 4-Hyp의 분석가능 여부를 확인한 결과, 대조군(0.33-16.44 /4noV I) 과 노출군의 작업 전(N.D-49.06 /4nol/1), 작업 후(0.32-56.27 /4nol/1) 모두 분석 이 가능하였다.
Niell [1 이은 뼈의 변형이 있는 여성 폐암환자(75명)를 실험군으로 선정하고, 뼈의 변형만 있는 환자를 대조 군으로 선정하여 소변 검사를 실시한 결 과, 대조군에 비해 실험군에서 소변 중 Hyp 농도가 3-4배 이상 높았으며, 뼈의 변형과 Hyp과는 90%이상의 상관성을 보였다. 이 결과로 폐암환자의 뼈의 변형 을 검사하기 위한 방법으로 소변 중 Hyp 을 분석하는 것이 간편하고 정확한 방법 이라 하였다.
타이어 생산공장 근로자들의 소변 중 4- Hyp 농도에 영향을 미칠 수 있는 연령, 음주 및 흡연에 대한 t-검정결과 연령은 노출군이 비노출군에 비해 높았으며 (Table 2), 상관분석결과 연령, 음주 및 흡연은 작업 후 소변 중 유리형 4-Hyp에 영향을 미치지 못하였다 (Table 3).
후속연구
그러 나 DPS-C1의 경우 표준시약 가격이 10 mg을 100달러에 판매되고 있기 때문에 많은 시료를 분석하는데 경제적인 어려 움이 있다. 따라서 검출한계가 다소 높■기 는 하지만 일반인의 소변을 분석하는데 충분한 검출한계를 갖는 이번 연구결과 는 위의 여러 분석법들의 단점을 보완한 개량된 분석법이라 할 수 있을 것이다.
타이어를 생산하는 공장에서는 물리적, 화학적 유해물질이 발생되고 있으며 [15], 대상자들에게는 정신적 요인과 노 동에 의한 생체 내에서 활성산소의 변화 가 있을 수 있다. 따라서 유해물질과 소변 중 유리형 4-Hyp과의 상관관계에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각되며, 아 울러 물리적, 화학적, 정신적 스트레스로 인한 활성산소 radical의 과다 발생이 질병과 노화에 미치는 영향을 규명하기 위해서는 소변 중 4-Hyp의 평가 이외에 도 생물학적 지표인 malonaldehyde 및 4HNE과 dG의 산화물질인 8-OHdG을 통합 연계한 연구가 필盅할 것으로 생각 된다.
참고문헌 (15)
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