어류질병세균에 대한 천연식물 및 망태버섯 (Dicyophora indusiata) 추출물의 항균활성 Antimicrobial Effects of Natural Plant and Mushroom, Dicyophora indusiata Extracts on Fish Pathogenic Bacteria원문보기
양식어류 질병 세균에 대한 31종의 천연물을 $70\%$ ethanol로 추출하여 항균효과를 조사하였다. 그 중에서 망태버섯 ethanol 추출물이 비교적 높은 활성을 나타내었으며, 망태버섯을 극성이 낮은 dichlorornethane, ethyl acetate, n-buthanol, water의 순서로 분획하여 항균효과를 본 결과 ethyl acetate 추출물에서 모든 균주에대한 clear zone을 형성하여 항균효과가 보였다. 또한, 망태버섯로부터의 ethyl acetate 추출물을 Si-chromatography를 이용하여 fraction별 7개로 분획하여 항균효과를 조사한 결과 Fraction 2 (Hx :EtAOc, 3: 1)에서는 L. anguillarum에 대해 가장 항균효과가 뛰어났으며, Fraction 5 (DCM:MeOH, 5: 1)에서 5. iniae가 가장 높았다. 그 중에서 세 균주에 대해서 공통적으로 항균활성이 높은 것은 Fraction 5로 나타났다.
양식어류 질병 세균에 대한 31종의 천연물을 $70\%$ ethanol로 추출하여 항균효과를 조사하였다. 그 중에서 망태버섯 ethanol 추출물이 비교적 높은 활성을 나타내었으며, 망태버섯을 극성이 낮은 dichlorornethane, ethyl acetate, n-buthanol, water의 순서로 분획하여 항균효과를 본 결과 ethyl acetate 추출물에서 모든 균주에대한 clear zone을 형성하여 항균효과가 보였다. 또한, 망태버섯로부터의 ethyl acetate 추출물을 Si-chromatography를 이용하여 fraction별 7개로 분획하여 항균효과를 조사한 결과 Fraction 2 (Hx :EtAOc, 3: 1)에서는 L. anguillarum에 대해 가장 항균효과가 뛰어났으며, Fraction 5 (DCM:MeOH, 5: 1)에서 5. iniae가 가장 높았다. 그 중에서 세 균주에 대해서 공통적으로 항균활성이 높은 것은 Fraction 5로 나타났다.
Ethanol extract obtained from bark, roots, stem, leaves and seeds of 30 species of plants and mushroom, Dicyophora indusiata were examined antimicrobial effect on fish pathogenic bacteria, Listoneria anguillamm, Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae by disk method. Ethanol extract of D. indusiat...
Ethanol extract obtained from bark, roots, stem, leaves and seeds of 30 species of plants and mushroom, Dicyophora indusiata were examined antimicrobial effect on fish pathogenic bacteria, Listoneria anguillamm, Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae by disk method. Ethanol extract of D. indusiata was found to be the most active against all fish pathogenic bacteria in test system. Ethyl acetate fraction from ethanol extract of D. indusiata showed the strongest compared with those from other solvent fractions such as dichloromethane, n-buthanol and water. The antimicrobial effect of ethyl acetate fraction was particularly evident against S. iniae.
Ethanol extract obtained from bark, roots, stem, leaves and seeds of 30 species of plants and mushroom, Dicyophora indusiata were examined antimicrobial effect on fish pathogenic bacteria, Listoneria anguillamm, Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae by disk method. Ethanol extract of D. indusiata was found to be the most active against all fish pathogenic bacteria in test system. Ethyl acetate fraction from ethanol extract of D. indusiata showed the strongest compared with those from other solvent fractions such as dichloromethane, n-buthanol and water. The antimicrobial effect of ethyl acetate fraction was particularly evident against S. iniae.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 천연물을 이용한 어류 질병 세균에 대한 항균물질 개발의 기초자료를 제공하고자 국내에서 항균 활성이 뛰어나다고 보고된 천연식물 30종 및 망태버섯을 선택하여 항균 활성 시험을 거친 후 그 효과가 높은 천연물을 선정하여 fraction 별로 분획물을 얻어서 각각의 항균효과를 알아보았다.
제안 방법
Column (100X2cm id)에 시료 무게의 20배 정도의 활성화된 silica gel (70~230 mesh, Merck, Germany) 을 hexane으로 현 탁 시켜 충진한 후 dichloromethane, ethyl acetate, methanol (MeOH) 혹은 CHzCu-MeOH-Water(65: 35: 10)로 순차적으로 용출 시 켜서 각 성분의 TLC pattern에 따라 여러 획분으로 분획하여 각각의 항균 활성 실험을 실시하였는데 TLC plate (Silica gel 60 F2S4, Merck, Germany) 는 254 nm의 UV로 관찰한 다음 1% CeSQ/10% H2SO4 용액을 분무하고 가열의 발색으로 검출하였다. 각 분획물에 대한 농도는 감압 농축된 잔사를 ethanol 원액으로 1 mg/mL (lOOppm)으로 맞추어서 항균 활성 실험에 사용하였다.
McFarland 0.5인 균 현탁액을 다시 생리식염수에 10배 희석하여 미리 만들어진 MHA plate에 100)uL 분주도 말하고, 건조 후 멸균된 paper disc (직경 6 mm, Advantec, Japan)에 주출물을 50*L씩 적하하여 풍건하고 MHA plate에 얹어서 28t, 18시간 배양하여 clear zone의 직경을 calipw로 측정하였다. CaliperS.
오배자는 추출, 정제 및 보관과정 중에 일반 미생물에 오염되어 항균 활성이 급격히 저하되는 문제로 인하여 대상 시험물질에서 제외되었지만, 망태버섯과 마찬가지로 초기실험 시 항균효과가 뛰어났기 때문에 앞으로 신중히 고려해 볼만한 가치가 있다고 사료 된다. 그래서 망태버섯만을 선택하여 다시 획분별 항균 활성 실험을 실시하였다.
시험에는 넙치에서 분리동정된 Listonella anguillarum, Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae의 세 균주를 사용하였다. 시 험시작 5일 전 넙치 복강에 IXlecFU/mL를 0.1 mL 주사하여 활 성화시킨 후 신장으로부터 그 균을 순수분리하고 BHI broth (Brain Heart Infusion broth, Difco) 에 접종한 후 28t 배 양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 균은 원심분리하여 상청액은 버리고 남은 균체을 생라식염수로 3번 수세 후 McFarland 0.
양식어류 질병세균에 대한 31종의 천연물을 70% ethanol로 추출하여 항균효과를 조사하였다. 그 중에서 망태버섯 ethanol 추출물이 비교적 높은 활성을 나타내었으며, 망태 버섯을 극성이 낮은 dichloromethane, ethyl acetate, n-buthanol, water의 순서로 분획하여 항균효과를 본 결과 ethyl acetate 추출물에서 모든 균주에 대한 clear zone을 형성하여 항균효과가 보였다.
이미 항균효과가 뛰어나다고 알려진 31종의 천연식물 및 버섯을 70% ethanol로 추출하여 어류 질병 원인 세균에 대한 항균효과를 조사하였다. 망태버섯, 오미자, 황금, 감초, 사상자, 대황, 오배자, 오매, 솔잎 추출물이 항균 활성이 높았으며, 특히 망태버섯과 오배 자는 폭넓은 항균 활성을 나타내었다.
항균 활성이 높았던 망태버섯을 선정하여 다시 70% ethanol로 24시간 동안 암실에 방치한 후 여과. 농축하여 ethanol 추출물을 얻었다.
대상 데이터
망태버섯, 오미자, 황금, 감초, 사상자, 대황, 오배자, 오매, 솔잎 추출물이 항균 활성이 높았으며, 특히 망태버섯과 오배 자는 폭넓은 항균 활성을 나타내었다. 따라서 망태버섯과 오배자를 항균물질의 추출을 위한 원료로 선정하였다. 이러한 어류 질병 세균에 대한 항균효과를 연구한 Sohn (1999)은 오미자, 구기자를 ethanol, methanol 및 water로써 주줄 한 용액으로 L.
본 연구에 사용된 천연물은 관련 문헌 조사를 통하여 항균성이 있거나 살균 능이 있다고 알려진 식물 30종과 망태버섯 (Dicy。- phora indusiata)을 선택하여 이들 시료를 마쇄한 후 추출용 시료로 사용하였다 1(Table 1). 시료는 국산인 감초, 개옻나무, 고삼, 곽향, 금은화, 백두옹, 솔잎, 애엽, 오매, 오배자, 오미자, 향부자와 황금과 중국산인 단삼, 대황, 망태버섯, 박하, 방기, 백 급, 사상자, 삼지구엽초, 상지, 연교, 차전자, 택사, 토목 향, 파엽, 포공영, 황련, 황백, 회향을 사용하였다.
본 연구에 사용된 천연물은 관련 문헌 조사를 통하여 항균성이 있거나 살균 능이 있다고 알려진 식물 30종과 망태버섯 (Dicy。- phora indusiata)을 선택하여 이들 시료를 마쇄한 후 추출용 시료로 사용하였다 1(Table 1). 시료는 국산인 감초, 개옻나무, 고삼, 곽향, 금은화, 백두옹, 솔잎, 애엽, 오매, 오배자, 오미자, 향부자와 황금과 중국산인 단삼, 대황, 망태버섯, 박하, 방기, 백 급, 사상자, 삼지구엽초, 상지, 연교, 차전자, 택사, 토목 향, 파엽, 포공영, 황련, 황백, 회향을 사용하였다.
시험에는 넙치에서 분리동정된 Listonella anguillarum, Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae의 세 균주를 사용하였다. 시 험시작 5일 전 넙치 복강에 IXlecFU/mL를 0.
농축하여 ethanol 추출물을 얻었다. 이 추출물은 비극성에서 극성이 증가하는 dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EtAOc), n-buthanol, water(H2O) 순으로 용매 분획물을 얻고, 각각의 용매 분획물은 진공 농축기 (Buchi, Switzerland)와 동결건조기 (Eyela, Japan)로 용매를 완전히 제거한 후 ethanol을 가하여 용해시켜서 항균 활성 실험에 사용하였다. 모든 실험에 사용된 시약들은 1급 이상이었다.
5로 조절하였다. 항균용 검사 배지는 MHA (Mueller Hinton Agar, Di- fco)를 사용하였다.
성능/효과
총 31종의 천연물 추출물 중 일부 균이라도 항균효과가 있는 것은 17종이었고 각 식물 추출물의 항균효과의 정도는 균주에 따라서 상당한 차이를 보이고 있었다. L. angu辺arum에 대한 항균 활성은 오배자, 망태버섯, 황금, 오매, 오미자, 애엽, 솔잎, 삼지구엽초, 황련, 연교, 대황, 개옻나무, 사상자 순으로 활성이 높았으며, S. iniae는 망태버섯, 오배자, 차전자, 솔잎, 오매, 감초, 단 삼, 오미자, 황금, 파엽, 대황의 순이었고, L gajvieae는 망태버섯, 오배자, 감초, 사상자, 개옻나무, 차전자, 대황, 오매, 파엽의 순이었다. 그중에서 사용 균주 모두에 항균효과가 높은 것은 망태버섯, 오배자였다.
항균효과를 조사하였다. 그 중에서 망태버섯 ethanol 추출물이 비교적 높은 활성을 나타내었으며, 망태 버섯을 극성이 낮은 dichloromethane, ethyl acetate, n-buthanol, water의 순서로 분획하여 항균효과를 본 결과 ethyl acetate 추출물에서 모든 균주에 대한 clear zone을 형성하여 항균효과가 보였다. 또한, 망태버섯로부터 의 ethyl acetate 주출물을 Si-chromatography를 이용하여 fraction별 7개로 분획하여 항균 효과를 조사한 결과 Fraction 2 (Hx: EtAOc, 3:1)에서는 L.
그 중에서 망태버섯 ethanol 추출물이 비교적 높은 활성을 나타내었으며, 망태 버섯을 극성이 낮은 dichloromethane, ethyl acetate, n-buthanol, water의 순서로 분획하여 항균효과를 본 결과 ethyl acetate 추출물에서 모든 균주에 대한 clear zone을 형성하여 항균효과가 보였다. 또한, 망태버섯로부터 의 ethyl acetate 주출물을 Si-chromatography를 이용하여 fraction별 7개로 분획하여 항균 효과를 조사한 결과 Fraction 2 (Hx: EtAOc, 3:1)에서는 L. anguillarum0^ 대해 가장 항균 효과가 뛰어났으며, Fraction 5(DCM:MeOH, 5:1)에서 S. iniae가 가장 높았다. 그 중에서 세균주에 대해서 공통적으로 항균 활성이 높은 것은 Fraction 5로 나타났다.
이미 항균효과가 뛰어나다고 알려진 31종의 천연식물 및 버섯을 70% ethanol로 추출하여 어류 질병 원인 세균에 대한 항균효과를 조사하였다. 망태버섯, 오미자, 황금, 감초, 사상자, 대황, 오배자, 오매, 솔잎 추출물이 항균 활성이 높았으며, 특히 망태버섯과 오배 자는 폭넓은 항균 활성을 나타내었다. 따라서 망태버섯과 오배자를 항균물질의 추출을 위한 원료로 선정하였다.
garvieae에 대한 어류 질병의 항균 활성이 뛰어났다고 하였다. 이것은 사용하는 추출 용매의 특성에 따라서 성분이 달라지지만, 본 실험에서 항균 활성이 가장 뛰어난 망태버섯과 오배자를 비교해 볼 때 활성이 약간 높은 것으로 보였다.
이들 시료들은 각각 ethyl acetate, dichloromethane, n-buthanol, water의 용매별로 분획하여 항균효과를 조사한 결과 ethyl acetate 획분에서 다른 용매에 획분에 비하여 항균 활성이 높게 나타났으며, S. iniae에 대해 다른 균주보다 강한 항균효과를 나타내었다. 오배자는 추출, 정제 및 보관과정 중에 일반 미생물에 오염되어 항균 활성이 급격히 저하되는 문제로 인하여 대상 시험물질에서 제외되었지만, 망태버섯과 마찬가지로 초기실험 시 항균효과가 뛰어났기 때문에 앞으로 신중히 고려해 볼만한 가치가 있다고 사료 된다.
어병 세균에 대한 항균 활성의 결과 중에서 가장 높은 항균 활성을 보인 망태버섯을 각 용매별로 용매 분획을 행한 후, 그 항균 활성을 검사한 결과는 Table 3과 같다. 즉 용매 분획한 망태버섯의 추출물 중에서 ethyl acetate 획분에서 S. iniae, L. anguillarum, L. gar- vieae 순으로 강한 활성을 나타내었으며, n-buthanol과 water 획 분에서는 L. anguiWarum에서 일부 활성을 나타내었으며 dichloromethane 획분에서는 전혀 항균효과가 나타나지 않았다. 따라서 ethyl acetate 용매 추출물로부터 활성 물질을 분리하였다.
천연 식물로부터 어병 세균의 항균 활성 시험 결과를 Table 2에 나타내었다. 총 31종의 천연물 추출물 중 일부 균이라도 항균효과가 있는 것은 17종이었고 각 식물 추출물의 항균효과의 정도는 균주에 따라서 상당한 차이를 보이고 있었다. L.
후속연구
본 연구에서는 앞으로 합성 항균제의 안전성과 내성이 그다지 없는 식물 추출물을 개발하기 위한 기초자료를 보다 충분히 확보하기 위하여 L. anguillarum, L. garviae, S. iniae의 세 가지 균주뿐만 아니라 여러 종류의 균주에 대해서 항균효과를 검색하고 식물로부터 항균 활성 물질을 분리하여 물질이 어떤 성분에 의해서 활성을 띠는지 좀 더 깊이 있게 연구할 필요가 있다고 판단되었다.
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