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문제 정의
- 따라서 본 연구는 sarcoma-180 복수암 세포를 마우스에 상황버섯 분비물을 경구 투여하여 면역세포의 증가 여부와 cytokine의 생성능 및 복수암과 고형암에 대한 항암효과를 조사하였다.
- 따라서 본 연구는 상황버섯의 분비물에 대한 항암효과 및 면역활성을 관찰하고자 마우스(ICR계)의 피하 및 복강에 sarcoma-180 복수암 세포를 이식시키고, 상황버섯의 분비물을 경구 투여한 후, 생존일수, 고형암 저지율, 백혈구의 화학주성능, 면역세포의 증식여부, cytokine 생성 및 암세포에 대한 세포독성능을 관찰하고자 수행하였다.
제안 방법
- 또한 그외 단당성분 분석을 위해서는 1 mg/ml 농도로 용해시킨 다음 100μg을 건조하여 amino sugar는 6N HCl로 2시간, neutral sugar는 2M TFA로 4시간 가열하여 가수분해하였다. 가수분해 후 trifluoroacetic acid를 감압 증발하여 건조시킨 후 증류수 100μl에 용해시킨 다음 10μl를 HPLC로 분석하였다.
- 면역세포의 증식시험 . 고형암과 복수암 유발 마우스에 상황버섯 분비물의 투여 방법과 투여 기간은 항암효과 시험과 동일하게 실시한 후 전혈을 채혈하여 항응고제가 처리된 EDTA tube 5개에 각각 100μl씩 넣고, 단클론 항체(Rat Anti-Mouse CD3ε, Rat Anti-Mouse CD4/L3T4, Rat Anti-Mouse CD8/Lyt-2, Rat Anti-Mouse CD19, Rat Anti-Mouse CD45/LCA, Mouse (C3H×Balb/c) Anti-Mouse NK1.1 (Southern Biotechnology Associates Inc, 미국)들은 4μl씩 가하였다. 이들을 4℃에서 30분 동안 방치한 뒤 적혈구를 용혈시키기 위하여 lysis solution (50% diethylene glycol과 15% formaldehyde가 혼합된 용액을 증류수와 1：10 v/v으로 혼합한 용액)을 2 ml 가하여 10분 동안 실온에서 방치하였다.
- 마우스(ICR계) 암컷 15수씩 고형암과 복수암 유발 마우스에 상황버섯 분비물을 투여한 시험군과 대조군으로 나누어 시험하였으며, 시험군은 분리된 각 군에 상황버섯 분비물을 생리식염수에 용해하여 125 mg/kg을 경구로 7일간 전투여한 뒤 암세포 이식 후 23일 동안 경구투여하였다. 대조군은 동량의 생리식염수를 같은 시간에 같은 양으로 경구투여하였다.
- 동물실 환경에 순화된 마우스에 동결 건조된 상황버섯 분비물을 생리식염수에 용해시켜 1일 125 mg/kg을 경구로 1주일간 전투여하였다.
- 또한 고형암 발생을 위하여 5.0×106 cells/mouse을 0.2 ml씩 마우스의 오른쪽 서혜부에 피하 이식하였다. 이식 후 복수암과 동일하게 상황버섯 분비물을 투여하며 23일 경과 후 발생된 고형암을 적출하여 중량을 측정하고 아래 식에 의하여 종양증식 억제율을 구하여 이를 항암효과의 지표로 하였다.
- 마우스(ICR계) 암컷 15수씩 고형암과 복수암 유발 마우스에 상황버섯 분비물을 투여한 시험군과 대조군으로 나누어 시험하였으며, 시험군은 분리된 각 군에 상황버섯 분비물을 생리식염수에 용해하여 125 mg/kg을 경구로 7일간 전투여한 뒤 암세포 이식 후 23일 동안 경구투여하였다. 대조군은 동량의 생리식염수를 같은 시간에 같은 양으로 경구투여하였다.
- 마우스의 복강에서 얻은 sarcoma-180 복수암 세포를 세포배양액(RPMI 1640)으로 1500 rpm에서 15분간 2회 원심세척 후 5.0×106 cells/mouse로 조정하여 마우스의 서혜부에 피하 주사하였고, 5.0×105 cells/mouse로 조정하여 마우스의 복강에 주사하였다.
- 재배 시 생성되는 상황버섯 분비물을 HP20 resin으로 채워진 칼럼을 통과시켜 다당체 성분을 분획하였다. 분획 후 여액을 모아 증류수 속에서 48시간 투석한 후, 투석내 액을 동결건조하여 분비물의 다당류를 얻었다.
- 사람 폐암 세포주인 A549, 자궁암 세포주인 SK-OV-3, 피부암 세포주인 SK- MEL-2, 결장암 세포주인 HCT 15 그리고 중추신경계 세포주인 XF 498 등에 대한 세포독성을 측정하였다.
- 면역세포의 증식. 상황버섯 분비물을 투여한 시험군과 대조군의 복수암 및 고형암이 유발된 마우스의 혈액에 대하여 유세포 측정기(flow cytometry)를 이용하여 NK cells 및 면역세포의 증식여부를 측정하였다. 고형암과 복수암 유발 마우스에 상황버섯 분비물을 투여한 시험군이 대조군보다 B cells, T cells, Th cells, Tc cells이 유의성 있는 증가를 보였으며, NK cells도 약간 증가하였다(Table VII, VIII).
- 세포독성시험 . 상황버섯 분비물이 사람 암세포주에 대세포주인 A549, 난소암 세포주인 SK-OV-3, 피부암 세포주인 SK-MEL-2, 결장암 세포주인 HCT 15 그리고 중추신경계 세포주인 XF498을 이용하여 상황버섯 분비물의 각 농도별로 SRB assay를 실시하여 Table III과 같은 결과를 얻었다.
- 분주된 세포들을 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 24시간 배양하여 바닥면에 부착시킨 후 aspirator로 배지를 제거하였다. 신선한 배지에 상황버섯 분비물을 6가지 농도(0.003, 0.03, 0.3, 3.0, 30.0, 300.0μg/ml)의 log-dose로 희석하여 암세포가 들어 있는 well에 각각 100μl씩 3배수로 넣어주고 48시간 배양하였다. 시험액을 가하기 전에 0.
- 이와 같은 다양한 백혈구는 생체 내에 존재하면서 직접, 간접으로 각종 형태의 면역반응에 참여하여 생체를 이물질의 공격으로부터 보호한다(12). 이러한 백혈구의 활성을 알아보고자 sarcoma-180 복수암 세포를 마우스의 서혜부와 복강에 종양을 유발시키고 상황버섯 분비물을 마우스에 경구투여한 후, 백혈구의 화학주성능(chemotaxis)을 측정하였다. 그 결과 서혜부에 종양을 유발시킨 시험군은 76.
- 2 ml씩 마우스의 오른쪽 서혜부에 피하 이식하였다. 이식 후 복수암과 동일하게 상황버섯 분비물을 투여하며 23일 경과 후 발생된 고형암을 적출하여 중량을 측정하고 아래 식에 의하여 종양증식 억제율을 구하여 이를 항암효과의 지표로 하였다.
- 2 ml씩 복강 내에 이식하였다. 이식 후에도 동일한 양의 상황버섯 분비물을 같은 방법으로 투여하며 대조군과 비교하였다. 평균생존일수(Mean survival time, MST)와 생존일수연장률(Increase life span, ILS)은 아래 식을 이용하여 판정하였다.
- 당 조성 분석. 재배 시 생성되는 상황버섯 분비물을 HP20 resin으로 채워진 칼럼을 통과시켜 다당체 성분을 분획하였다. 분획 후 여액을 모아 증류수 속에서 48시간 투석한 후, 투석내 액을 동결건조하여 분비물의 다당류를 얻었다.
- 즉 trypsin-EDTA용액으로 처리한 세포부유물에 무균 적으로 첨가하여 측정하였다. 먼저 A549와 HCT15는 5.
- 화학주성능 분석: 백혈구의 화학주성능을 측정하기 위해 Boyden의 것을 변형 개조한 modified boyden chamber(B 312, Synderman)와 nucleopore filter (pore size 3.0μm, diameter 13 mm, polycarbonate filter, Corning, 미국)를 사용하였다.
대상 데이터
- 복수암 세포주: 본 실험에 사용한 암세포주는 마우스복수암세포(Sarcoma-180)로 가톨릭 의과대학 미생물교실에서 분양받아 사용하였다.
- 상황버섯 종균 및 자실체 배양. 본 실험에 사용한 버섯균주(Phellinus linteus)는 연암대학의 이대진 교수로부터 분양 받았으며 종균은 PDA (Potato dextrose agar, Difco)배지상에 접종하여 계대배양하면서 보관하였고, 실험에 사용하기 위해서는 PDB (Potato dextrose broth, Difco)배지에 접종하여 26℃, 상대습도 90% 이상에서 18일간 배양하였다.
- 분비물 제조 및 투여방법 : 본 실험에 사용한 상황버섯(Phellinus linteus) 분비물은 동결 건조시킨 후 생리식염수로 용해하여(125 mg/kg) membrane filter (0.45μm)로 여과한 다음 사용하였다.
- 분양받은 복수암 세포(Sarcoma-180)를 무균적으로 채취한 후 원심분리기(Hanil, union55R, 한국)를 이용하여 세포배양액[RPMI; Roswell Park Memorial Institute, 1640(Ca2+, Mg2+ free, GIBCOBRL Cat. No. 31800-022, 미국)]으로 1500 rpm에서 15분간 2회 원심세척한 후 1×106 cells/ml의 세포농도로 조정하여 0.2 ml씩 마우스 복강에 15일 간격으로 계대 이식하여 사용하였다.
- 실험동물: 본 실험에 사용한 마우스는 한국화학연구소 안전성연구센터에서 3～4주령, 체중 21±2 g의 마우스(International Cancer Research, U.S.A)를 구입하여 각 실험군마다 각각 동수(15마리)를 사용하였으며, 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 실온 23±2℃, 상대습도 55±3%를 유지하며 1～2주일간 동물실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 약 2～3주 동안 온도(25℃)와 습도(90% 이상)를 유지시켜 주면 원기가 형성되기 시작하는데, 처음에 생성된 자실체는 제거하고 2차적으로 생성된 자실체를 충분히 환기시키며 1년 이상 키웠다. 이렇게 자실체를 배양하는 도중에 자실체 표면에 분비되는 갈색의 액을 멸균된 용기에 모아 동결 건조시킨 것을 상황버섯의 분비물로 삼아 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 백혈구의 화학주성능은 김 등(10)의 방법, 염색 및 결과 관찰은 이 등(11)의 방법에 따라 실시하였다. 고형암과 복수암 유발 마우스의 백혈구 화학주성능은 student's t-test에 의해 비교검정하였다.
이론/모형
- 기기분석조건 Ninhydrin분석법-Hydro lysate program(Total amino acid)으로 Cation separation column (150×4 mm)을 사용하였다.
- Cytokines 생성능 분석. 마우스 혈액 중 cytokines의 측정은 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 ELISA Kit [CytoscreenTM Mouse IL-2, CytoscreenTM Mouse IL-4, CytoscreenTM Mouse IL-6, CytoscreenTM Mouse TNF-α(BioSource Interational, Inc.]를 이용하여 sandwish ELISA 방법으로 실시하였다.
- 백혈구의 분리: 백혈구의 분리 및 유주능의 실험은 이 등(8)의 방법을 사용하였다.
- 백혈구의 화학주성능은 김 등(10)의 방법, 염색 및 결과 관찰은 이 등(11)의 방법에 따라 실시하였다. 고형암과 복수암 유발 마우스의 백혈구 화학주성능은 student's t-test에 의해 비교검정하였다.
- 세포독성시험 . 상황버섯 분비물에 대한 세포독성시험은 Sulforhodamine-B (SRB) assay법(7)을 사용하였다.
- 2000 rpm에서 20분간 원심하여 상층액을 버리고 가라앉은 백혈구에 RPMI 1640을 첨가해 백혈구 부유액을 만들었다. 이 부유액을 Cate 등(9)의 방법에 따라 hemacytometer로 세포수를 계수하여 세포의 농도를 1×106 cells/ml이 되도록 조정한 후, 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 1%로 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. SK-OV-3세포주는 103.2～94.2%, SK-MEL-2세포주는 99.4～98.7%, XF498 세포주는 101.6～93.9% 그리고 HCT 15 세포주는 101.2～97.3%로 나타났으며 IC50 값이 5종의 세포에 대하여 300μg/ml 이상으로 직접적인 세포독성은 거의 없는 것으로 나타났다.
- 상황버섯 분비물을 투여한 시험군과 대조군의 복수암 및 고형암이 유발된 마우스의 혈액에 대하여 유세포 측정기(flow cytometry)를 이용하여 NK cells 및 면역세포의 증식여부를 측정하였다. 고형암과 복수암 유발 마우스에 상황버섯 분비물을 투여한 시험군이 대조군보다 B cells, T cells, Th cells, Tc cells이 유의성 있는 증가를 보였으며, NK cells도 약간 증가하였다(Table VII, VIII).
- 버섯으로부터 추출한 다당체들이나 다당체-단백질 복합체들이 면역조절제로 작용하여 항암작용을 나타낼 것으로 추측되어 왔고, 실제로 다양한 버섯의 다당체들의 항암효과가 집중적으로 연구되어 왔다. 그 결과 lentinan(Lentinus edodes), pachymaran (Poriacocos), schizophyllan(Shizophyllum commune) 등과 같은 버섯추출물들이 비특이적으로 면역반응을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(14,15). 즉, 숙주의 면역체계를 활성화시킴으로써 항종양 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다(16).
- 이러한 백혈구의 활성을 알아보고자 sarcoma-180 복수암 세포를 마우스의 서혜부와 복강에 종양을 유발시키고 상황버섯 분비물을 마우스에 경구투여한 후, 백혈구의 화학주성능(chemotaxis)을 측정하였다. 그 결과 서혜부에 종양을 유발시킨 시험군은 76.3±4.9 g이었으며, 대조군은 61.2±6.4 g로 나타났다. 또한 복수암을 유발시킨 시험군은 99.
- 당조성과 아미노산 구성의 분석에서 상황버섯 분비물은 9종의 단당과 15종의 아미노산으로 구성되어 있었다. 단당 중에서 mannose가 26.71%로 가장 높았으며, 아미노산 중에서는 aspartic acid가 49.1 mg/kg으로 가장 높게 확인되었다(Table I, II)
- 당 조성 및 아미노산 분석. 당조성과 아미노산 구성의 분석에서 상황버섯 분비물은 9종의 단당과 15종의 아미노산으로 구성되어 있었다. 단당 중에서 mannose가 26.
- 대조군과 상황버섯 분비물을 처리한 시험군으로 각각의 백혈구 세포수를 측정하여 평균치를 측정한 결과 서혜부에 종양을 유발시키고 상황버섯 분비물로 처리한 시험군은 대조군에 비해 58.4%가 감소하였으며, 복수암을 유발시킨 후 상황버섯 분비물로 처리한 시험군은 대조군에 비해 22.9%가 감소하였다. 이러한 결과는 종양유발에 대한 방어기작으로 면역활성 lymphocyte가 상대적으로 증가하였기 때문이라고 생각된다.
- 또한 상황버섯 분비물의 성분을 분석한 결과 다당체단백질 복합체로 구성되어 있으며 이러한 다당단백질 역시 직접적으로는 종양세포를 파괴하지 않을 것으로 생각된다. 따라서 본 연구에서는 현재 임상치료에 사용하는 두 종류의 항암제와 상황버섯 분비물의 세포독성능을 비교하기 위하여 사람 폐암 세포주(A549), 난소암 세포주(SK-OV-3), 피부암 세포주(SK-MEL-2), 결장암 세포주(HCT 15) 그리고 중추신경계 세포주(XF 498)을 이용하여 in vitro에서 시험한 결과 항암제인 doxorubicin과 cisplatin의 5종류의 암세포주에 대한 IC50 값이 0.02～1.76μg/ml로 나타나 강한 세포독성능을 발휘하였으나, 상황버섯 분비물은 IC50 값이 300μg/ml 이상으로 나타나 세포독성을 나타내지 않았다. 이와 같은 다당체 및 다당체-단백질 복합체들의 항종양활성은 숙주의 면역체계의 자극에 의하여 유도됨을 알 수 있으며 이러한 기작은 아직 확실히 밝혀지지 않았지만 helper T세포의 자극에 의한 숙주면역계의 활성화와 보체-마크로파지에 의한 비특이적인 면역반응 등에 의한 것으로 생각된다.
- 한편 조 등(13)의 경우도 상황버섯 자실체 열수 추출물을 투여하여 백혈구의 화학주성능을 관찰한 결과 서혜부와 복강에 종양을 유발시킨 마우스에서 시험군은 대조군에 비해 우수한 화학주성능을 나타냈다. 따라서 상황버섯의 자실체 열수 추출물 및 분비물은 생체 방어능력 즉 면역능력을 증강시킴으로써 암세포의 성장억제 및 각종 병균에 대한 방어작용이 활발해지고, 생체에서 백혈구 유주능을 자극 또는 활성화시킴을 알 수 있다.
- 항암효과. 복수암 유발 마우스에 상황버섯 분비물을 투여한 시험군의 평균생존일수(MST)는 29.8일로 대조군의 25.3일보다 길게 나타나 평균생존 연장률이 117.8%이었다. 또한 상황버섯 분비물을 투여한 시험군 중에서 30일 이상 생존한 마우스는 40%이었다(Table V).
- 상황버섯 분비물을 sarcoma-180 복수암 세포가 이식된 마우스에 처리하였을 때 발현되는 cytokine을 조사한 결과 IL-2와 IL-4는 발현되지 않았고 IL-6와 TNF-α가 발현되었다. 이와 같은 결과로서 상황버섯 분비물에 의한 sarcoma-180 복수암 세포의 항암효과가 앞에서 언급한 바와 같이 숙주의 면역반응을 활성화시킴으로 이루어짐을 추측할 수 있다.
- Cytokine 생성능. 상황버섯 분비물을 투여한 시험군과 대조군의 복수암 및 고형암이 유발된 마우스의 cytokine 즉 IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α의 생성능을 알아보기 위하여 ELISA Kit을 이용하여 sandwish ELISA 방법으로 분석한 결과 고형암과 복수암 유발 마우스에서 상황버섯 분비물을 투여한 시험군과 대조군에서 IL-2 와 IL-4는 발현되지 않았지만, IL-6는 고형암 유발 마우스에서 시험군이 33.3±2.6 pg/ml, 대조군이 16.3±1.4 pg/ml으로 나타났으며, 복수암 유발 마우스에서는 시험군이 17.7±1.6 pg/ml, 대조군이 8.5±0.98 pg/ml로 나타나 대조군보다는 2배 정도 발현되어 유의성있게 증가되었다. 또한 TNF-α는 고형암 유발 마우스에서 시험군이 98.
- 예를 들면 Lentinus edodes(LE)로부터 추출한 다당체-단백질 복합체를 마우스의 비장 단핵세포와 사람의 말초혈액 단핵구에 처리하면 IL-2와 TNF-α의 발현이 전사단계(transcriptioon level)와 해독단계(translation level)에서 증가하는 것으로 보고되었다. 이러한 결과로서 LE의 다당체-단백질 복합체가 Th 면역반응을 유도하는 것을 알 수 있다. 또한 항암작용을 나타내는 polysaccharide-protein complex (PSPC)와 lentinan에 의하여 유도되는 cytokine들이 밝혀졌다.
- 상황버섯 분비물을 sarcoma-180 복수암 세포가 이식된 마우스에 처리하였을 때 발현되는 cytokine을 조사한 결과 IL-2와 IL-4는 발현되지 않았고 IL-6와 TNF-α가 발현되었다. 이와 같은 결과로서 상황버섯 분비물에 의한 sarcoma-180 복수암 세포의 항암효과가 앞에서 언급한 바와 같이 숙주의 면역반응을 활성화시킴으로 이루어짐을 추측할 수 있다.
- 즉, A549세포주의 경우 상황버섯 분비물의 농도가 0.003μg/ml일 때 생존율이 99.9%, 30.0μg/ml일 경우 94.1%로 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. SK-OV-3세포주는 103.
- 즉, 고형암 유발 마우스에 상황버섯 분비물을 투여한 시험군의 평균치는 82.5±5.7개로 대조군의 61.2±6.4개에 비해 약간 증가하였으나, 복수암 유발 마우스에 상황버섯 분비물을 투여한 군의 평균치는 99.9±6.9개로 대조군의 32±4.2개보다 유의성있게 증가하였다.
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