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문제 정의
- 항암효과를 보여주었다. 또, 문헌조사 결과 아직껏 두충의 항암효과 및 그 유효성분에 대한 체계적인 연구가 진행된 봐 없어 본 연구를 착수하게 되었다.
제안 방법
- 잔류 물층은 butanol (BuOH)로 추출하여 BuOH soluble part 10 g을 얻었다. EtOAc soluble part 27 g을 hexane/EtOAc 혼합용매를 용출용매로 사용하여 stepwise gradient elution 방식으로 silica gel (70-230 mesh, 750 g) column (0=5.0×100cm) chromatography를 실시하여 EC-1 (660 mg), EC-2 (1.62 g), EC-3 (1.36 응), EC-4 (3.24 흠), EC- 5 (5.4 g), EC-6 (4.66 g), EC-7(5.2g) 등 총 7개의 fractione로 나누었다. 이 중 EC-5를 EtOAc에 녹인후 alumina column (0=1.
- 100 μg/mℓ 이상). 따라서 가장 우수한 암세포증식저해효과를 보여준 EtOAc soluble part를 전술한 방법에 따라 silica gel column chromatography 와 RP-18 column chromatography 등을 반복하여 항암활성을 나타내는 compound 1과 compound 2 그리고 지방산 혼합물을 분리하였다. 이 중 compound 1과 compound 2는 각종 물리화학적 성상 및 분광학적 자료를 분석한 결과 compound 1은 monoterpene iridoid계 화합물인 genipin으로 compound 2는 phenylpropanoid 계열의 (±)-guaiacylglycerol로 동정하였으며9) 이들은 모두 10 μg/mℓ 이상의 농도영역에서 양호한 암세포증식 저해효과를 보여주었다(Table I).
- 융점은 Haakebuchler 미량융점 측정기를 이용하여 측정하였으며 측정치는 따로 보정하지 아니하였다. 선광도 [α]D는 JASCO DIP-4 digital p*, olarimeter low resolution MS(70eV)는 JEOL사의 JMS-DX 303 mass spectrometer, 각종 proton 및 carbon NMR spectra는 Brukei의 AM-300 및 AMX-500을 이용하여 측정하였다. 특별히 기재하지 않은 한, 사용한 용매의 peak를 기준 peak로 사용하여 chemical shift치를 정하였으며 δ(ppm)으로 표시하였다.
- 배 양액은 5% fetal bovine serum 으로 보강된 RPMI 1640 medium을 사용하였으며, 37℃ 항온 항습 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포의 계대는 3-4일에 1 회씩 하였으며, 계대시 세포를 용기 부착면으로 부터 탈리시키기 위하여 phosphate buffered saline (PBS) 용액에 0.25% trypsin과 3 mM trans-1, 2-di-aminocyclohexane- n, n, n, n, -tetraacetic acid (CDTA)를 녹인 용액을 사용하였다.
- 이렇게 염색된 cell plate 들을 다시 실온에서 건조시킨 후 well 당 100(11의 ]Q mM tfisma base (unbuffered)용액을 가하여 titer plate shaker로 10분간 shaking하여 염색액을 용출시킨 후 microplate reader를 사용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포들에 대한 약물의 효과를 계산하기 위하여 약물을 가하는 시점에서의 세포수(Tz, zero time)와 약물 대신 동량의 medium만을 가하여 48시간 배양했을 때의 세포수(C, control) 및 각농도의 약물과 함께 48시간 배양 했을 때의 세포 수(T, test)을 각각 측정하여 다음의 수식에 따라 항암활성을 계산하였다. 즉 Tz>T인 경우에는 [(T-Tz)/(C—Tz)]×100으로 계산하였고, Tz<T인 경우에는 [(T-Tz)/Tz]×100의 수식으로 계산하였다.
- 즉 Tz>T인 경우에는 [(T-Tz)/(C—Tz)]×100으로 계산하였고, Tz<T인 경우에는 [(T-Tz)/Tz]×100의 수식으로 계산하였다. 이렇게 계산된 값들로 부터 LOTUS program의 data regresion tool을 이용하여 약물이 암세포의 증식을 50% 저해하는 농도인 50% effective dose(IC50)를 계산하였다
- 개발된 sulforhodamine B (SRB) assay 방법을 활용하였다. 즉 계대중인 세포들을 실험에 사용하기 위하여 우선 trypsin-CDTA 용액으로 용기부착면으로부터 탈리시키고, 96 well flat bottom microplate (Falcon) 에 각 well 당 세포수가 5xl03 (A-549, HCW5), 1X104 (SK-MEL-2, XF 498), 2xl04 (SK-OV3)이 되도록 분주하였다. 분주된 세포들은 CO2 incubator 내에서 24시간 배양하여 바닥에 부착시킨 후 aspiratore, media를 제거하고 6 농도의 log dose로 medium으로 희석한 test material 용액들을 세포가 들어 있는 well에 각각 100μ1씩 3배수(triplicate)로 넣어주고, 48시간 동안 더 배양하였다.
- 또, 이 성분이 중성 alumina gel에 쉽게 흡착 제거되는 화학적 특성을 이용하여 EtOAc soluble part를 일부분 중성 alumina gel로 정제하여 본 결과 이 성분은 전체 EtOAc soluble part 총 중량의 30% 이상을 차지하고 있음을 알 수 있었다. 한편, 이 성분의 iH-NMR과 13C-NMR data를 분석하여 본 결과 이들은 불포화지방산과 포화지방산이 서로 비슷한 비율로 섞여 있는 유리지방산의 혼합물임을 알 수 있었으며 이들은 통상적인 silica gel column chromato- graphy와 RP-18 column chromatography 등의 방법으로는 더 이상의 정제가 불가능하여 시판되고 있는 지방산 표준품들을 구입하여 암세포증식 저해효과를 비교 검토하여 보았다.
대상 데이터
- 배 양액은 5% fetal bovine serum 으로 보강된 RPMI 1640 medium을 사용하였으며, 37℃ 항온 항습 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포의 계대는 3-4일에 1 회씩 하였으며, 계대시 세포를 용기 부착면으로 부터 탈리시키기 위하여 phosphate buffered saline (PBS) 용액에 0.
- 본 연구에 사용된 시약은 모두 특급 (GR) 및 1급 (EP급) 시약을 사용하였으며 지방산표준품은 Aldrich사로부터 구입하였다. 융점은 Haakebuchler 미량융점 측정기를 이용하여 측정하였으며 측정치는 따로 보정하지 아니하였다.
- 실험에 사용된 생약재 두충은 경동시장에서 구입하여 국민대학교 김 영균 교수의 감정을 거친 후 실험에 사용하였으며 voucher specimene 한국화학연구원 및 국민대학교 삼림과학대학에 보관되어 있다.
- 실험에 사용한 암세포들은 A-549(non small cell lungcarcinoma), SK-OV-3 (adenocarcinoma, ovary malignant ascites), SK-MEL-2 (malignant melanoma, metastasis to skin of thigh), XF-498 (central nerve system tumor), HCT- 15 (colon adenocarcinoma)이며 이 암세포들은 모두 human origin tumor cell line들로써, 미국의 국립암연구소(NCI)로부터 분양받아 한국화학연구원에서 계대배양 중인 것을 사용하였다. 배 양액은 5% fetal bovine serum 으로 보강된 RPMI 1640 medium을 사용하였으며, 37℃ 항온 항습 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
이론/모형
- 암세포 증식저해활성은 1989년에 미국의 국립암연구소 (NCI)에서 약물의 in vitro 항암활성을 1차적으로 측정하기 위하여 개발된 sulforhodamine B (SRB) assay 방법을 활용하였다. 즉 계대중인 세포들을 실험에 사용하기 위하여 우선 trypsin-CDTA 용액으로 용기부착면으로부터 탈리시키고, 96 well flat bottom microplate (Falcon) 에 각 well 당 세포수가 5xl03 (A-549, HCW5), 1X104 (SK-MEL-2, XF 498), 2xl04 (SK-OV3)이 되도록 분주하였다.
성능/효과
- A549(비소세포암주), SK-OV-3(난소암주), SK-MEL-2(흑색종주), XF498(중추신경계암주) 및 HCT-15(직장암주) 등 5종의 인체유래 암세포주에 대한 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과를 지표로 하여 생약재 추출물의 항암활성을 측정하여 본 결과 생약재 두충의 MeOH 추출물은 20 μg/mℓ -200 μg/mℓ의 농도영역에서 농도 의존적으로 각 암세포주의 증식을 저해하고 있음이 관찰되었다. (A549 cell의 세포증식을 50% 저해하는 농도[IC50]는 약 70㎍ㆍmℓ로 나타났다.
- 그 결과 유리지방산들은 대체로 10 ng/mℓ 이상의 농도영역에서 현저한 세포증식저해활성을 나타내고 있었으며 lauric acid (C12:0), palmitic acid (C16:0), stearic acid (Cl8:0) 등포화지방산들이 oleic acid 및 linoleic acid 등 불포화지방산에 비하여 상대적으로 우수한 세포증식저해효과를 보여주었다(Table I). 한편 지방산(free fatty acid)의 암세포증식저해효과에 대하여서는 최근 palmitic acid가 human leukemic cell line MOLT-4에 대하여 세포증식저해효과 및 apoptosis를 유도하는 효과가 있다는 보고가 있어 본 연구결과와 잘 일치하고 있다.
- 또, 두충의 MeOH 추출물을 EtOAc, BuOH, 물의 순서로 단계 분획하고 각 분획물의 세포증식저해효과를 같은 방법으로 즉정하여 본 결과 EtOAc soluble part가 우수한 활성(A549의 세포증식을 50% 저해하는 농도[IC50]는 약 30 μg/mℓ)을 보여준 반면 BuOH 가용분 및 최종 수용성분획은 항암활성이 미미하였다(A549의 세포증식을 50% 저해하는 농도[IC50]는 100 μg/mℓ 이상). 따라서 가장 우수한 암세포증식저해효과를 보여준 EtOAc soluble part를 전술한 방법에 따라 silica gel column chromatography 와 RP-18 column chromatography 등을 반복하여 항암활성을 나타내는 compound 1과 compound 2 그리고 지방산 혼합물을 분리하였다.
- 또, 이 성분이 중성 alumina gel에 쉽게 흡착 제거되는 화학적 특성을 이용하여 EtOAc soluble part를 일부분 중성 alumina gel로 정제하여 본 결과 이 성분은 전체 EtOAc soluble part 총 중량의 30% 이상을 차지하고 있음을 알 수 있었다. 한편, 이 성분의 iH-NMR과 13C-NMR data를 분석하여 본 결과 이들은 불포화지방산과 포화지방산이 서로 비슷한 비율로 섞여 있는 유리지방산의 혼합물임을 알 수 있었으며 이들은 통상적인 silica gel column chromato- graphy와 RP-18 column chromatography 등의 방법으로는 더 이상의 정제가 불가능하여 시판되고 있는 지방산 표준품들을 구입하여 암세포증식 저해효과를 비교 검토하여 보았다.
- 생약재 두충의 MeOH 추출물이 A549(비소세포암주), SK- OV-3(난소암주), SK-MEL-2(흑색종주), XF498(중추신경계암주) 및 HCF15(직장암주) 등 5종의 인체유래 암세포주에 대하여 우수한 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과를 보여주었다. 한편 활성유도분획법에 따라 두충의 MeOH 추출물로부터 세포증식저해물질들을 추적하여 본 결과 활성성분들은 주로 ethylacetate soluble part0)] 많이 분포하고 있으며이 ethylacetate soluble part를 각종 column chromatography 방법으로 정제한 결과 genipin(l), (±)-guaiacylglycerol 및 다량의 지방산혼합물을 암세포증식 저해효과를 나타내는 활성 성분으로 규명하였다.
- 한편 활성유도분획법에 따라 두충의 MeOH 추출물로부터 세포증식저해물질들을 추적하여 본 결과 활성성분들은 주로 ethylacetate soluble part0)] 많이 분포하고 있으며이 ethylacetate soluble part를 각종 column chromatography 방법으로 정제한 결과 genipin(l), (±)-guaiacylglycerol 및 다량의 지방산혼합물을 암세포증식 저해효과를 나타내는 활성 성분으로 규명하였다.
- 한편, 본 연구실에서는 다년간에 걸쳐 A549 (인체유래 비소세포암주) 등 5종의 인체유래 암세포주를 대상으로 하여 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과8)를 지표로 하여 300여종의 생약재 추출물들의 항암효능을 검색하여 본 결과 생약재 두충의 MeOH 추출물이 농도 의존적으로 비교적 양호한 항암효과를 보여주었다. 또, 문헌조사 결과 아직껏 두충의 항암효과 및 그 유효성분에 대한 체계적인 연구가 진행된 봐 없어 본 연구를 착수하게 되었다.
후속연구
- 유발시킨 종양발생을 효과적으로 차단하였다16)는 등 이들 화합물들의 항암효과를 직간접적으로 제시하는 많은 연구보고가 발표되고 있다. 그러나 in Vitro에서 배양한 인체유래 암세포의 성장저해효과를 바탕으로 항암효과를 평가하여본 본 연구의 결과에 따르면 이들화합물들은 모두 100μg/mℓ 이하의 농도영역에서는 실험에 사용한 어떠한 암세포주에 대하여도 유의적인 증식저해활성을 보여주지 못하였다.
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