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문제 정의
- 따라서 본 연구는 기주목(상수리나무, 밤나무, 자작나무, 버드나무)별 겨우살이 ethanol 추출물의 5가지 분획물(hexane fr., chloroform fr., ethyl acetate fr., butanol fr.,aqueous fr.)에 대한 in vitro에서 면역세포에 대한 생육 활성, 정상세포에 대한 세포독성, 여러가지 암세포에 대한 생육에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 4종의 한국산 겨우살이 (Korean Vis cum sp.) 추출물을 사용하여 Fig. 1의 분획 과정을 통하여 각각 다섯 가지의 분획물(hexane fr., chloroform fr., ethyl acetate fr., butanol fr., aqueous fr.)을 얻어 수율을 비교하였다(Table 1).
- 5mg/ml 이하의 농도에서 실험을 수행하였다. Data는 제시하지 않았으나 예비실험 결과에서 사람 B 세포에 대하여 모든 겨우살이 분획물 0.25mg/ml 의 농도에서 세포 생육활성이 높았고, 사람 T 세포에 대하여는 모든 겨우살이 추출물 0.5mg/ml의 농도에서 높은 세포 생육활성을 보였기 때문에 각 세포에 대하여 그 농도를 적용하여 실험을 행하였다.
- in Salix: koreensis)등 총 4종의 겨우살이를 물로 깨끗이 세척 한 후 자연 건조하였다. 겨우살이의 잎과 가지를 모두 사용하여 수직의 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량 100g 에 대하여 10배의 100% ethanol로 24시간 동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조 한 후이를 이용하여 극성에 따라 분별분리를 행하여 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 H2O로극성의 차이에 의해 다섯 가지 분획으로 조제하였다.
- 배양 후 hemocytometer로 세포 수를 즉정하였다. 그리고 이것은 겨우살이 추출물들을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 세포의 생육과 세포 수에 따라 면역활성을 측정하였다.
- 기주목(상수리나무, 밤나무, 자작나무, 버드나무)별 겨우살이 ethanol 추출물의 5가지 분획물(hexane fr., chloroform fr., ethyl acetate fr., butanol fr., aqueous fr.)을 이용하여 in vitro에서 사람 면역세포주에 대한 생육활성, 사람 정상 세포주에 대한 세포독성, 사람의 각종 암세포주에 대한 생육 저해능을 조사하였다. 4종의 한국산 겨우살이 분획물들의 정상세포에 대한 세포독성은 밤나무 겨우살이 chloroform fr.
- 면역 기능 증강 효과는 사람 면역 세포인 T 세포주(Jurkat, ATCC TIB-152>와 B 세포주 (Raji, ATCC CCL-89)를 이용하여 검증하였다(Byung Hoon Han et al., 1998; 윤 등., 1994). 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 incubator(37℃, 5% CO2, 98% humidity)에서 배양하였다.
- 5mg/ml의 농도로 첨가하고 8일간 배양하였다. 배양 후 hemocytometer로 세포 수를 즉정하였다. 그리고 이것은 겨우살이 추출물들을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 세포의 생육과 세포 수에 따라 면역활성을 측정하였다.
- 2와 3, 그리고 Table 7에 각각 나타내었다. 사람 B(Raji)와 T(Jurkat) ceU 모두 비교적 정상세포에 대한 독성이 낮다고 사료되는 0.5mg/ml 이하의 농도에서 실험을 수행하였다. Data는 제시하지 않았으나 예비실험 결과에서 사람 B 세포에 대하여 모든 겨우살이 분획물 0.
- 겨우살이의 잎과 가지를 모두 사용하여 수직의 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량 100g 에 대하여 10배의 100% ethanol로 24시간 동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조 한 후이를 이용하여 극성에 따라 분별분리를 행하여 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 H2O로극성의 차이에 의해 다섯 가지 분획으로 조제하였다. 분리된 용매 분획물은 농축시켜 시료를 얻었다.
- , 1981). 정상세포에 대한 시료의 특성을 조사하기 위하여 행한 selectivity 측정은 정상세포주(HEL 299)에 대한 여러가지 sample 농도에서 세포 독성을 측정하고, 각 암 세포주에 대한 생육 억제 활성을 조사하여 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산한다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 한국산 겨우살이(Korean Viscum album, var. cctoatum)는 강원도 평창 지역에서 2001년도 겨울에 채집한 것으로 기주목에 따라 상수리나무 겨우살이 (Korean Viscum sp. in Quercus acutissima Carr.), 밤나무 겨우살이(Korean Viscous sp. in Castanea crenata), 자작나무 겨우살이 (Korean Viscum sp. in Betula platyphylla), 버드나무 겨우살이(Korean Viscum sp. in Salix: koreensis)등 총 4종의 겨우살이를 물로 깨끗이 세척 한 후 자연 건조하였다. 겨우살이의 잎과 가지를 모두 사용하여 수직의 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량 100g 에 대하여 10배의 100% ethanol로 24시간 동안 2회 반복 추출하였다.
- 실험에 사용된 세포주들 중 Hep 3B, MCF-7는 DMEM(GIBCO, USA)배지를 A549, AGS, HEL 299는 RPMI 1640(GIBCO, USA)배지에서 10% FBS로 각각 적응시켜기 incubator(37℃, 5% CO, 98% humidity)에서 배양하였다. 실험에 사용한 세포의 초기 농도는 4X104 cells/ml의 농도로 조절하여 96well tissue culture microplate에 100㎕/well씩 접종하여 사용하였다.
- 실험에 이용한 세포주는 사람 암세포주로 사람 간암 세포주인 Hep 3B (hepatocellular carcinoma, human, ATCC HB-8064), 사람 폐암세포주인 A549(lung carcinoma, human, ATCC CCL-185), 사람 위암세포주인 AGS(stomach adenocarcinoma, human, ATCC CRL-1739), 사람 유방암세포주인 MCF-7(breast adenocarcinoma, human, ATCC HTB-22)를 사용하였고 시료 자체의 세포독성을 알아보기 위한 정상세포주에는 사람 폐세포주인 HEL 299(embiyo lung cell, human, ATCC CC LT37)를사용하였다. 실험에 사용된 세포주들 중 Hep 3B, MCF-7는 DMEM(GIBCO, USA)배지를 A549, AGS, HEL 299는 RPMI 1640(GIBCO, USA)배지에서 10% FBS로 각각 적응시켜기 incubator(37℃, 5% CO, 98% humidity)에서 배양하였다.
이론/모형
- 실험에 사용한 세포의 초기 농도는 4X104 cells/ml의 농도로 조절하여 96well tissue culture microplate에 100㎕/well씩 접종하여 사용하였다. 암 세포의 생육저해와 정상세포의 세포독성은 sulforhodamineB(SRB)방법을 이용하였다(Doyle et al., 1993; Dool et al., 1981). 정상세포에 대한 시료의 특성을 조사하기 위하여 행한 selectivity 측정은 정상세포주(HEL 299)에 대한 여러가지 sample 농도에서 세포 독성을 측정하고, 각 암 세포주에 대한 생육 억제 활성을 조사하여 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산한다.
성능/효과
- 에서 위암 세포주 AGS에 대하여 각각 88, 89, 93%의 생육 저해능을 나타냈다. 또한 각 추출물이 정상세포 독성에 대한 암세포의 억제율을 나타내는 selectivity에 있어서 각 추출물이 0.5mg/ml의 농도에서 3~9.3의 수치를 나타내어 한국산 겨우살이 ethanol추출물이 폐암세포주 A549와 위암 세포주 AGS에 대하여 선택적으로 사멸하는 특이성을 지닌 것이 확인되었다. 유방암세포인 MCF7에 대하여 겨우살이 분획물의 생육 저해능과 선택적 사멸도를 나타낸 것으로, 다른 암세포의 생육 저해능에 비하여 활성이 비교적 낮은 것으로 관찰되었다.
- 5mg/ml이하의 농도로 투여시 정상세 포에 대한 세포독성이 20%이하로 나타났다. 또한 암세포 생육 저해능의 경우, 폐암세포주 A549와 위암세포주 AGS에 대하여 상수리나무, 밤나무, 버드나무 겨우살이 분획물에서 80%이상의 생육억제 효과를 보였다.
- 3의 수치를 나타내어 한국산 겨우살이 ethanol추출물이 폐암세포주 A549와 위암 세포주 AGS에 대하여 선택적으로 사멸하는 특이성을 지닌 것이 확인되었다. 유방암세포인 MCF7에 대하여 겨우살이 분획물의 생육 저해능과 선택적 사멸도를 나타낸 것으로, 다른 암세포의 생육 저해능에 비하여 활성이 비교적 낮은 것으로 관찰되었다.
- , acetate fr.이 위암세포주 AGS에 대하여 각각 87, 81, 89%의 생육저해능을 나타냈다. 자작나무 겨우살이(0.
- 다른 겨우살이 분획물들의 세포독성은 20%이하로 나타났으며, 같은 농도에 대하여 aqueous fr. 제외한 4종의 겨우살이 분획물들에서 대부분 50~80%의 암세포 생육저해능이 나타났다.
후속연구
- 한국산 겨우살이 분획물들은 정상세포 대한 독성이 약하고, 면역세포의 생육을 촉진하며, 암세포 생육을 저해하는 효과가 있는 결과로부터 겨우살이는 신체질병에 대한 효과가 기대되며, 앞으로 보다 상세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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