Bacillus subtilis LAM 97-44가 생산하는 항진균성 항생물질의 정제 및 특성 Purification and Characterization of an Antifungal Antibiotic from Bacillus subtilis LAM 97-44원문보기
병원에서 분리한 azole계 항진균성 항생물질에 대한 내성을 가지고 있는 Candida albicans에 대해 강한 활성을 가지는 항진균성 물질을 Bacillus subtilis LAM 97-44의 배양액으로부터 분리 정제한 후 그 특성을 조사하였다. 원심분리한 배양상등액을 butanol 추출, Diaion HP-20과 Dowex-50 adsorption chromatography, silica gel flash chromatography와 HPLC로 정제하였고 TLC와 HPLC로 확인하여 그 물질을 LAM-44A라 명명하였다. LAM-44A는 pH와 열에 매우 안정하였으며 Candida sp., Cryptococcus sp. 등에 대해 강한 활성을 나타낸 반면에 독성은 매우 적었다. 분리한 물질은 273 m에서 최대흡광도를 가진 융점$202^{\circ}C$의 무색분말이었으며 ninhydrin 반응결과 음성이었고 $^1H-NMR$, $^{12}C-NMR$, IR spectrum, 원소분석 등의 결과로 볼 때 분자량 282의 $C_{14}H_{34}O_5$의 화학식을 가진 물질로 동정되었다.
병원에서 분리한 azole계 항진균성 항생물질에 대한 내성을 가지고 있는 Candida albicans에 대해 강한 활성을 가지는 항진균성 물질을 Bacillus subtilis LAM 97-44의 배양액으로부터 분리 정제한 후 그 특성을 조사하였다. 원심분리한 배양상등액을 butanol 추출, Diaion HP-20과 Dowex-50 adsorption chromatography, silica gel flash chromatography와 HPLC로 정제하였고 TLC와 HPLC로 확인하여 그 물질을 LAM-44A라 명명하였다. LAM-44A는 pH와 열에 매우 안정하였으며 Candida sp., Cryptococcus sp. 등에 대해 강한 활성을 나타낸 반면에 독성은 매우 적었다. 분리한 물질은 273 m에서 최대흡광도를 가진 융점 $202^{\circ}C$의 무색분말이었으며 ninhydrin 반응결과 음성이었고 $^1H-NMR$, $^{12}C-NMR$, IR spectrum, 원소분석 등의 결과로 볼 때 분자량 282의 $C_{14}H_{34}O_5$의 화학식을 가진 물질로 동정되었다.
A novel antifungal antibiotic for azole-resistant Candida albicans was purified from the culture broth of Bacillus subtilis LAM 97-44 by butanol extraction, Diaion HP-20 and Dowex-50 adsorption chromatography, silica gel flash chromatography followed by HPLC and designated LAM-44A. LAM-44A was stabl...
A novel antifungal antibiotic for azole-resistant Candida albicans was purified from the culture broth of Bacillus subtilis LAM 97-44 by butanol extraction, Diaion HP-20 and Dowex-50 adsorption chromatography, silica gel flash chromatography followed by HPLC and designated LAM-44A. LAM-44A was stable for 60 min at $100^{\circ}C$, and pH range from 2 to 10. MIC values were observed at $0.5-3.5\;{\mu}g/ml$ against various Candida albicans strains. The antibiotic showed no cytotoxicity for S180, MKN-45, P388, HeLa and 373 at the concentration of 1 mg/ml. LAM-f4A was colorless powder soluble in water, methanol, ethanol, butanol and negative to ninhydrin reaction. The antibiotic had maximum absorption at 273 nm in methanol, and melting point was $202^{\circ}C$. The molecular weight and formula were determined to be 282 and $C_{14}H_{34}O_5$ by $^1H-NMR,\;^{13}C-NMR$, IR spectrum and elemental analysis.
A novel antifungal antibiotic for azole-resistant Candida albicans was purified from the culture broth of Bacillus subtilis LAM 97-44 by butanol extraction, Diaion HP-20 and Dowex-50 adsorption chromatography, silica gel flash chromatography followed by HPLC and designated LAM-44A. LAM-44A was stable for 60 min at $100^{\circ}C$, and pH range from 2 to 10. MIC values were observed at $0.5-3.5\;{\mu}g/ml$ against various Candida albicans strains. The antibiotic showed no cytotoxicity for S180, MKN-45, P388, HeLa and 373 at the concentration of 1 mg/ml. LAM-f4A was colorless powder soluble in water, methanol, ethanol, butanol and negative to ninhydrin reaction. The antibiotic had maximum absorption at 273 nm in methanol, and melting point was $202^{\circ}C$. The molecular weight and formula were determined to be 282 and $C_{14}H_{34}O_5$ by $^1H-NMR,\;^{13}C-NMR$, IR spectrum and elemental analysis.
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문제 정의
LAM 97-44를 분리하였다. 전보경에서는 균의 분리 및 동정과 생산조건의 최적화 등에 관해 발표하였으며, 본보에서는 물질의 특성에 관해 보고하고자 한다.
제안 방법
0 X 30cm)에 충전한 후 chloroform-methanol을 90 :10-0:100%(v/v)의 10%차의 비율로 각 농도별로 300 m/씩 가압용출시켰다. 40:60 혼합용액에서 얻어진 활성분획을 감압농축한 후 HPLC(Waters 484)를 이용하여 최종 정제하였다. 이때 사용한 column은 YMC-pack siHca colunm (2.
항진균성 물질의 정제. Bacillus subtilis LAM 9741가 생산하는 항진균성 항생물질을 정제하기 위하여 원심분리한 배양상등액에 동량의 수포화 butamol을 넣어 1시간 진탕 추출하였으며, 같은 조작을 3회 반복한 후 농축한 다음 소량의 물에 녹여 정제에 사용하였다. 먼저 Diaion HP-20 흡착 chromatography를 한결과 10% methanol로 용출시킨 분획에서 항진균활성이 있었다.
항진균성 항생물질의 정제. Bacillus subtilis LAM 9744가 생산하는 항진균성 항생물질을 정제하기 위하여 배양액 5l을 4℃, IQOOOXg에서 15분간 원심분리하였다. 상등액에 동량의 수포화 butanol을 첨가하여 1시간 진탕 추출하였으며, 같은 조작을 3회 반복한 후 모아서 감압냉동건조한 다음 정제에 사용하였다.
5 N NHQH로 용출한 활성분획을 silica gel column chromatography를 하였다. Chloroform/methanol (90:10, v/v)용액으로 가압 용출하여 얻은 활성분획을 HPIjC로 정제하였다. YMC-Pack silica column (2X25 cm)을 사용하여 butanol/dioxane/water (95:5:0.
UV spectrum은 LAM-44A를 methanol 에 녹여 UV spectrophotometer(Shimadzu UV -120A)를 사용하여 측정하였으며 IR spectrum은 KBr pellet으로 만든 다음 Biorad DigUab FTS-20/80으로 측정하였고 Perkin-Elmer Model 240C를 이용하여 원소분석 하였으며 Fisher melting point analyzer로 융점을 측정하였다. !H-NMR spectrum은 LAM-44A를 DQ에 녹여서, 13C-NMR spectrum은 pyridine-d5에 녹여 Broker Model 600을 사용하여 모두 400 MHz의 자기장에서 측정하였다.
물리화학적 특성조사. TLC를 위해서 silica gel TLC plate(Merck F254 0.2 mm)를 사용하였으며 전개용매로는 Table 3의 용매를 사용하였고 실온의 밀폐용기에서 전개시킨 spot는 자외선 아래에서 관찰하였다. UV spectrum은 LAM-44A를 methanol 에 녹여 UV spectrophotometer(Shimadzu UV -120A)를 사용하여 측정하였으며 IR spectrum은 KBr pellet으로 만든 다음 Biorad DigUab FTS-20/80으로 측정하였고 Perkin-Elmer Model 240C를 이용하여 원소분석 하였으며 Fisher melting point analyzer로 융점을 측정하였다.
2 mm)를 사용하였으며 전개용매로는 Table 3의 용매를 사용하였고 실온의 밀폐용기에서 전개시킨 spot는 자외선 아래에서 관찰하였다. UV spectrum은 LAM-44A를 methanol 에 녹여 UV spectrophotometer(Shimadzu UV -120A)를 사용하여 측정하였으며 IR spectrum은 KBr pellet으로 만든 다음 Biorad DigUab FTS-20/80으로 측정하였고 Perkin-Elmer Model 240C를 이용하여 원소분석 하였으며 Fisher melting point analyzer로 융점을 측정하였다. !H-NMR spectrum은 LAM-44A를 DQ에 녹여서, 13C-NMR spectrum은 pyridine-d5에 녹여 Broker Model 600을 사용하여 모두 400 MHz의 자기장에서 측정하였다.
먼저 Diaion HP-20 흡착 chromatography를 한결과 10% methanol로 용출시킨 분획에서 항진균활성이 있었다. 이 분획을 0.5 N HC1 로 처리한 Dowex-50수지에 흡착시킨 후 0.5 N NHQH로 용출한 활성분획을 silica gel column chromatography를 하였다. Chloroform/methanol (90:10, v/v)용액으로 가압 용출하여 얻은 활성분획을 HPIjC로 정제하였다.
40:60 혼합용액에서 얻어진 활성분획을 감압농축한 후 HPLC(Waters 484)를 이용하여 최종 정제하였다. 이때 사용한 column은 YMC-pack siHca colunm (2.0X25.0 cm, YMC, Japan)이었으며 butanol/dioxane/water (95:5: 0.1, v/v) 혼합용매를 사용하여 분당 2.5 m/ 속도로 용출하였으며 활성물질은 UV detecter 250nm에서 검출되는 peak를 분획하여 항진균활성을 측정하면서 정제하였다(Fig. 1).
사용하였다. 정제항생물질을 물에 녹인 후 매일 10 mg씩 꼬리에 정맥주사하면서 체중을 측정하여 5마리의 평균치로 비교 검토하였다.
항진균성 항생물질의 정제 및 성질을 위한 항진균활성의 측정은 paper disc 방법으로 하였다. 직경 6 mm disc에 시료용액 30μl을 흡수시킨 후 건조시켜, 시험균주인 Candida albicans IFO 0583을 도말한 Mueller-Hinton 한천평판배지에 올려놓은 다음 30℃에서 24시간 배양한 후 생긴 생육저지대의 크기를 관찰하였다. 항균 spectrum은 한천희석법으로 각 시험균에 대한 Minimal Inhibitory Concentration(MIC)을 측정하여 조사하였다.
대상 데이터
생체 내 독성검사는 쥐 (185-190 g)를 이용하였으며 각 구당 5마리를 사용하였다. 정제항생물질을 물에 녹인 후 매일 10 mg씩 꼬리에 정맥주사하면서 체중을 측정하여 5마리의 평균치로 비교 검토하였다.
사용균주 및 배양. 실험에 사용한 균주는 시내의 S, St.K 등의 병원에서 분리한 azole계 항생물질에 대해서 내성이 비교적 큰 Candida albicans에 강한 활성을 가진, 토양으로부터 분리한 Bacillus subtilis LAM 97-44이며, 항진균성 항생물질을 생산하기 위해서 1.2% glucose, 0.8% glycerol, 0.1% malt extract, 0.2% NH4H2PO4, 0.1% 0.02%MgS04 · 7H2O, 0.03% FeSO4 - 71^0 (pH 7.0) 조성의 배지 31 을 5l fermenter(Mituwa KMJ-5S)에 넣고 전배양액을 2% 수준으로 접종하여 통기 량 1 vvm, 교반속도 250rpm으로 30℃에서 5일간 배양한 후 원심 분리하여 그 상등액을 사용하였다.
41 peak에 항진균활성이 있었다. 이렇게 정제한 시료를 HPLC로 분석한 결과 완전히 정제되었음을 알 수 있었으며(Fig. 2), 각각을 LAM-44A와 B라 명명하고 이하의 실험에서는 정제된 시료 LAM-44A를 사용하였다.
이론/모형
직경 6 mm disc에 시료용액 30μl을 흡수시킨 후 건조시켜, 시험균주인 Candida albicans IFO 0583을 도말한 Mueller-Hinton 한천평판배지에 올려놓은 다음 30℃에서 24시간 배양한 후 생긴 생육저지대의 크기를 관찰하였다. 항균 spectrum은 한천희석법으로 각 시험균에 대한 Minimal Inhibitory Concentration(MIC)을 측정하여 조사하였다.
항진균활성측정. 항진균성 항생물질의 정제 및 성질을 위한 항진균활성의 측정은 paper disc 방법으로 하였다. 직경 6 mm disc에 시료용액 30μl을 흡수시킨 후 건조시켜, 시험균주인 Candida albicans IFO 0583을 도말한 Mueller-Hinton 한천평판배지에 올려놓은 다음 30℃에서 24시간 배양한 후 생긴 생육저지대의 크기를 관찰하였다.
성능/효과
항생물질의 물리화학적 특성. Bacillus subtilis LAM 9744가 생산하는 항진균성 항생물질 LAM-44A의 이화학적 특성은 Table 3에 나타난 바와 같이 무색의 분말로 melting point는 202℃이었으며 물, methanol, ethanol, butanol, dioxane, pyridine에는 잘 용해하였으나 acetone, chloroform, ethyl ether, butyl acetate, benzene, hexane 등에는 녹지 않아서 극성이 큰 물질로 판단되었다. R/치는 dioxane-isopropanol- water (90: 10: 0.
8에 있는 13C-NMR spectnim에서 10-16개의 탄소 signal이 관측되었다. LAM-44A의 원소분석결과 C 59.36%, H 12.37%, O 28.27%로 나타나 위의 이화학적 특성 및 기기분석결과와 종합하여 볼 때C14H34O5의 화학식을 가지는 열에 안정한 분자량이 적은 물질임을 알 수 있었다.
Bacillus subtilis LAM 9744가 생산하는 항진균성 항생물질 LAM-44A의 이화학적 특성은 Table 3에 나타난 바와 같이 무색의 분말로 melting point는 202℃이었으며 물, methanol, ethanol, butanol, dioxane, pyridine에는 잘 용해하였으나 acetone, chloroform, ethyl ether, butyl acetate, benzene, hexane 등에는 녹지 않아서 극성이 큰 물질로 판단되었다. R/치는 dioxane-isopropanol- water (90: 10: 0.1) 에 서 0.37, acetonitrile-butanol-water(80: 20 :0.1)에서0.63, butanol-methanol-water(40 : 40:20)에서 0.65였으며 ninhydrin 반응결과가 음성이었으므로 Bacillus subtilis가 생산하는 항진균성 항생물질인 iturins,l4-16) baciilomycins17-18)와 mycosubtilins19, 20) 등과는 달리 아미노산은 물론이고 아민기도 없는 것으로 나타났다.
정제된 항진균성 항생물질 LAM-44A의 임상적으로 분리한 azole 내성 Candida albicans를 비롯한 효모, 곰팡이, 세균 등의 각종 미생물에 대한 최소생육억제농도(MIC)를 조사한 결과는 Table 1과 같다. 즉 LAM-44A는 세균에 대해서는 높은 농도에서만 어느 정도 항균활성이 있었으나 Aspergillus oryzae, A. /Zows외의 곰팡이에 대해서는 활성이 없었다. 그러나 병원에서 임상적으로 분리한 azole 내성 C.
에서 얻은 신규 항진균성 항생물질인 cispentacin9,10)과 유도체11)에 비해서는 넓었으나 azorybacilin'g에 비해서는 좁은 항균범위였으나 그 2종류의 항진균성 물질과 최소생육억제농도는 유사하였다. 한편 독성검사를 위하여 MTT법으로 in vitro 세포독성을 측정한 결과 Sarcoma 180, MKN-45, P388, HeLa, 3T3, mouse spleen cell 등의 사용한 모든 세포주에 대하여 1 mg/mZ의 농도에서 전혀 독성을 나타내지 않았으며(데이터 미제시) 쥐를 이용한 급성 독성조사에서도 Table 2에서 보는 바와 같이 체중의 차이가 거의 없었기 때문에 독성이 없거나 적은 것으로 판단되었다.
항진균성 항생물질의 열안정성. 항진균성 물질 LAM-44A 를 lo^g/mz 농도로 해서 larc, i2rc에서 60분간 처리하면서 열처리 시간에 따른 잔존활성도를 측정한 결과는 Fig. 4에서 보는 바와 같이 1CXFC에서 60분간 처리하여도 약 95% 이상의 활성을 유지하였으므로 본 물질은 기지의 항진균성 물질에 비해서 열에 매우 안정하다는 것을 알 수 있었다.7,8)
항진균성 항생물질 LAM-44A의 methanol 용액은 273 nm에서 최대흡광도를 보였고 (Fig. 5), IR spectrum은 Fig. 6과 같이 3432cm-1의 peak는 hydroxyl기를 보여주며 1734.1 cm-1의 peak는 carbonyl기를 나타내고 1600 peak는 탄소와 탄소의 이중결합이 1384.2 cm^1 peak는 C-0결합.이 있음을 보여준다.
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