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문제 정의
- 따라서 본 연구는 전통 발효주로부터 생리활성 물질인 glutathione을 다량으로 함유하는 식용 가능한 효모 균주를 분리하고, glutathione 최적 생산조건을 확립하여 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 균주의 분리. Glutathione 고함유 효모 균종을 분리할 목적으로 부산광역시 금정구 금정산성 일대에서 전통 쌀막걸리를 수집하여 시판 YM(glucose 1.0%, peptone 0.5%, yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%) 고체배지에 도말한 다음 30℃에서 2~3일간 배양한 후 생성된 단일 colony로부터 효모로 추정되는 균주를 1차 분리하였다. 1차 분리된 균주를 YM 액체배지에 각각 접종한 후 301에서 2일간 진탕 배양하였다.
- 1 ml를 첨가하여 3CFC에서 5분간 방치한 후에 412nm에서 흡광도를 측정하였다. NADPH 용액 첨가 전후의 흡광도 차이를 구하여 작성된 표준곡선으로부터 glutathione 함량을 정량하였다.
- 배양온도에 따른 glutathione 의 생산조건. Sacchammyces cerevisiae FF-8의 온도 변화에 의한 균체의 생육 및 glutathione 생산량을 검토하기 위해 YM 배지를 20, 25, 30, 35 및 40℃에서 각각 72시간 진탕 배양한 결과는 Fig. 3과 같다. 균체의 생육과 glutathione 생산량은 30℃에서 최대 함량을 나타내었으며 30℃ 이상의 온도에서는 glutathione 생산량이 급격하게 감소하였다.
- 교반속도에 따른 glutathione의 생산조건. Saccharomyces cerevisiae FF-8의 교반속도에 따른 균체의 생육 및 glutathione 생산량을 검토하기 위해 YM 배지를 사용하여 30℃에서 0, 50, 100, 150 및 200 rpm으로 각각 72시간 배양한 결과는 Fig. 4 와 같다. 균체의 생육은 shaking rate 가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였지만, glutathione 생산량은 교반속도 100rpm에서 최대량을 나타내었으며 그 이상의 교반속도에서는 감소하는 경향을 나타내었다.
- 4)에 1% 농도가 되게 녹인 osmic acid(OsQj) 용액으로 41에서 24시간 동안 처리하 여 고정시켰다. 고정된 sample에서 용액을 제거한 뒤에 50, 70, 80, 90 및 95% 에탄올에서 각각 10분간 2호화씩 탈수시켰다. 탈수한 뒤에 sample을 임계점 건조기에서 건조하고 platinum coating 한 다음 주사 전자 현미경(SEM, JSM-6700F, JEOL, Tokyo, JARXN)으로 형태를 관찰하였다.
- 배양시간에 따른 균체의 생육과 glutathione 생산량을 검토하기 위하여 YM 액체배지에 백금이로 1회 접종하고, 30℃에서 24시간 배양한 전배양액을 동일한 배지에 2% 접종하여 30℃에서 진탕배양하면서 12시간 간격으로 배양액을 취해 균체의 생육과 glutathione 생산량을 측정하였다. 또한, YM 배지를 사용하여 온도(20~40℃), 교반조건 (0~200 rpm) 및 pH(4~10) 변화에 따른 영향을 검토하였다.
- Glutathione 생산조건. 배양시간에 따른 균체의 생육과 glutathione 생산량을 검토하기 위하여 YM 액체배지에 백금이로 1회 접종하고, 30℃에서 24시간 배양한 전배양액을 동일한 배지에 2% 접종하여 30℃에서 진탕배양하면서 12시간 간격으로 배양액을 취해 균체의 생육과 glutathione 생산량을 측정하였다. 또한, YM 배지를 사용하여 온도(20~40℃), 교반조건 (0~200 rpm) 및 pH(4~10) 변화에 따른 영향을 검토하였다.
- 사면배양한 분리균주를 YM 액체배지에 백금이로 1회 접종하고 30℃에서 72시간 진탕배양한 후 배양액을 7,000×g에서 15분간 원심분리 하였다. 분리된 균체를 증류수로 1회 세척하고 80℃에서 24시간동안 항량이 될 때까지 건조시킨 후 각각 균체의 무게를 달리하여 취하고 증류수에 현탁시킨 후 spectrophotometer(UVmini-1240, Shimadzu, Kyoto, JAPAN)를 사용하여 660nm에서 흡광도를 측정한 표준 곡선으로부터 배양액의 건조 균체량을 측정하였다.18)
- , Ltd. 에 의뢰하여 AIP 20C AUX kit 및 균체 지방산 분석(MIDI, Hewlett-Packard model 6890A gas chromatography)으로 동정하였다. 그리고 이 균주를 2% glutaraldehyde(0.
- 고정된 sample에서 용액을 제거한 뒤에 50, 70, 80, 90 및 95% 에탄올에서 각각 10분간 2호화씩 탈수시켰다. 탈수한 뒤에 sample을 임계점 건조기에서 건조하고 platinum coating 한 다음 주사 전자 현미경(SEM, JSM-6700F, JEOL, Tokyo, JARXN)으로 형태를 관찰하였다.16,17)
대상 데이터
- 균주의 분리 및 동정. 부산광역시 금정구 금정산성 일대에서 수집한 전통 쌀막걸리로부터 1차적으로 분리한 균주 중에서 효모로 추정되며 생육이 비교적 우수한 균주 5주를 선별하여 그 중 glutathione 생산능이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하여 본 실험에 사용하였다(Table 1). 최종 선별한 glutathione 생산 균주를 동정하고자 전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과(Fig.
- 배양액을 7,000×g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 회수된 균체에 동일량의 증류수를 가하여 sonicator(F60, Fisher Scientific, USA)로 세포벽을 파괴시킨 것을 시료로 하여 Owens 와 Belcher의 방법15)으로 각 균주의 세포내 glutathione 생산능을 측정하였다. 분리한 균주 중에서 glutathione 생산능이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하여 본 실험에 사용하였다. 균주의 일반적인 계대 배양은 YM 배지를 사용하였다.
이론/모형
- Glutathione의 정량. Owens와 Belcher의 방법15)에 따라 0.2M 인산염 완충용액 (pH 7.1) 2.5 ml, 1.0mM ED1A 0.8 ml, 0.6 mM DTNB 0.03 ml, glutathione reductase(5 unit)와 전처리한 시료 0.2 ml를 혼합한 후 412 nm에서 흡광도를 측정하고 0.2 mM NADPH 용액 0.1 ml를 첨가하여 3CFC에서 5분간 방치한 후에 412nm에서 흡광도를 측정하였다. NADPH 용액 첨가 전후의 흡광도 차이를 구하여 작성된 표준곡선으로부터 glutathione 함량을 정량하였다.
- 1차 분리된 균주를 YM 액체배지에 각각 접종한 후 301에서 2일간 진탕 배양하였다. 배양액을 7,000×g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 회수된 균체에 동일량의 증류수를 가하여 sonicator(F60, Fisher Scientific, USA)로 세포벽을 파괴시킨 것을 시료로 하여 Owens 와 Belcher의 방법15)으로 각 균주의 세포내 glutathione 생산능을 측정하였다. 분리한 균주 중에서 glutathione 생산능이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하여 본 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 배양시간에 따른 균체 생육과 glutathione 생산. YM 배지에서 배양시간에 따른 Sacchammyces cerevisiae FF-8 균주의 생육과 glutathione 생산량을 검토한 결과, Fig. 2에서와 같이 균체의 생육은 배양초기부터 급격히 증가하기 시작하여 배양 72시간에서 최대를 나타내었으며 그 이후부터 점차적으로 감소하는 경향이었다. 이 때 glutathione 생산량은 배양 24시간까지는 균체 생육과 차이를 나타내 보였으나, 36시간부터 급격히 증가하기 시작하여 배양 72시간째에 최대량을 나타내어 균체의 생육과 동일한 양상을 나타내었다.
- 3과 같다. 균체의 생육과 glutathione 생산량은 30℃에서 최대 함량을 나타내었으며 30℃ 이상의 온도에서는 glutathione 생산량이 급격하게 감소하였다. Shinichiro 등20)은 Saccharomyces cerevisiae와 경우 20~40℃의 배양온도에서 glutathione 생산량이 높다고 보고하였고, Tadayuki 등21)은 Candida utilis의 경우 24℃에서 glutathione 생산량이 높다고 보고하였다.
- 4 와 같다. 균체의 생육은 shaking rate 가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였지만, glutathione 생산량은 교반속도 100rpm에서 최대량을 나타내었으며 그 이상의 교반속도에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 진탕함으로써 균체가 응집되지 않고 분산되어 기질과 작용하는 반응면적이 넓어지고 호기성균주로서 산소의 이용성 증대로 균체의 생육은 증가되지만, 과도한 진탕은 오히려 glutathione 생산을 저해하는 것으로 생각되어진다.
- Shinichiro 등20)은 Saccharomyces cerevisiae와 경우 20~40℃의 배양온도에서 glutathione 생산량이 높다고 보고하였고, Tadayuki 등21)은 Candida utilis의 경우 24℃에서 glutathione 생산량이 높다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 분리된 Saccharomyces cerevisiae FF-8 균주는 Saccharomyces cerevisiae의 최적 생산온도와 유사한 결과를 나타내었다.
- 2에서와 같이 균체의 생육은 배양초기부터 급격히 증가하기 시작하여 배양 72시간에서 최대를 나타내었으며 그 이후부터 점차적으로 감소하는 경향이었다. 이 때 glutathione 생산량은 배양 24시간까지는 균체 생육과 차이를 나타내 보였으나, 36시간부터 급격히 증가하기 시작하여 배양 72시간째에 최대량을 나타내어 균체의 생육과 동일한 양상을 나타내었다. 이는 shin 등18)이 분리한 Candida sp.
- 이상의 연구 결과로부터 Saccharomyces cerevisiae FF-8의 glutathione 생산 조건은 YM 배지의 초기 pH를 6으로 조정하고 온도 30℃에서 교반속도 l00rpm으로 72시간 배양하였을 때 glutathione 생산량은 72.0 mg/l이였으며, 건조 균체량은 5.2 g/ml으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 탄소원, 질소원, 무기염류 및 아미노산의 종류별로 Saccharomyces cerevisiae FF-8의 glutathione 생산량에 미치는 영향을 검토하여 최대 생산량을 얻을 수 있는 최적조건을 위한 실험이 앞으로 좀더 구체적으로 이루어져야겠다고 생각되어진다.
- 부산광역시 금정구 금정산성 일대에서 수집한 전통 쌀막걸리로부터 1차적으로 분리한 균주 중에서 효모로 추정되며 생육이 비교적 우수한 균주 5주를 선별하여 그 중 glutathione 생산능이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하여 본 실험에 사용하였다(Table 1). 최종 선별한 glutathione 생산 균주를 동정하고자 전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과(Fig. 1), 분리된 균주는 타원형으로 크기는 4.5×3.4 ㎛(장축×단축)로 비교적 일반적 크기의 효모이었으며,19) 출아흔을 발견할 수 있어 출아법으로 증식함을 알 수 있었다. 한편 분리균의 생리학적인 특성을 API 20C AUX kit로 동정한 결과 Sacchammyces cerevisiam로 동정되었으며 (Table 2), 균체 지방산 분석으로 세포막의 지방산 조성을 분석한 결과 Saccharomyces cerevisae로 재확인되어 본 연구자들에 의해 Sacchammyces cerevisiae FF-8로 명명되었다(Table 3).
- 4 ㎛(장축×단축)로 비교적 일반적 크기의 효모이었으며,19) 출아흔을 발견할 수 있어 출아법으로 증식함을 알 수 있었다. 한편 분리균의 생리학적인 특성을 API 20C AUX kit로 동정한 결과 Sacchammyces cerevisiam로 동정되었으며 (Table 2), 균체 지방산 분석으로 세포막의 지방산 조성을 분석한 결과 Saccharomyces cerevisae로 재확인되어 본 연구자들에 의해 Sacchammyces cerevisiae FF-8로 명명되었다(Table 3).
후속연구
- 이와 같이 glutathione^ 생체 내 에서 여러 가지 생리 및 대사에 관여하고 있기 때문에 부족하게 되면 용혈작용, 중추신경 작용의 영향, 용혈성 빈혈 및 백내장 등의 증상을 나타내기도 한다.13) 현재는 의학분야에서 간질환 치료제, 간기능 회복 및 해독작용 등의 질병치료에 널리 사용되고 있으며, 독성물질의 해독작용에 의한 생체내 산화를 억제시킴으로써 이와 관련한 각종 질환의 유발을 예방할 것으로 생각된다.12,14)
- 최근 들어 유용미생물의 대사산물을 이용하여 각종 질환의 개선 또는 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있는 생리활성물질의 탐색에 관한 연구가 활발히 전개되고 있다.5) 그 중 하나로 간질환 개선효과가 있는 것으로 알려진 glutathione 고함유 유용미생물 균종(효모)의 탐색과 대량 생산조건의 확립으로 glutathione 고함유 효모 균체 생산에 의한 건강보조식품 개발은 간질환의 개선과 예방 및 치료에 유용한 연구결과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다.6,7)
- 2 g/ml으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 탄소원, 질소원, 무기염류 및 아미노산의 종류별로 Saccharomyces cerevisiae FF-8의 glutathione 생산량에 미치는 영향을 검토하여 최대 생산량을 얻을 수 있는 최적조건을 위한 실험이 앞으로 좀더 구체적으로 이루어져야겠다고 생각되어진다.
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