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문제 정의
- 22) 이 중 포도의 주요 polyphenol 성분인 resveratrol은 포도주의 심혈관계 질환 예방 작용의 주요 효능 물질로 여겨지고 있으며 항산화, 항염 증, 암세포 성장 억제 등 다양한 약리 작용이 있는 것으로 알 려지고 있으므로, 포도로부터 resveratrol을 높은 농도로 함유 한 추출물을 확보하여 식품 및 의약품으로 응용하는 데 대하여 많은 관심이 주어지고 있다. 본 논문에서는 포도 관련 산업 고도화의 일환으로 기능성 물질의 확보와 가공을 통한 원료의 고부가가치 창출을 목표로 국내에서 생산되는 대표적인 포도종을 중심으로 추출물을 제조하여 약리활성을 평가하고자 하였다. 일차적으로 거봉 및 캠벨 포도의 씨, 줄기 및 껍질 추출물에 대하여 항산화 작용, 염증 관련 인자 생성에 미치는 활성 및 임세포 성장에 대한 영향 등을 resveratrol과 비교하여 평가하였다.
- 이러한 배경을 바탕으로 하여, 본 논문에서는 국내 포도 관련 산업의 고도화에 기여하기 위하여 국내에서 생산되는 포도의 씨, 껍질 및 송이줄기로부터 추출된 추출물에 대하여 항산화 작용, 염증 관련 인자 생성에 미치는 활성 및 암세포 성장에 대한 영향들의 생리 활성을 측정하였다.
가설 설정
- 1}Free radical scavenging activity of test sample was detennined relative to DMSO-treated control groups. Each value represents mean ± SEM (n=2).
제안 방법
- 4% SRB 용액으로 염색하고 염색된 세포를 10 mM Tris-base(pH 10)를 가하여 용해시킨 다음 515nm에서 흡광도를 측정하였다. 10% DMSO를 처리한 군을 대조군으로 하여, 대조군과 zero-day control의 차이를 기준으로 시료를 처리한 군에서의 세포 생존률을 구하였다.
- 05% tween-20-PBS로 5회 세척하고 Ellmann 시액을 가하여 7시간 동안 배양하고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. PGE2 표준품으로 검량선을 작성하여 각 시료 처리군에서의 PGE2 생성량을 구하였으며, LPS를 처리한 대조군과 LPS를 처리하지 않은 대조군에서 생성된 PGE2 양의 차이를 기준으로 하여 각 시료의 PGE2 생성 억제율을 구하였다.
- 2% sulfanilamide 용액을 같은 비율로 섞은 것)을 180㎕씩 가하여 10분간 가볍게 흔들어 준 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite를 표준 품으로 하여 검량선을 작성하여 시료 처리군에서의 흡광도를 nitrite 의 농도로서 환산하여 정량하였고, LPS를 처리한 대조군과 LPS를 처리하지 않은 대조군에서 생성된 nitrite 양의 차이를 기준으로 하여 각 시료의 NO 생성 저해 활성을 구하였다.
- 분쇄하여 실험에 사용하였다. 각 포도 부위별 분쇄 시료를 에탄올 : 물(8:2, v/v) 용액에 현탁하고 실온에서 47 kHz 의 초음파처리기 (Branson 5210)로 현탁액 1 L당 0.04 kW의 초음파 에너지를 3분간 가하여 추출하고, 원심분리(1Q000X g, 15분) 후 상층액을 감압증발시켜 추출물을 제조하였다.
- 각종 포도 추출물들이 암세포 성장에 어떠한 영향을 미치 는지 알아보기 위하여 사람 폐암세포주인 A549와 대장암세 포주인 Col2를 이용하여 세포 생존율을 관찰하였다. Table 4 및 Fig.
- plate에 넣었다. 그 다음 순수한 에탄올에 녹인 DPPH 용액을 최종 농도가 300㎛이 되도록 가하였다. 이후 37°C 에서 30분 동안 반응시키고 microplate reader(Bio-Rad)를 이용하여 515 run에서 흡광도를 측정하였다.
- 이후 37°C 에서 30분 동안 반응시키고 microplate reader(Bio-Rad)를 이용하여 515 run에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 DMSO 를 사용하였으며 % inhibition은 대조군의 흡광도와 시료의 흡광도를 비교하여 구하였다. 실험결과는 IC50 값으로 표시하여 각 시료의 효력을 평가하였다.
- 7 세포를 phenol red가 포함되어 있지 않은 DMEM에 1 mL 당 5 x1b개가 되도록 현탁하여 24 well plate에 24시간 동안 부착시켰다. 부착된 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 FBS가 함유되어 있지 않은 DMEM을 가하고 LPS(1 |ig/mL)와 시료를 동시에 처리하여 20시간 동안 배양하였다. 이 때 대조군에는 LPS를 처리하지 않았으며 대조군 및 LPS 처리 대조군에는 DMSO를 가하였다.
- 이 때 대조군에는 LPS를 처리하지 않았으며 대조군 및 LPS 처리 대조군에는 DMSO를 가하였다. 시료 처리 후 20시간이 지난 다음 상층액을 회수하여 상층액에 유리된 prostaglandin E^PGED의 양을 다음의 효소면역분석법으로 정랑하였다. 즉, 항-PGE? 항체가 부착되어 있는 plate의 각 well에 회수한 상층 액과 PGE2-acetylcho- linesterase tracer를 넣어 상온에서 18시간 이상 배양한 다음, 각 well을 0.
- 여러 포도 추출물들의 항산화 효능을 알아보기 위하여 수용액 또는 에탄올 중에서 비교적 안정된 자유 라디칼을 형성하는 DPPH를 이용하여 추출물들의 라디칼 소거 능력을 측정하였다. 양성 대조군으로는 vitamin C를 이용하였다.
- 24시간 동안 배양한 후, 부착된 세포를 phosphate-buffered saline(PBS)으로 2 번 세척하고 5% FBS-DMEM을 가하고 LPS(1 jig/mL)와 검색 시료를 동시에 처리하였다. 이 때 대조군에는 LPS를 처리하지 않았으며 대조군 및 LPS 처리 대조군에는 DMSO를 가하였다. 시료 처리 후 20시간이 지난 다음 상층액을 회수하여 상층액에 유리된 prostaglandin E^PGED의 양을 다음의 효소면역분석법으로 정랑하였다.
- 본 논문에서는 포도 관련 산업 고도화의 일환으로 기능성 물질의 확보와 가공을 통한 원료의 고부가가치 창출을 목표로 국내에서 생산되는 대표적인 포도종을 중심으로 추출물을 제조하여 약리활성을 평가하고자 하였다. 일차적으로 거봉 및 캠벨 포도의 씨, 줄기 및 껍질 추출물에 대하여 항산화 작용, 염증 관련 인자 생성에 미치는 활성 및 임세포 성장에 대한 영향 등을 resveratrol과 비교하여 평가하였다. ROS는 세포 내 세포막, 단백질 및 DNA의 손상 및 변이를 일으켜 여러 심혈관계 질환, 퇴행성 질환 및 암의 원인이 되는 것으로 알려져 있으므로, 본 논문에서는 ethanol 용액 중에서 안정된 free radical을 형성하는 DPPH를 이용하여 포도 추출물들의 항산화 능력을 평가 하였는데, 포도 추출물 중 거봉줄기, 캠벨줄기, 캠벨씨 및 거봉씨 추출물들이 DPPH free radical을 소거하는 능력을 나타내었고 그 중 거봉 씨 추출물은 vitamin C와 효력이 유사하게 나타나 항산화 효능이 우수함을 알 수 있었다.
- 포도 추출물들이 inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해 생성되는 NO의 양을 얼마나 감소시키는지를 마우스 대식 세포인 RAW 264.7 cell-1- 이용하여 확인하여 보았다. 실험 결 과, Table 3 및 Fig.
- 시료 처리 후 20시간이 지난 다음 상층액을 회수하여 상층액에 유리된 prostaglandin E^PGED의 양을 다음의 효소면역분석법으로 정랑하였다. 즉, 항-PGE? 항체가 부착되어 있는 plate의 각 well에 회수한 상층 액과 PGE2-acetylcho- linesterase tracer를 넣어 상온에서 18시간 이상 배양한 다음, 각 well을 0.05% tween-20-PBS로 5회 세척하고 Ellmann 시액을 가하여 7시간 동안 배양하고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. PGE2 표준품으로 검량선을 작성하여 각 시료 처리군에서의 PGE2 생성량을 구하였으며, LPS를 처리한 대조군과 LPS를 처리하지 않은 대조군에서 생성된 PGE2 양의 차이를 기준으로 하여 각 시료의 PGE2 생성 억제율을 구하였다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Ea이 e medium(DMEM), minimum essential medium with Earle's salt(MEME), fetal bovine serum, non-essential amino acid solution, L-glutamine, trypsin-EDTA 등은 GIBCO-BRL(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입 하였다, 1, 1 -Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), vitamin C, lipopolysaccharide(LPS), N-( 1 -naphthyl)ethylenediamine, sulfanilamide, sodium nitrite, MTT, sulforhodamine B(SRB) 등은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Pros taglandin E^PGE)와 PGE2-acetylcholinesterase tracer는 Cay man Chemical사(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였고, 항-PGE2 항체는 (주)태평양기술연구원으로부터 제공받아 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Pros taglandin E^PGE)와 PGE2-acetylcholinesterase tracer는 Cay man Chemical사(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였고, 항-PGE2 항체는 (주)태평양기술연구원으로부터 제공받아 사용하였다.
- 마우스 대식세포주인 RAW 264.7은 10% FBS가 함유된Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)에서 37℃, 5%CO2 조건 흐]에서 계대 배양하였고, 사람 폐암세포주인 A549 및 대장암세포주인 Col2는 10% FBS가 포함된 minimum essential medium with Earle's salt(MEME)를 이용하여 같은조건에서 계대 배양하였다.
- 사람 폐암세포주인 A549 및 대장암세포주인 Col2를 1mL 당 개가 되도록 MEME 배지로 희석하여 시료와 함께 96 well plate에 넣고 3일 동안 배양하였다. 또한 최소 16 well에 세포현탁액을 넣고 30분 동안 배양하여 zero-day con- trol로 하였다.
- 수확적기에 생산된 거봉(천안, 2001년 9월산)과 캠벨(영동, 2001년 9월산)을 껍질, 씨 및 송이줄기로 분리하여 냉동건조후 분쇄하여 실험에 사용하였다. 각 포도 부위별 분쇄 시료를 에탄올 : 물(8:2, v/v) 용액에 현탁하고 실온에서 47 kHz 의 초음파처리기 (Branson 5210)로 현탁액 1 L당 0.
- 양성 대조군으로는 vitamin C를 이용하였다. 그 결과 Table 1 및 Fig.
데이터처리
- 평균값± SEM으로 구하였다. 또한 대조군과 처치 군의 차이는 Student's Atest로 비교하였으며 대조군과 비교하여 p<0.05일 때 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
- 모든 시험은 적어도 2회 이상 반복하였고, 그 결과는 반복시험에서의 평균값± SEM으로 구하였다. 또한 대조군과 처치 군의 차이는 Student's Atest로 비교하였으며 대조군과 비교하여 p<0.
- 대조군으로 DMSO 를 사용하였으며 % inhibition은 대조군의 흡광도와 시료의 흡광도를 비교하여 구하였다. 실험결과는 IC50 값으로 표시하여 각 시료의 효력을 평가하였다.
성능/효과
- 일차적으로 거봉 및 캠벨 포도의 씨, 줄기 및 껍질 추출물에 대하여 항산화 작용, 염증 관련 인자 생성에 미치는 활성 및 임세포 성장에 대한 영향 등을 resveratrol과 비교하여 평가하였다. ROS는 세포 내 세포막, 단백질 및 DNA의 손상 및 변이를 일으켜 여러 심혈관계 질환, 퇴행성 질환 및 암의 원인이 되는 것으로 알려져 있으므로, 본 논문에서는 ethanol 용액 중에서 안정된 free radical을 형성하는 DPPH를 이용하여 포도 추출물들의 항산화 능력을 평가 하였는데, 포도 추출물 중 거봉줄기, 캠벨줄기, 캠벨씨 및 거봉씨 추출물들이 DPPH free radical을 소거하는 능력을 나타내었고 그 중 거봉 씨 추출물은 vitamin C와 효력이 유사하게 나타나 항산화 효능이 우수함을 알 수 있었다. ROS와 더불어 PGs 및 NO 와 같은 염증 반응 매개체들도 과다하게 생성될 경우 각종 질환의 원인으로 알려져 있으므로, 마우스 대식세포주인 RAW 264.
- ROS는 세포 내 세포막, 단백질 및 DNA의 손상 및 변이를 일으켜 여러 심혈관계 질환, 퇴행성 질환 및 암의 원인이 되는 것으로 알려져 있으므로, 본 논문에서는 ethanol 용액 중에서 안정된 free radical을 형성하는 DPPH를 이용하여 포도 추출물들의 항산화 능력을 평가 하였는데, 포도 추출물 중 거봉줄기, 캠벨줄기, 캠벨씨 및 거봉씨 추출물들이 DPPH free radical을 소거하는 능력을 나타내었고 그 중 거봉 씨 추출물은 vitamin C와 효력이 유사하게 나타나 항산화 효능이 우수함을 알 수 있었다. ROS와 더불어 PGs 및 NO 와 같은 염증 반응 매개체들도 과다하게 생성될 경우 각종 질환의 원인으로 알려져 있으므로, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell을 이용하여 포도 추출물들의 LPS 처리에 의한 PGE2 및 NO 생성을 저해하는지를 확인하였으며, 그 결과 거봉 줄기, 거봉씨, 및 캠벨씨 추출물이 50[MmL에서 PGE2 및 NO 생성을 50% 가량 저해하는 효능을 나타내었다. 한편, resver- atrol이 암세포 성장을 억제하는 효능을 가지고 있다는 여러 연구 보고에 따라 사람 폐암 및 대장암 세포주를 이용하여 포도 추출물들이 암세포 성장 저해 효과를 나타내는지를 확인하였는데 거봉줄기 및 씨 추출물 50|ig/mL에서 30% 정도의 암세포 성장 저해 작용을 나타내었다.
- 각종 포도 추출물들이 암세포 성장에 어떠한 영향을 미치 는지 알아보기 위하여 사람 폐암세포주인 A549와 대장암세 포주인 Col2를 이용하여 세포 생존율을 관찰하였다. Table 4 및 Fig. 4에서 나타난 것과 같이, 50μg/mL에서 거봉줄기 및 거봉씨 추출물은 폐암세포의 성장을 대조군에 비하여 30% 가량 억제하였고, 결장암세포의 성장은 20~30% 정도 억제하 는 효과가 있는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 resveratrol 20μM에서의 암세포 성장 저해 효과와 유사하였다.
- 2에 나타난 바와 같이, 포도 추출물들은 50|ig/mL의 농도에서 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의한 pros taglandin E/PGE?)의 생성을 억제하였다. 거봉줄기, 거봉씨, 캠벨씨 추출물은 50|ig/mL에서 60-70% 정도의 PGE2 생성억제 효과를 나타내었고, 캠벨줄기 추출물은 40% 정도의 억제율을 나타내었다. 양성 대조군으로 사용된 celecoxib 및 resveratrol은 IC5O이 각 0.
- 양성 대조군으로는 vitamin C를 이용하였다. 그 결과 Table 1 및 Fig. 1에 나타난 바와 같이 거봉줄기, 캠벨 줄기, 캠벨씨 및 거봉씨 추출물들은 500 μg/mL에서 70-80% 정도의 프리 라디칼 소거능을 나타내었다. 이 중 거봉줄기, 캠벨씨, 거봉씨 추출물들은 IC50 값이 20ng/mL 전후로 나타나 resveratrol(IC5()=34.
- 7 cell-1- 이용하여 확인하여 보았다. 실험 결 과, Table 3 및 Fig. 3에서 알 수 있듯이 거봉줄기와 거봉씨 추출물들은 50μg/mL에서 NO 생성을 50% 정도 저해하였고, 캠벨씨 추출물도 약간의 NO 생성 저해 작용을 나타내었다. 이 실험조건에서 resveratrol은 IC50이 2.
- 1에 나타난 바와 같이 거봉줄기, 캠벨 줄기, 캠벨씨 및 거봉씨 추출물들은 500 μg/mL에서 70-80% 정도의 프리 라디칼 소거능을 나타내었다. 이 중 거봉줄기, 캠벨씨, 거봉씨 추출물들은 IC50 값이 20ng/mL 전후로 나타나 resveratrol(IC5()=34.6|ig/mL)보다 항산화 작용이 우수하였고, 특히 거봉씨 추출물은 vitamin C와 거의 유사한 효력을 나타내었다.
후속연구
- 그러나 포도 추출물들의 항산화 효과와는 달리 염증 반응 매개체 생성 및 암세포 성장 저해 효과는 resveratrol에 비하여 그 활성이 떨어지는 결과가 나왔는데 이는 포도 추출물의 정제가 아직 완전하지 못하여 유효 성분의 세포 내 침투 능력이 resveratrol에 비하여 떨어지기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 유효 추출물들의 정제를 통하여 resveratrol과 유사한 작용을 나타낼 수 있는 추출물의 획득이 이루어질 수 있을 것으로 생각되며, 이에 따라 포도 추출물들은 resveratrol에서 기대되는 항산화, 항염증 및 암예방 효능을 지닐 수 있는 기능성 식품 및 의약품의 원료로서의 다양하게 이용될 수 있을 것으로 전망된다.
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