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문제 정의
- 본 연구에서는 동충하초의 포자가 번데기와 같은 기주에 침투하기 위하여 큐티클 증의 키틴을 분해시키는 chitinase가 생성될 것으로 예측하고, 예비실험을 통한 키틴의 팽윤 현상이 균사에 의한 것인지 단순히 물에 의한 수화 현상인지를 밝히기 위한 기초연구로서 chitinase를 분리 정제, 확인한 다음, 최적 pH, pH 안정성, 최적 온도, 열 안정성, 겉보기 분자량, Km 값, 금속이온, 음이온 및 유기물 효과 그리고 기질 분해 특이성 등을 실험하였기에 이에 보고한다.
제안 방법
- 7H2O, CaCl2 . 2H2O 및 K2SO4, 음이온으로 Na2CO3, Na2SO4 및 NaCN 이온을 각각 10 mM씩 가하여 5분 동안 전처리한 다음 최적 조건 하에서 활성도 변화를 측정하였다. 그리고 효소 단백질의 아미노산 잔기와 선택적으로 반응하는 sodium cyanate(Stark, 1988), maleic anhydride(Butler and Hartley, 1988), acetic anhydride(Riordan and Vallee, 1988) 및 N- bromo succinimide(Spande and Witkop, 1988)를 각각 1 mM씩 가하여 같은 방법으로 활성도 변화를 측정하였다.
- Km 값은 이 효소의 최적 조건 하에서 기질인 NAG 6의 농도를 0.1에서 10.0 mM까지 변화시켜 이 효소 용액 0.2 ml를 각각 가하여 위와 같은 방법으로 그 활성도를 측정한 다음 Lineweaver-Burk double reciprocal plot하여 결정하였다.
- 최적 온도는 최적 pH 하에서 15℃에서 50℃까지 온도를 각각 변화시켜 그 활성도를 측정하였다. pH 안정성은 0.05 M의 시트르산 완충용액 ,0.05 M의 인산 완충용액 및 0.05 M Tris-HCl 완충용액을 사용하여 pH 2.5에서 9.5까지 pH를 각각 변화 시켜 이에 효소 용액 0.2 ml를 가하여 30분 동안 전처리한 다음, 위와 같은 방법으로 pH 안정성을 측정하였다. 이 효소의 열안정성은 효소 용액을 10℃에서 60℃까지 온도를 각각 변화시켜 효소 용액 0.
- 2H2O 및 K2SO4, 음이온으로 Na2CO3, Na2SO4 및 NaCN 이온을 각각 10 mM씩 가하여 5분 동안 전처리한 다음 최적 조건 하에서 활성도 변화를 측정하였다. 그리고 효소 단백질의 아미노산 잔기와 선택적으로 반응하는 sodium cyanate(Stark, 1988), maleic anhydride(Butler and Hartley, 1988), acetic anhydride(Riordan and Vallee, 1988) 및 N- bromo succinimide(Spande and Witkop, 1988)를 각각 1 mM씩 가하여 같은 방법으로 활성도 변화를 측정하였다.
- 기질로 농도가 5 mg/mZ인 NAG6, PNP-NAG2 및 PNP- NAG3의 각 수용액에 효소 용액 0.1 ml를 각각 가하여 최적 조건 하에서 위와 같은 방법으로 반응시킨 다음, syringe 여과하여 분해 생성물을 TLC로 확인하였다. 이때 표준 물질로 PNP, NAG, NAG2, 및 NAG3를 사용하였고, 전개 용매로 butanol: pyridine : water(4.
- 45 M 사이에서 용출됨을 알 수 있었다. 또한 Sephadex G-50 겔 여과하여 얻은 결과는 Fig. 3(a)와 같고, 이 활성분획을 따로 모아 재크로마토그래피하여 순수 정제하였다. 정제된 효소 단백질을 SDS-PAGE한 결과는 Fig.
- 배양액 7.8 J를 5,000Xg에서 10분 동안 원심분리하여 상층액 7.45 l를 취한 후 황산암모늄으로 60% 포화시키고 원심분리하여 침전물을 제거한 다음, 이 상층액에 다시 황산암모늄을 가하여 80% 포화시킨 후 원심분리하여 얻은 단백질 침전물을 0.02 M 인산 완충용액(pH 6.2)으로 용해시키고, 이를 같은 완충용액으로 3일 동안 투석 (Dialysis sacks, M.W>12,000, Sigma Inc.)하여 황산암모늄을 제거하고, ultrafiltration stirred cell(Amicon Inc., model 8400)을 이용하여 농축한 후 DEAE-Sephadex A-25 column(2.5×25 cm)에 loading하고 0.02 M 인산완충용액 (pH 6.2) 1 Z와 0.8 M의 NaCl이 포함된 같은 완충용액 11로 선형 농도 기울기 크로마토그래피하였다. 이때 매 분당 0.
- 변형 HM배지 8, 를 고압수증기 멸균(autoclave; Johnsam Co., model JS-AC-60)한 후 PDA 배지에서 배양한 C. militaris 균사 30절편을 접종하고, 13일 동안 배양기 (Biostat E, B. Braun) 중에서 배양하였다. 배양 기간 동안 O.
- 본 실험에서 얻은 이 효소의 기질 분해 특이성을 확인하기 위하여, 각 표준 물질 및 기질로 PNP-NAG2, PNP- NAG3 및 NAG6를 각각 사용한 이 효소와의 반응에서 얻은 분해산물의 Rf 값은 Fig. 6과 같다. 그림 에서 보는 바와 같이 Rf 값 0.
- 2 ml를 가하여 30분 동안 전처리한 다음, 위와 같은 방법으로 pH 안정성을 측정하였다. 이 효소의 열안정성은 효소 용액을 10℃에서 60℃까지 온도를 각각 변화시켜 효소 용액 0.2ml를 가하여 30분 동안 열처리한 다음, 최적 pH 및 최적 온도 하에서 이 효소의 활성도를 측정하였다.
- 이때 환원당의 양은 NAG 표준 검량곡선에 의하여 산출하였다. 이 효소의 활성도 단위는 pH 5.5, 35℃에서 매분 당 1 μg의 환원당을 생성하는 효소의 양을 1단위로 하였다.
- 이상에서 C. militaris의 배양액으로부터 키틴 분해 효소를 분리 정제하여 그 효소적 특성을 확인하였다.
- 최적 pH는 0.05 M의 시트르산 완충용액과 0.05 M의 인산 완충용액을 사용하여 3.0에서 8.0까지 pH를 각각 변화 시켜 활성도 변화를 측정하였다. 최적 온도는 최적 pH 하에서 15℃에서 50℃까지 온도를 각각 변화시켜 그 활성도를 측정하였다.
- 0까지 pH를 각각 변화 시켜 활성도 변화를 측정하였다. 최적 온도는 최적 pH 하에서 15℃에서 50℃까지 온도를 각각 변화시켜 그 활성도를 측정하였다. pH 안정성은 0.
- 8 ml의 유속으로 5 ml씩 분취하였다. 활성 분획을 따로 모아 같은 방법으로 투석한 다음, 농축하여 1차 정제된 chitinase 용액을 얻었으며, 이를 Sephadex G-50 col- umn(2.6X 38 cm)에 loading하여 0.02 M 인산 완충용액 (pH 6.2)으로 겔 여과하였다. 이때 매 분당 0.
대상 데이터
- 50171)는 농촌진흥청으로부터 분양받아 사용하였다. Bacto potato dextrose agar(PDA) 및 yeast extracts는 Difco 제품을 사용하였으며, hexa-N-acetylchitohexaose (NAG6)는 Seikagaku사 제품을, p-nitrophenol(PNP), p- nitrophenyl-N, N'-diacetylchitobiose(PNP-NAG2), p-nitro- phenyl-N, N', N"-triacetylchitotriose(PNP-NAG3), N-acetyl glucosamine(NAG), N, N'-diacetylchitobiose(NAG2) 및 N, N', N"-triacetylchitotriose(NAG3), DEAE-Sephadex A- 25, Sephadex G-50 및 chitine Sigma 제품을, thin-layer chromatography(TLC) plate(silica gel 60, F254)t Merck 제품을, colloidal chitine Hsu와 Lockwood(1975)의 방법에 따라 제조하여 사용하였고, 그 외의 모든 시약은 분석용 특급 시 약을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 Cordyceps militaris 균주(KACC NO. 50171)는 농촌진흥청으로부터 분양받아 사용하였다. Bacto potato dextrose agar(PDA) 및 yeast extracts는 Difco 제품을 사용하였으며, hexa-N-acetylchitohexaose (NAG6)는 Seikagaku사 제품을, p-nitrophenol(PNP), p- nitrophenyl-N, N'-diacetylchitobiose(PNP-NAG2), p-nitro- phenyl-N, N', N"-triacetylchitotriose(PNP-NAG3), N-acetyl glucosamine(NAG), N, N'-diacetylchitobiose(NAG2) 및 N, N', N"-triacetylchitotriose(NAG3), DEAE-Sephadex A- 25, Sephadex G-50 및 chitine Sigma 제품을, thin-layer chromatography(TLC) plate(silica gel 60, F254)t Merck 제품을, colloidal chitine Hsu와 Lockwood(1975)의 방법에 따라 제조하여 사용하였고, 그 외의 모든 시약은 분석용 특급 시 약을 사용하였다.
- 5% 겔을 사용하여 SDS-PAGE하여 측정하였다. 이때 표준 단백질은 pepsin(M.W. 29,000), egg albumin(M.W. 45,000), bovine serum albumin(M.W. 66,000) 및 β-amylase (M.W. 150,000) (Sigma Co.) 등을 사용하였다.
- 1 ml를 각각 가하여 최적 조건 하에서 위와 같은 방법으로 반응시킨 다음, syringe 여과하여 분해 생성물을 TLC로 확인하였다. 이때 표준 물질로 PNP, NAG, NAG2, 및 NAG3를 사용하였고, 전개 용매로 butanol: pyridine : water(4.3 : 3.0 : 2.7 v/v) 의 혼합용매를, 그리고 발색제로 황산 : 에탄올(1 : 9, v/v) 의 황산용액을 사용하였다.
이론/모형
- 단백질 정량은 Lowry et al.(1951)의 방법을 인용하여 bovine serum albumin(BSA) 표준 검량곡선에 의하여 산출하였다 .
- 균사 배양용 액체 배지는 Roberts와 Cabib(1982)의 방법을 인용하여 탄소원으로 1% colloidal chitin을 첨가한 변형 HM배지 (7당 yeast ext. 3 g, hyponex 3 g, 1% colloidal chitin(dry w/v))를 사용하였다.
- 단백질양과 chitinase의 양이 최대로 증가하는 시간을 알기 위하여 배양하는 동안 매일 일정 시간에 배양액 20ml를 취하여 Warburg-Christian법과 Park과 Johnson (1949)의 방법으로 단백질 양 과 환원당을 각각 정량하여 chtinase 활성도 변화를 측정하였다.
- 이 효소의 분자량은 Hames의 방법(1981)에 따라 7.5% 겔을 사용하여 SDS-PAGE하여 측정하였다. 이때 표준 단백질은 pepsin(M.
- 이 효소의 활성도 측정은 Park과 Johnson 방법 (1949)을 인용하여 효소 용액 0.2 게 기질로 colloidal chitin 현탁액을 정확히 1 ml를 가하여 35℃ 교반 항온조에서 30분 동안 반응시 킨 다음 250℃ oil bath 중에서 5분 동안 정 치하여 반응을 정지시킨 후 syringe 여과(Iso-Disc Filters N-25-4 Nylon, 25 mmX 0.45 /im, Supelco Co.)하고 반응여 액 1 ml에 50 mM sodium carbonate오+ 10 mM potassium cyanide의 혼합용액과 1.5 mM ferricyanide 용액을 각각 1 ml씩 가한 다음 100℃ 물중탕에서 15분간 반응시키고 이에 0.05 N 황산 용액 에 용해시킨 3 mM ammonium ferric sulfate 용액 5 ml를 가하여 실온에서 15분간 정치한 다음 690nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 환원당의 양은 NAG 표준 검량곡선에 의하여 산출하였다.
성능/효과
- 1과 같다. 그림에서 보는 바와 같이 단백질의 양은 배양 9일까지 크게 증가하다가 점차 감소하는 경향을 보였으나, 이 효소 활성도는 10일까지 증가하다가 점차 감소하는 경향을 보여, 이 효소는 배양 9일과 10일 사이에 증가하는 것으로 사려된다. 이와 같은 결과는 St.
- 또한 본 연구에서 얻은 이 효소의 pH 안정성은 pH 3.0 과 8.0 범위에서 30분 동안 그 활성이 안정함을 알 수 있었다. 이 결과는 P- WgabmVww로부터 얻은 효소의 pH 안정성이 pH 4.
- 또한 음이온에 대한 비활성도 변화는 10.0 mM CO;,SO; 및 CN- 이온에 의하여 각각 11.5%, 13.5% 및 35.3% 활성이 억제됨을 알 수 있었다.
- 본 실험에서 얻은 chitinase의 최적 pH, 최적 온도 하에서 NAG6의 기질 농도 변화에 따른 Km 값의 측정 결과는 Fig. 5와 같고, 그 값은 0.57 mM이었다. 이 결과는 P.
- 본 실험에서 얻은 chitinase의 최적 온도는 35.0℃이었다. 이 결괴는 Streptomyces antibioticus와 Streptomyces griseus의 배양액에서 얻은 이 효소의 최적 온도가 40.
- 본 연구에서 얻은 chitinase의 열 안정성은 50.0℃ 이하에서 30분 동안 안정하였으며 60℃에서도 50%의 활성을 유지함을 알 수 있었다. 이 결과는 V.
- , 2000). 이 결과로 부터 NAG6를 기질로 사용한 반응(R-3)에서 chitotriose가 생성되고, PNP-NAG3를 기질로 사용한 반응(R-2)에서는 NAG와 NAG2가 동시에 생성되고, Rf 값 0.80의 PNP- NAG가 생성된 것으로 볼 때 이 효소는 기질을 단계적으로 절단한 것이 아니라 무작위로 분해한 것으로 보이며, 또한 PNP-NAG2와의 반응(R-1)에서 대부분의 기질이 분해되지 않은 결과로부터 이 효소는 endo-형태인 것으로 사료된다.
- 1과 같다. 이 표에서 보는 바와 같이 배양액의 비활성도는 7.02 단위였으나, 황산암모늄 분별 침전, 이온 교환 크로마토그래피 그리고 Sephadex G-50 겔 여과하여 얻은 이 효소의 비활성도는 627.78 단위로, 89.4배 정제되었음을 알 수 있었다.
- 결과는 Table 2와 같다. 표에서 보는 바와 같이 이 효소의 활성도는 10 mM Cu2+, Mn2+, Hg2+ 및 Zn2+ 이온에 대하여 각각 38.0%, 11.1%, 31.1% 및 9.0% 억제되었으나, Mg2+, Ca2+ 및 K+ 이온에 대하여는 각각 3.0%, 1.1% 및 5.0% 활성이 증가함을 알 수 있었다. 이 결과는 Cu2+ 와 Hg+가 억제제로 작용하였다는 보고(Jeuniaux, 1966) 와 V.
- 한편 효소 단백질의 아미노산 잔기와 활성 부위를 예측하기 위하여 카르복실기, 아민기, 하이드록실기 및 indole tryptophane 잔기와 각각 선택적으로 결합하는 것으로 알려진 1 mM의 sodium cyanate, 무수말레인산, 무수아세트산 및 N-bromo succinimide에 대한 이 효소의 활성 억제 효과를 측정한 결과, 각각 84.0%, 21.2%, 28.1% 및 18.0% 억제됨을 알았다. 이로써 이 효소의 활성에 카르복실기를 가진 아미노산 잔기가 중요한 역할을 하는 것으로 사려된다.
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