목적: K562 세포의 방사선에 의한 세포 사망은 mitotic catastrophe 현상이 위주로 나타나지만 herbimycin A (HMA)에 의하여 apoptosis 반응이 촉진되는 반면 genisteln에 의하여 두 가지 형태의 세포사망이 모두 억제된다. 본 연구에서는 HMA와 genistein에 의한 K562세포의 방사선 유도 세포주기 조절 변화와 세포 사망 양상의 연관성을 조사하였다. 대상 및 방법: 지수증식기의 KS62 세포에 6 MV선형가속기(Clinac 1,m C, Varian)를 이용하여 200~300 cGy/min의 선량률로 10 Gy를 균일하게 조사하였다. HMA와 genistein은 각각 250 nM와 25$\mu$M농도로 방사선 조사 후 즉시 투여하였다. 실험에서는 세포주기, 오절인자의 발현 및 활성, 노화 및 분화정도 등에 있어서의 시간에 따른 변화를 조사하였다. 결과: 방사선 단독조사에서 KS62세포는 G2기의 정체를 보였으나 정상적인 053을 가지는 세포와는 달리 지속적인 세포주기의 정체를 보이지 않았다. G2정체가 유지되는 동안 cyclin Bl의 점진적인 증가를 관찰할 수 있었으며, 이는 염색체의 복제가 완료되지 않은 상태에서 M기로 진행하여 미성숙한 염색체 응축과 mitotic catastrophe 현상이 나타나는 것과 일치한다. 방사선 조사와 함께 HMA를 투여한 경우에는 G2정체가 빠르게 해소되었으며 동시에 Gl기에서 세포가 정체되는 양상을 보였다. 세포주기 조절인자 cdc2 kinase 활성 증가와 cyclln I와 A 발현 및 CDK2 활성의 감소 등의 현상으로 설명되며, 이는 apoptosis의 증가와 연관성을 갖는다. 반면 genistein의 경우에는 cyclin Bl과 떨cfsc 발현 및 cdc2활성이 모두 감소하는 등 G2정체를 계속 유지하였다. 이와 함께 방사선에 의한 노화와 megakaryocyte로의 분화도 지속되는 것을 관찰할 수 있었다. 결론: HMA와 genistein에 의한 KS62세포의 방사선 유도 세포사망의 변화는 세포주기 조절과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 이는 다양한 방사선 유도 세포사망의 기전을 이해하는 데 독창적인 모델을 제공하며, 방사선을 이용한 암 치료법의 개발에 새로운 표적을 제공할 수 있을 것이다.
목적: K562 세포의 방사선에 의한 세포 사망은 mitotic catastrophe 현상이 위주로 나타나지만 herbimycin A (HMA)에 의하여 apoptosis 반응이 촉진되는 반면 genisteln에 의하여 두 가지 형태의 세포사망이 모두 억제된다. 본 연구에서는 HMA와 genistein에 의한 K562세포의 방사선 유도 세포주기 조절 변화와 세포 사망 양상의 연관성을 조사하였다. 대상 및 방법: 지수증식기의 KS62 세포에 6 MV 선형가속기(Clinac 1,m C, Varian)를 이용하여 200~300 cGy/min의 선량률로 10 Gy를 균일하게 조사하였다. HMA와 genistein은 각각 250 nM와 25$\mu$M농도로 방사선 조사 후 즉시 투여하였다. 실험에서는 세포주기, 오절인자의 발현 및 활성, 노화 및 분화정도 등에 있어서의 시간에 따른 변화를 조사하였다. 결과: 방사선 단독조사에서 KS62세포는 G2기의 정체를 보였으나 정상적인 053을 가지는 세포와는 달리 지속적인 세포주기의 정체를 보이지 않았다. G2정체가 유지되는 동안 cyclin Bl의 점진적인 증가를 관찰할 수 있었으며, 이는 염색체의 복제가 완료되지 않은 상태에서 M기로 진행하여 미성숙한 염색체 응축과 mitotic catastrophe 현상이 나타나는 것과 일치한다. 방사선 조사와 함께 HMA를 투여한 경우에는 G2정체가 빠르게 해소되었으며 동시에 Gl기에서 세포가 정체되는 양상을 보였다. 세포주기 조절인자 cdc2 kinase 활성 증가와 cyclln I와 A 발현 및 CDK2 활성의 감소 등의 현상으로 설명되며, 이는 apoptosis의 증가와 연관성을 갖는다. 반면 genistein의 경우에는 cyclin Bl과 떨cfsc 발현 및 cdc2활성이 모두 감소하는 등 G2정체를 계속 유지하였다. 이와 함께 방사선에 의한 노화와 megakaryocyte로의 분화도 지속되는 것을 관찰할 수 있었다. 결론: HMA와 genistein에 의한 KS62세포의 방사선 유도 세포사망의 변화는 세포주기 조절과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 이는 다양한 방사선 유도 세포사망의 기전을 이해하는 데 독창적인 모델을 제공하며, 방사선을 이용한 암 치료법의 개발에 새로운 표적을 제공할 수 있을 것이다.
Purpose : In our Previous study, we have shown the main cel1 death pattern Induced by irradiation or protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors in K562 human myeiogenous leukemic cell line. Death of the cells treated with irradiation alone was characterized by mitotic catastrophe and typical radiation...
Purpose : In our Previous study, we have shown the main cel1 death pattern Induced by irradiation or protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors in K562 human myeiogenous leukemic cell line. Death of the cells treated with irradiation alone was characterized by mitotic catastrophe and typical radiation-induced apoptosis was accelerated by herblmycin A (HMA). Both types of cell death were inhibited by genistein. In this study, we investigated the effects of HMA and genistein on cell cycle regulation and its correlation with the alterations of radiation-induced cell death. Materials and Methods: K562 cells In exponential growth phase were used for this study. The cells were Irradiated with 10 Gy using 6 MeV Linac (200-300 cGy/min). Immediately after irradiation, cells were treated with 250 nM of HMA or 25 $\mu$N of genistein. The distributions of cell cycle, the expressions of cell cycle-related protein, the activities of cyclin-dependent kinase, and the yield of senescence and differentiation were analyzed. Results: X-irradiated cells were arrested In the G2 phase of the cell cycle but unlike the p53-positive cells, they were not able to sustain the cell cycle arrest. An accumulation of cells in G2 phase of first ceil-cycle post-treatment and an increase of cyclin Bl were correlated with spontaneous, premature, chromosome condensation and mitotic catastrophe. HMA induced rapid G2 checkpoint abrogation and concomitant p53-independent Gl accumulation. HMA-induced cell cycle modifications correlated with the increase of CDK2 kinase activity, the decrease of the expressions of cyclins I and A and of CDK2 kinase activity, and the enhancement of radiation-induced apoptosis. Genistein maintained cells that were arrested in the G2-phase, decreased the expressions of cyclin Bl and cdc25c and cdc25C kinase activity, increased the expression of pl6, and sustained senescence and megakaryocytic differentiation. Conclusion: The effects of HMA and genistein on the radiation-induced cell death of KS62 cells were closely related to the cell cycle regulatory activities. In this study, we present a unique and reproducible model in which for investigating the mechanisms of various, radiation-induced, cancer cell death patterns. Further evaluation by using this model will provide a potent target for a new strategy of radiotherapy.
Purpose : In our Previous study, we have shown the main cel1 death pattern Induced by irradiation or protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors in K562 human myeiogenous leukemic cell line. Death of the cells treated with irradiation alone was characterized by mitotic catastrophe and typical radiation-induced apoptosis was accelerated by herblmycin A (HMA). Both types of cell death were inhibited by genistein. In this study, we investigated the effects of HMA and genistein on cell cycle regulation and its correlation with the alterations of radiation-induced cell death. Materials and Methods: K562 cells In exponential growth phase were used for this study. The cells were Irradiated with 10 Gy using 6 MeV Linac (200-300 cGy/min). Immediately after irradiation, cells were treated with 250 nM of HMA or 25 $\mu$N of genistein. The distributions of cell cycle, the expressions of cell cycle-related protein, the activities of cyclin-dependent kinase, and the yield of senescence and differentiation were analyzed. Results: X-irradiated cells were arrested In the G2 phase of the cell cycle but unlike the p53-positive cells, they were not able to sustain the cell cycle arrest. An accumulation of cells in G2 phase of first ceil-cycle post-treatment and an increase of cyclin Bl were correlated with spontaneous, premature, chromosome condensation and mitotic catastrophe. HMA induced rapid G2 checkpoint abrogation and concomitant p53-independent Gl accumulation. HMA-induced cell cycle modifications correlated with the increase of CDK2 kinase activity, the decrease of the expressions of cyclins I and A and of CDK2 kinase activity, and the enhancement of radiation-induced apoptosis. Genistein maintained cells that were arrested in the G2-phase, decreased the expressions of cyclin Bl and cdc25c and cdc25C kinase activity, increased the expression of pl6, and sustained senescence and megakaryocytic differentiation. Conclusion: The effects of HMA and genistein on the radiation-induced cell death of KS62 cells were closely related to the cell cycle regulatory activities. In this study, we present a unique and reproducible model in which for investigating the mechanisms of various, radiation-induced, cancer cell death patterns. Further evaluation by using this model will provide a potent target for a new strategy of radiotherapy.
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문제 정의
반면 genistein은 방사선에 의한 세포사망을 모두 감소시켰다. 이와 같은 기존의 실험결과를 바탕으로 본 연구에서는 K562 세포의 방사선 및 PTK 억제제 처리시 세포주기의 분석 및 조절에 대한 조사를 통하여, PTK 억제제에 의한 세포 사망 차이의 기전을 알아보고자 하였다.
제안 방법
48시간 이후 small fraction의 세포들이 G2기에서 G1 기로 이동하였다. 72시간에 G1 기보다 소량의 DNA를 가진 large fraction의 세포들이 확인과 함께 세포주기의 재분포가 이루어졌다. 방사선과 HMA를 병합처리한 경우에는 G1 정체와 함께 G2/M 정체가 우세하게 나타나다가 48시간 경과 후부터 G2/M 정체는 해소되며 세포주기를 재순환하는 양상을 보였다.
Protein lysates were subjected on SDS-PAGE and protein levels of cyclin DI (A), cyclin E (B) and cyclin A (C) were detected by electrochemiluminescence system. For analysis of CDK2 kinase activiry, protein lysates were reacted with kinase buffer containing histone H1 substrate, [y-32P] dATP, and anti-CDK2 antibody, subjected to SDS-PAGE and analyzes by autoradiography (D).
Protein lysates were subjected on SDS-PAGE and protein levels of cyclin Bl (A) and cdc25C (B) were detected by electrochemiluminescence system. For analysis of cdc2 kinase activiry, protein lysates were reacted with kinase buffer con taining histone Hl substrate, [y-32P] dATP, and anti-cdc2 antibody, subjected to SDS-PAGE and analyzes by autoradio-graphy (C).
G1 및 S기와 관련된 세포주기 조절인자의 변화를 조사하였다. G1 에는 cyclin D/CDK4, G1/S에는 cyclin E/CDK2, 그리고 S기에는 cyclin A/CDK2 복합체가 각각 세포주기 조절에 관여한다.
반응시킨 시료에 5 X SDS-PAGE sample loading buffei를 첨가하고, 95℃에서 5 분간 가열한 다음 12% SDS-PAGE로 전기영동하였다. 겔을 유리판으로부터 조심스럽게 분리하여 겔 건조기(Hoeffer)에서 건조시킨 후 X-ray 필름(Kodak)으로 -80℃에서 12시간 감광한 후 Fuji FPM 1200 방사능 자동현상기로 현상하였다.
동량의 단백질을 포함한 시료를 12% sodiumdodecylsulfote (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 하고, 겔상의 단백질을 PolyScreen polyvinylinene difluoride (PVDF) membrane (NEN Life Science)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 membrane은 blocking 과정, 일차항체[cyclin DI, E, A, Bl, CDK2, CDK4, p34cdc2, pl6, p21 (Santa Cruz), p53 (Calbiochem), cdc25C (Oncogene Bioscience)] 반응과정, 그리고 이차항체(mouse or rabbit immunoglobulin, horse radish peroxidase-linked whole antibody, Amersham Pharmacia Biotech) 반응과정을 거쳐 Bihanced chemiluminoscence (ECL) system (Amersham Pharmacia Biotech) 로 반응시킨 다음 Fu jifilm luminescent analysis system (LAS)-1000 Luminescent Image Analyzer로 현상하고 Fujifilm Image Gauge Version 3.11 software를 이용하여 분석하였다.
1 "Ci [ y-32P] dATP (Amersham) 와 2㎍의 histone Hl 기질이 포함된 kinase buffer 20 ㎕를첨가하여 37, C에서 30분간 반응시켰다. 반응시킨 시료에 5 X SDS-PAGE sample loading buffei를 첨가하고, 95℃에서 5 분간 가열한 다음 12% SDS-PAGE로 전기영동하였다. 겔을 유리판으로부터 조심스럽게 분리하여 겔 건조기(Hoeffer)에서 건조시킨 후 X-ray 필름(Kodak)으로 -80℃에서 12시간 감광한 후 Fuji FPM 1200 방사능 자동현상기로 현상하였다.
첨가하여 차가운 얼음에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 2% FBS/PBS 1 ml로 3회 세척하였다 FACScan flow cytometry system (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
0), 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM patassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCh]을 첨가하여 37℃에서 4〜12시간 정도 반응하였다. 반응이 끝난 후 슬라이드를 PBS로 세척하고 Giemsa 용액으로 대조염색한 다음, 광학현미경으로 관찰하였다.
처리하여 사용하였다. 방사선 조사는 6-MV X-Ray Machine (Clinac 1, 800 C, Vartan)을 이용하여 200〜300 cGy/ min의 선량율로 상온에서 일정하게 조사하였다. HMA(Calbiochem) 와 genistein (Calbiochem) 은 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)에 녹여서 각각 1 mM과 10 mM의 농축용액으로 조제하였으며, 각각 250 nM과 25 μM의 최종농도로 세포 배양액에 직접 처리하였다(IC세포를 회수하여 차가운 PBS로 2회 세척하고, 2% FBS/ PBS 로 blocking시킨 후, 5 ㎕ anti-CD61-FITC (BD, Biosci- eiice)를 첨가하여 차가운 얼음에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 2% FBS/PBS 1 ml로 3회 세척하였다 FACScan flow cytometry system (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
고정된 세포를 원심분리하여 에탄올을 제거한 후 propidium iodide 염색액에 재현 탁하고 37℃의 암소에서 1시간 동안 반응시켜 세포를 염색하였다. 세포주기는 FACScan flow cytometry system (Becton Dickinson)를 사용하여 Modifit software로 분석하였다.
이는 방사선과 HMA 병합처리 시에는 p53, p21 의 발현이 없음에도 불구하고 G1 에서 S로의 진행이 지연되는 후기 G1 정체가 유도됨을 보여준다. 즉 p53과 무관하게 작동하는 G1 checkpoint가 형성됨을 시사하며, 이와 apoptosis의 유도와의 상관관계를 제시한다.
5). 최근 pl6이 p53 및 p21 과 더불어 senescence 유도에 관여한다는 보고에 근거하여, 'SA-6-gal 염색을 통하여 senescence를 측정하였다. K562 세포는 방사선 단독조사 시초기에 급격한 senescence 반응을 보였으나, 세포가 다시 증식하기 시작하는 7일 경에는 거의 senescence 반응을 나타내지 않았다.
대상 데이터
K562 (ATCC CCL 243)는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL), penicillin (100 units/ml)/strepto- mycin (100"g/ml) (Gibco BRL) 그리고 2 mM L-glutamate (Sigma)가 포함된 RPMI 1640 (Gibco BRL) 배양배지를 사용하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 조건에서 배양하였다.
모든 실험에 사용된 세포는 2X 1()5 cells/ml의 비율로 준비하여 대수증식기로 성장한 세포를 각각의 실험조건에 따라 처리하여 사용하였다. 방사선 조사는 6-MV X-Ray Machine (Clinac 1, 800 C, Vartan)을 이용하여 200〜300 cGy/ min의 선량율로 상온에서 일정하게 조사하였다.
세포질 단백질 200㎍을 anti-CDK2 또는 anti-p34cdc2 항체와 protein A-sepharose를 이용하여 면역복합체를 형성하였다. Kinase buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.
이론/모형
상등액을 12, 000 g에서 30분간 원심분리하여 취하였으며, Protein Assay Kit (Bio-Rad)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 세포주기조절 단백질의 발현변화는 각각에 대한 항체를 이용하여 western blotting으로 확인하였다. 동량의 단백질을 포함한 시료를 12% sodiumdodecylsulfote (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 하고, 겔상의 단백질을 PolyScreen polyvinylinene difluoride (PVDF) membrane (NEN Life Science)으로 이동시켰다.
성능/효과
CDK4, CDK2, cdc2의 발현 변화도 조사하였으나, 예상한 대로 전반적으로 거의 변화가 없었다(data not shown). CDK2의 활성은 방사선 단독조사 시와 genistein 병합처리 시에는 약간 증가하는 양상을 보였으나, HMA과병합처리 시에는 시간에 따라 감소하였다(Fig. 4D).
3B). Cdc2의 활성은 방사선 단독 조사 시와 HMA 병합처리 시 초기의 감소에 이어 다시 회복되는 양상을 보였으나(R은 24시간, RH는 12시간), 방사선과 genistein의 병합처리 시에는 지속적으로 감소하였다 (Fig. 3C).
4A). Cyclin E의 발현은 모두 시간경과에 따라 감소하였으며 (Fig. 4B), Cyclin A의 발현은 HMA와 병합처리 시에 감소하는 양상을 보였다 (Fig. 4C). CDK4, CDK2, cdc2의 발현 변화도 조사하였으나, 예상한 대로 전반적으로 거의 변화가 없었다(data not shown).
K562 세포에 방사선 단독조사 시 나타나는 세포주기의 변화는 시간이 경과함에 따라 G1 주기의 세포는 거의 관찰할 수 없었고, 전형적인 G2/M 정체의 소견이 48 시간 경과 후까지 지속되었다. 48시간 이후 small fraction의 세포들이 G2기에서 G1 기로 이동하였다.
반면 방사선 조사와 genistein 병합처리의 경우의 세포 사망 감소는 cyclin Bl과 cdc25C 발현 및 cdc2 활성 이 모두 감소하는 둥 G2 정체의 지속적 유지에 의한 결과로 유도되는 노화와 megakaryocyte로의 분화 반응이 지속적으로 일어나는 결과로 설명된다. 따라서 본 실험을 통하여 HMA와 genistein에 의한 K562 세포의 방사선 유도 세포사망의 변화는 세포주기 조절과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 이는 다양한 방사선 유도 세포사망의 기전을 이해하는 데 독창적인 모델을 제공하며, 방사선을 이용한 암 치료법의 개발에 새로운 표적을 제공할 수 있을 것이다.
'기 또한 본 연구에 사용된 두 가지 PTK 억제제는 K562 세포의 방사선에 대한 세포사망의 형태와 apoptosis 유도에 있어서도 극명한 차이를 나타내었다. 방사선 단독조사에 내성인 양상을 보였으며, 방사선에 의하여 유도되는 세포사망은 oncotic necrosis, cytoplasmic apoptosis 및 mitotic catastrophe를 의심할 수 있는 형태학적인 소견을 보였다. 그러나 HMA는 방사선에 대한 감수성 증가와 방사선에 의한 세포사망을 촉진할 뿐만 아니라, 초기에 유도되는 세포사망은 전형적인 apoptosis에 의한 것이었다.
본 연구에서 K562 세포의 세포주기의 변화는 방사선 단 독조사 시 시간이 경과함에 따라 전형적인 G2/M 정체가 48 시간 경과 시까지 지속되다가 72시간 경과 후에 세포주기의 재분포가 이루어지는 현상이 관찰되었다. 최근 연구 에서 DNA 손상에 의하여 유도된 G2기 정체는 세포내 p53 이 존재하고 p21 또는 14-3-3 a을 전사적으로 활성화할 수 있을 때에만 계속 유지됨이 보고되었다.
있다. 본 연구에서 P16의 발현은 방사선 조사와 함께 발현되기 시작하였으며, 특히 방사선 조사와 함께 genistein 을 병합 처리한 경우에 강한 발현 양상을 나타내었다(Fig. 5). 최근 pl6이 p53 및 p21 과 더불어 senescence 유도에 관여한다는 보고에 근거하여, 'SA-6-gal 염색을 통하여 senescence를 측정하였다.
G2기의 정체는 cyclin B/cdc2와 함께 cdc25C의 작용억제에 의하여 유지되며, 이들은 활성화되어 세포질에서 핵으로 이동에 의하여 세포분열 기로 진행한다. 본 연구에서 cdc25C의 발현은 방사선 단독조사 시 72시간 이후에 다소 감소하였으며, 방사선과 HMA를 병합처리 시 큰 변화는 없었다. 반면 방사선과 genistein 병합처리 시 발현이 매우 감소하였으며, 72시간 경과 후에는 거의 나타나지 않았다(Fig.
이와 관련하여 pentoxyfilline36) 혹은 caffeine37) 등의 약물은 방사선에 의한 G2 정체 기간을 단축하며 방사선 감수성을 증가시키는 것 둥이 알려져 있다. 세포주기 조절단백질과 이들을 조절하는 인자들에 있어서 cyclin 이의 변화는 없었으며, cyclin E와 A의 발현 감소와 CDK2 활성의 감소를 하였다. 이는 방사선과 HMA 병합처리 시에는 p53, p21 의 발현이 없음에도 불구하고 G1 에서 S로의 진행이 지연되는 후기 G1 정체가 유도됨을 보여준다.
이상의 실험에서 방사선 단독조사에 의한 K562 세포의 사망 반응인 mitotic catastrophe 현상은 불완전한 G2 기의 정체와 G2 정체가 유지되는 동안 cyclin Bl의 점진적인 증가 등으로 인하여 염색체의 복제가 완료되지 않은 상대에서 M기로 진행한 결과로 설명된다. 방사선 조사와 함께 HMA를 투여한 경우의 세포사망 촉진과 조기 사망의 apo ptosis 양상은 cdc2 kinase 활성 증가에 따른 빠른 G2 정체의 해소와 cyclin E와 A 발현 및 CDK2 활성의 감소 등으로 인한 P53과 무관한 이기의 세포 축적 등으로 설명된다.
후속연구
따라서 본 실험을 통하여 HMA와 genistein에 의한 K562 세포의 방사선 유도 세포사망의 변화는 세포주기 조절과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 이는 다양한 방사선 유도 세포사망의 기전을 이해하는 데 독창적인 모델을 제공하며, 방사선을 이용한 암 치료법의 개발에 새로운 표적을 제공할 수 있을 것이다.
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