내분비교란물질은 동물에서 생식기계통을 통제하는 호르몬 조절에 영향을 준다. 상기 선정된 농약을 투여함에 있어서 실험동물로 Xiphophorus helleri로 선정하였는데 이는 암수의 구별이 육안적으로 명확히 관찰되며 또한 난태생으로 사육이 용이한 점이 있다. Xiphophorus helleri에 있어서 내분비교란물질로 의심되는 endosulfan과 molinate의 영향을 조사하기 위하여 vitellogenin과 aromatase 를 진단 biomarker로써 사용하였다. RT-PCR 결과 endosulfan과 molinate의 혼합처치군 및 alachlor 단독군 수컷에서 vitellogenin과 aromatase의 induction 이 동시에 관찰되었고, endosulfan 단독군에서는 aromatase의 induction이 관찰되었다. 본 실험에서는 endosulfan이나 molinate 단독 처치군에서의 성호르몬과 세포에 대한 유해 효과는 나타나지 않았다. 그러나, endosulfan과 molinate 의 혼합처치군에서는 vitellogenin과 aromatase의 발현 및 apoptosis가 관찰되었다. 이러한 결과는 swordtail fish에 영향을 미치지 않는 낮은 농도의 molinate와 endosulfan이라도 병용되는 경우에 생식기계의 호르몬 변화와 apoptosis를 야기시킨다는 사실을 제시한다.
내분비교란물질은 동물에서 생식기계통을 통제하는 호르몬 조절에 영향을 준다. 상기 선정된 농약을 투여함에 있어서 실험동물로 Xiphophorus helleri로 선정하였는데 이는 암수의 구별이 육안적으로 명확히 관찰되며 또한 난태생으로 사육이 용이한 점이 있다. Xiphophorus helleri에 있어서 내분비교란물질로 의심되는 endosulfan과 molinate의 영향을 조사하기 위하여 vitellogenin과 aromatase 를 진단 biomarker로써 사용하였다. RT-PCR 결과 endosulfan과 molinate의 혼합처치군 및 alachlor 단독군 수컷에서 vitellogenin과 aromatase의 induction 이 동시에 관찰되었고, endosulfan 단독군에서는 aromatase의 induction이 관찰되었다. 본 실험에서는 endosulfan이나 molinate 단독 처치군에서의 성호르몬과 세포에 대한 유해 효과는 나타나지 않았다. 그러나, endosulfan과 molinate 의 혼합처치군에서는 vitellogenin과 aromatase의 발현 및 apoptosis가 관찰되었다. 이러한 결과는 swordtail fish에 영향을 미치지 않는 낮은 농도의 molinate와 endosulfan이라도 병용되는 경우에 생식기계의 호르몬 변화와 apoptosis를 야기시킨다는 사실을 제시한다.
Endocrine disrupting chemicals (EDCs) can alter hormone regulation that control reproductive system in animals. The effects of endosulfan, molinate, and alachlor that suspected to have examined disruption EDCs effect on a fish species of interest, Xiphophorus helleri (swordtail fish), were studied u...
Endocrine disrupting chemicals (EDCs) can alter hormone regulation that control reproductive system in animals. The effects of endosulfan, molinate, and alachlor that suspected to have examined disruption EDCs effect on a fish species of interest, Xiphophorus helleri (swordtail fish), were studied using vitellogenin (Vtg) and aromatase as diagnostic biomarkers. Induction of Vtg proteins was detected by RT-PCR in male fish treated with alachlor, and mixture of endosulfan and molinate in dose response manner. Also, induction of aromatase was detected by RT-PCR in male fish treated with alachlor, endosulfan, and mixture of endosulfan and molinate in sinlilar manner. In this study, swordtail fish exposed to endosulfan or molinate individually did not show any adverse effects. However, Vtg and aromatase expressions and apoptosis were detected in swordtail. fish exposed to the mixture of endosulfan and molinate. These results suggested that low concentrations of mixture of molinate and endosulfan individually do not affect swordtail fish, but may influence genital system, and induce apoptosis.
Endocrine disrupting chemicals (EDCs) can alter hormone regulation that control reproductive system in animals. The effects of endosulfan, molinate, and alachlor that suspected to have examined disruption EDCs effect on a fish species of interest, Xiphophorus helleri (swordtail fish), were studied using vitellogenin (Vtg) and aromatase as diagnostic biomarkers. Induction of Vtg proteins was detected by RT-PCR in male fish treated with alachlor, and mixture of endosulfan and molinate in dose response manner. Also, induction of aromatase was detected by RT-PCR in male fish treated with alachlor, endosulfan, and mixture of endosulfan and molinate in sinlilar manner. In this study, swordtail fish exposed to endosulfan or molinate individually did not show any adverse effects. However, Vtg and aromatase expressions and apoptosis were detected in swordtail. fish exposed to the mixture of endosulfan and molinate. These results suggested that low concentrations of mixture of molinate and endosulfan individually do not affect swordtail fish, but may influence genital system, and induce apoptosis.
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문제 정의
그리하여 본 연구는 내분비계 장애 의심물질로 추 정되는 농약에 대한 환경생물인 어류를 실험동물로 이용하여 농약에 대한 노출 결과 야기되는 어류의 성 분화와 성결정 정도를 조사하며 또한 이를 통한 자료 를 토대로 하여 내분비계 의심 농약의 in vivo assay법 을 개발하는데 목적이 있다. 따라서 본 연구에서는 내분비계 의심 물질로 추정되는 농약중 endosulfan, molinate, alachlor 각각에 대한 원제를 시험물질로 선 정하였고, 또한 혼합독성 여부를 관찰하기 위하여 endosulfan 과 molinate 단일 투여군과 endosulfan+ molinate 혼합독성을 비교하는 실험을 수행하였다.
그리하여 본 연구는 내분비계 장애 의심물질로 추 정되는 농약에 대한 환경생물인 어류를 실험동물로 이용하여 농약에 대한 노출 결과 야기되는 어류의 성 분화와 성결정 정도를 조사하며 또한 이를 통한 자료 를 토대로 하여 내분비계 의심 농약의 in vivo assay법 을 개발하는데 목적이 있다. 따라서 본 연구에서는 내분비계 의심 물질로 추정되는 농약중 endosulfan, molinate, alachlor 각각에 대한 원제를 시험물질로 선 정하였고, 또한 혼합독성 여부를 관찰하기 위하여 endosulfan 과 molinate 단일 투여군과 endosulfan+ molinate 혼합독성을 비교하는 실험을 수행하였다. 그 리고 논물에서의 molinate 잔류시 독성을 알아보기 위 하여 논물에서의 molinate 잔류 반감기와 동일한 환경 으로 하여 비교하는 실험도 병행하였다.
그러 므로 내분비교란물질에 관한 in vivo 실험은 필수라고 하는 전제와 그 물질들의 환경 중 오염과 먹이사슬의 최종 숙주인 인간과의 관련성, 그리고 환경 중 노출 여부를 판단하기 위한 야외 실험 등의 측면에서 가지는 장점 등을 고려할 때, 내분비교란물질 여부를 보 다 신속히 검색할 수 있고, 생체내 독성기전의 연구 에 유리한 물고기 모델을 개발해내는 것은 현 시기에 있어서 매우 중요한 과제라고 할 수 있겠다 (Jobling 등, 1996; Gendron 등, 1997; Hontela, 1997). 이것을 기 반으로 농업환경 중 내분비 장애 추정농약의 잔류 상 태를 모니터링하고 포유류 및 어류에 대한 생식영향 및 위해성 평가를 통한 내분비계 장애물질의 위해방 지 및 안전관리의 기반을 구축하기 위한 일환의 노력 으로 내분비계 장애 의심 물질에 해당되는 일부 농약 들에 대한 in vivo assay법의 개발이 본 연구의 목적 이다.
제안 방법
다음에 xylene으로 파라핀을 제거하고 에탄올을 사용하여 수화시킨 다음 proteinase K로 단백질을 분해하여 샘플의 투과성을 높였다. TdT enzyme으로 효소 반응을 일으킨 후 형광 물질로 fluorescein isothiocynate (FITC)를 labeling하여 488〜530 nm에서 관찰하였다.
각각의 시험군에서 수컷 sword tail fish에 대한 부 검을 실시하여 total RNA를 추출하여 정량한 후 1% agarose gel 전기영동으로 RNA 발현을 확인하였다. 전 체 RNA 중에서 각각 처리한 시험군당 RNA 1μg씩을 RT-PCR 법으로 역전사 증폭을 시켰다.
따라서 본 연구에서는 내분비계 의심 물질로 추정되는 농약중 endosulfan, molinate, alachlor 각각에 대한 원제를 시험물질로 선 정하였고, 또한 혼합독성 여부를 관찰하기 위하여 endosulfan 과 molinate 단일 투여군과 endosulfan+ molinate 혼합독성을 비교하는 실험을 수행하였다. 그 리고 논물에서의 molinate 잔류시 독성을 알아보기 위 하여 논물에서의 molinate 잔류 반감기와 동일한 환경 으로 하여 비교하는 실험도 병행하였다. 또한 testo- sterone의 영향으로 인한 성분화 이전의 sword tail fish 의 수컷으로의 분화 사이의 상관관계를 규명하여 꼬 리길이를 이용한 내분비계 시험 적용여부를 확인하는 실험을 수행하였다.
1% ethyl alcohol로 용매대 조군을 두어서 노출시켰다. 그러나, 혼합독성군에서 고농도의 혼합군이 투여 후 1, 2주 내로 폐사하는 관 계로 전 실험군의 재설계가 필요하여 중농도를 고농 도로, 중농도와 저농도의 평균값을 중농도로 다시 설 계하여 실시하였고, B・estradiol도 투여 후 1주 내로 폐 사하여 10 ppb로 다시 설계 후 실시하였다.
기산출한 LC.50 자료를 바탕으로 노출량을 선정하기 위해 LC50의 1/10값에 5의 공비로 2단계를 낮추어 고 농도와 저농도를 선정하고 두 농도의 중간농도를 중 농도로을 취하여 최고농도로 선정하여 3달동안 각각 의 농약원제에 대한 노출을 실시하였고 혼합독성군 (endosulfan+molinate) 을 두었으며 양성대조군으로 β-estradiol 10 ppb를 투여하였고, 음성대조군이자 sword tail fish와의 상관관계를 알아보기 위하여 testosterone 100 ppb를 투여하였으며, 0.1% ethyl alcohol로 용매대 조군을 두어서 노출시켰다. 잔류하는 molinate에 대한 농도 설정은 LC50 자료를 바탕으로 반감기를 4일로 하여 한 군은 1개월 동안, 다른 한 군은 3개월 동안 잔류량을 반감기를 기준으로 계속 감소시키면서 노출 시켰다.
노출농도의 선정시 초기에는 기산출한 LC50 자료를 바탕으로 노출량을 선정하기 위해 LC50의 1/10값을 취하여 최고농도로 정하고 고농도의 값에 5의 공비로 2단계를 낮추어 중농도, 고농도를 선정하여 3달동안 각각의 농약원제에 대한 노출을 실시하였고 혼합독성 군(endosulfan+moHnate)을 두었으며 양성대조군으로 -estradiol 20 ppb를 투여하였고, 음성대조군이자 sword tail &sh와의 상관관계를 알아보기 위하여 testosterone 100 ppb를 투여하였으며, 0.1% ethyl alcohol로 용매대 조군을 두어서 노출시켰다. 그러나, 혼합독성군에서 고농도의 혼합군이 투여 후 1, 2주 내로 폐사하는 관 계로 전 실험군의 재설계가 필요하여 중농도를 고농 도로, 중농도와 저농도의 평균값을 중농도로 다시 설 계하여 실시하였고, B・estradiol도 투여 후 1주 내로 폐 사하여 10 ppb로 다시 설계 후 실시하였다.
그 리고 논물에서의 molinate 잔류시 독성을 알아보기 위 하여 논물에서의 molinate 잔류 반감기와 동일한 환경 으로 하여 비교하는 실험도 병행하였다. 또한 testo- sterone의 영향으로 인한 성분화 이전의 sword tail fish 의 수컷으로의 분화 사이의 상관관계를 규명하여 꼬 리길이를 이용한 내분비계 시험 적용여부를 확인하는 실험을 수행하였다.
부검시 각 실험군 중 수컷의 생식기 부분을 절단하 여 슬라이드 표본을 제작하였다. 다음에 xylene으로 파라핀을 제거하고 에탄올을 사용하여 수화시킨 다음 proteinase K로 단백질을 분해하여 샘플의 투과성을 높였다.
수컷에서의 난황단백질인 vitellogenin과 암컷에서 주로 많이 생성되는 estiadi이의 전구체인 estrone을 합 성하는데 관여하는 효소인 aromatase의 발현정도를 보 기 위하여 RT-PCR 을 실시하였으며, 이에 사용된 piimer의 sequence는 표 2와 같다 (Jonsson 등, 1994; Gronen 등, 1999; Kwak 등, 2001).
1% ethyl alcohol로 용매대 조군을 두어서 노출시켰다. 잔류하는 molinate에 대한 농도 설정은 LC50 자료를 바탕으로 반감기를 4일로 하여 한 군은 1개월 동안, 다른 한 군은 3개월 동안 잔류량을 반감기를 기준으로 계속 감소시키면서 노출 시켰다.
각각의 시험군에서 수컷 sword tail fish에 대한 부 검을 실시하여 total RNA를 추출하여 정량한 후 1% agarose gel 전기영동으로 RNA 발현을 확인하였다. 전 체 RNA 중에서 각각 처리한 시험군당 RNA 1μg씩을 RT-PCR 법으로 역전사 증폭을 시켰다. 이에 사용한 primer로는 vitellogenin primer를 제작하여 사용하였고 이에 대한 비교를 보기 위해 house keeping gene 검출 로 많이 이용하는 P-actin primer를 사용하였다.
그러나, 국내에서는 연구사례가 전무 한 상태이며, 최근 1998년 5월부터 환경부와 식품의 약품안정청 중심으로 대책 및 연구협의회를 구성하고 이 문제를 다루기 시작하였다. 즉, 환경부 주도하에 1998년 5월 29일 내분비계 장애물질 대책회의를 개최 하여 '대책 협의회'와 '전문연구협의회'를 구성 운영 하고 있으며, Endocrin disrupter에 대한 용어를 “내분 비계 장애물질”로 결정하고 내분비계 장애물질은 세 계야생생물기금 (WWF)에서 선정한 67종을 추정물질 로 선정하여 국내 사용 및 규제 실태를 조사하기로 하였다. 조사결과 세계야생생물기금(WWF)에서 선정 한 67종 중 16종은 국내에서 사용실적이 없는 물질이 고, 국내에서 제조되거나 수입사례가 있는 물질이 51 종이고 이중 42종은 유해화학물질관리법, 농약관리법, 산업안전보건법 등에 의하여 규제하고 있는 물질이며 비스페놀 A, 노닐페놀류 및 플라스틱 관련 산업용 화 학물질 9종은 현재 규제되고 있지 않은 물질이다.
대상 데이터
실험동물로 sword tail fish로 선정하였으며 아직 성 분화가 되지 않은 juvenile fish (45일령)를 사용하였고 선정된 농약에의 dose를 산출하기 위해 juvenik fish에 대한 급성 LC50 test를 96시간 동안 실시하였다. 결과는 Probit 법으로 SPSS를 이용하여 분석하였다.
전 체 RNA 중에서 각각 처리한 시험군당 RNA 1μg씩을 RT-PCR 법으로 역전사 증폭을 시켰다. 이에 사용한 primer로는 vitellogenin primer를 제작하여 사용하였고 이에 대한 비교를 보기 위해 house keeping gene 검출 로 많이 이용하는 P-actin primer를 사용하였다.
데이터처리
test를 96시간 동안 실시하였다. 결과는 Probit 법으로 SPSS를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
EDC 의심 물질로 생각되는 농약에 의한 apoptosis 를 확인하기 위하여 terminal deoxynucleotidyl trans ferase (TdT) assay를 실시하였다. Apoptosis는 자극에 의해 세포가 스스로 사멸하는 것을 의미하는데 apop- tosis가 일어나면 DNA가 여러 조각으로 끊어지게 된 다.
성능/효과
2. Results of Vitellogenin mRNA level examined by RT-PCR using Ijig of total RNA from male sword tail fish sample treated with mixture of endosulfan and molinate during three months.(C :control, T : gioup treated with testosterone, E : group treated with estradiol, H: group treated with high cone, of mixture of endosulfan and molinate, M : group treated with middle cone, of mixture of endosulfan and molinate, L: gioup treated with low cone, of mixture of endosulfan and molinate).
VTG assay를 실시한 결과 alachlor 단독군, endo sulfan 과 moliMte 의 혼합군에서 vitellogenin mRNA의 발현이 용량의존적으로 확인되었고(그림 1, 2), aroma tase assay를 실시한 결과에서는 molinate 처리군을 제 외한 다른 두 군에서 aromatase 발현이 용량의존적으 로 확인되었다(그림 3, 4, 5). Vitellogein은 농약과 같 은 xenobiotics에 의한 성호르몬의 변화를 진단하는데 사용되는 biomarker이며, aromatase는 주된 자성 호르 몬인 estrogen의 합성에 관련되어 있는 단백질이다 (Finlayson 등, 1986; Kime 등, 1999; Mellanen 등, 1999; Nicolas 등, 1999; Orlando 등, 1999).
Vitellogein은 농약과 같 은 xenobiotics에 의한 성호르몬의 변화를 진단하는데 사용되는 biomarker이며, aromatase는 주된 자성 호르 몬인 estrogen의 합성에 관련되어 있는 단백질이다 (Finlayson 등, 1986; Kime 등, 1999; Mellanen 등, 1999; Nicolas 등, 1999; Orlando 등, 1999). 두 가지 biomarker의 사용 결과 itfomatase의 감수성이 더 높은 것으로 판단되며 내분비계교란물질로 의심되는 농약 중 단독군의 경우 뿐만 아니라 moEnate처럼 단독 노 출의 경우에서는 영향을 주지 않더라도 혼합시에는 영향을 줄 수 있는 것으로 판단된다.
성비율에서는 그다지 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았고(그림 10), 꼬리 길이에서는 전 시험군의 고농도 그 룹에서 대조군에 비해 육안적으로 낮은 성장을 보였 으며, 특히 alachlor와 endosulfan의 경우에는 중농도 그룹에서도 성장의 저하를 보였다(그림 11, 12). sword tail의 경우 성분화된 수컷에서만 꼬리가 발생하므로 꼬리 길이의 성장 저하는 내분비계교란물질이 성호르 몬에 영향을 끼치는 것으로 판단되므로 이와 같은 꼬 리 성장 변화가 농약 이의외 다른 내분비계의심물질에 의해서도 유사한 결과를 보이는지에 대한 실험이 더 추가된다면 sword tail fish를 모델 동물로 이용하 여 내분비계의심물질을 screening하는 시도도 가능할 것으로 판단된다.
즉, 환경부 주도하에 1998년 5월 29일 내분비계 장애물질 대책회의를 개최 하여 '대책 협의회'와 '전문연구협의회'를 구성 운영 하고 있으며, Endocrin disrupter에 대한 용어를 “내분 비계 장애물질”로 결정하고 내분비계 장애물질은 세 계야생생물기금 (WWF)에서 선정한 67종을 추정물질 로 선정하여 국내 사용 및 규제 실태를 조사하기로 하였다. 조사결과 세계야생생물기금(WWF)에서 선정 한 67종 중 16종은 국내에서 사용실적이 없는 물질이 고, 국내에서 제조되거나 수입사례가 있는 물질이 51 종이고 이중 42종은 유해화학물질관리법, 농약관리법, 산업안전보건법 등에 의하여 규제하고 있는 물질이며 비스페놀 A, 노닐페놀류 및 플라스틱 관련 산업용 화 학물질 9종은 현재 규제되고 있지 않은 물질이다. 규 제되고 있지 않은 9종의 물질 중 환경잔류성이 높고 유해성이 있다고 보고된 4종 (펜타-노닐페놀류, 비스 페놀 A, 디에 틸 헥실프탈레이트, 디부틸벤질프탈레이 트)은 환경부에서 관찰 물질로 지정하여 제조, 수입 및 용도를 신고하도록 하여 관리하고 있다.
후속연구
성비율에서는 그다지 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았고(그림 10), 꼬리 길이에서는 전 시험군의 고농도 그 룹에서 대조군에 비해 육안적으로 낮은 성장을 보였 으며, 특히 alachlor와 endosulfan의 경우에는 중농도 그룹에서도 성장의 저하를 보였다(그림 11, 12). sword tail의 경우 성분화된 수컷에서만 꼬리가 발생하므로 꼬리 길이의 성장 저하는 내분비계교란물질이 성호르 몬에 영향을 끼치는 것으로 판단되므로 이와 같은 꼬 리 성장 변화가 농약 이의외 다른 내분비계의심물질에 의해서도 유사한 결과를 보이는지에 대한 실험이 더 추가된다면 sword tail fish를 모델 동물로 이용하 여 내분비계의심물질을 screening하는 시도도 가능할 것으로 판단된다.
참고문헌 (16)
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