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문제 정의
- 본 연구는, 국내 양식장에서 어류 질병 원인체의 전파를 차단하는 목적으로 사용되고 있는 C16에 대해 수종어류 병원 세균의 살균유효농도와 살균시간 및 양식어류에 미치는 위해농도를 파악하기 위한 연구의 일환으로, C1O2 농도와 반응시간에 따른 어류병원세균의 살균효과를 조사하였다.
제안 방법
- 2ml/min.로 조정흥!.여 희석액 10 μ1를 guard column (lonPac AG14)에 주입 하여 main column (lonPac AS 14-4 nun)을 통과시켰고, 추출된 CIO는 detector (AMMS-ICE)로 검출하였다.
- 455 ppm으로 구배되었다. C1O2 희석액과 세균 부유액의 반응은 1:1 정량 비로 행하였으며, 반응 시간은 30초, 1분, 3분, 5분, 10분으로 하였다. 이때 대조구는 멸균된 PBS를 세균과 동량으로 반응시켜 준비하였다.
- 제조한 즉시 실험에 사용하였다. 각 농도별 희석 반응액은 C1O2 실제 농도를 확인하기 위하여 빛을 차광시킨 시험관에 희석액을 각각 10 ml 취하여 ion chromatography (Dionex-600, USA)로 정량하였다. 측정은 용매로서 2.
- 및 Streptococcus sp.를 1.5% NaCl°] 첨가된 50 ml의 멸균 BHI (brain heart infusion) broth에 접종하고 25℃에서 100 rpm 으로 진탕 하면서 18시간 배양하여 본 연구의 실험균으로 사용하였다.
- 및 Streptococcus sp.를대상으로 C1O2 유효농도 0.455, 0.246 및 0.129 ppm에 30초, 1분, 3분, 5분 및 10분간 처리하여 ClOj의 살균 효과를 조사하였다.
- agar plating법을 이용하였다. 반응 종료 후 실험균 부유액을 멸균 PBS로 연속 희석한 후 1.5% NaCl이 첨가된 BHI agat<>fl 100 贝 씩 떨어뜨리고 멸균된 콘라쥬봉으로도 말하여 25℃에서 24시간 배양한 다음 배지에 형성된 실험균의 colony를 colony counter (SUNTEX, USA)로 계수하여ml당 반응균의 수를 측정하였다.
- 이때 대조구는 멸균된 PBS를 세균과 동량으로 반응시켜 준비하였다. 반응 종료 후, 96-well microplate를 ELISA reader (SPECTRA MAX 340, USA)에 넣고 25℃에서 12시간 동안 1시간 간격으로 600 nm에서 흡광도 (OD)를 측정하여 세균의 증식 패턴을 관찰하였다.
- 환원 효과를 비교하였다. 실험은 1 ppm의 C1O2 희석액에 각각의 유기물을 첨가하여 30초, 1분, 10분, 20분 및 30 분간 반응시킨 후에 잔류 C1O2 농도를 측정하였다. 자연 광선과 암소 노출에 따른 해수중 C1O2 잔류 농도를 경시적으로 조사하였다.
- 유기물의 영향에 의한 실험 결과의 오차를 최소화하기 위하여 각 세균 배양액을 멸균된 원심분리용 튜브에 넣고 3, 000 rpm 에서 15분간 원심분리하여 균체를 모은 다음 멸균된 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 현탁하는 조건으로 3회 반복하여 균체를 수세하였다. 최종적으로 얻어진 균체는 멸균된 생리식염수를 이용하여 균의 농도를 lb cells/ml로 조정하였다.
- 여과해 수(공경, 5 pm)를 알루미늄 호일로 차광시킨 여과용 유리 삼각플라 스크(용량, 500 ml)에 채우고 C1O2 농도가 1 ppm이 되도록 구배하였다. 이어서 호일을 제거한 실험구와 차광 실험구는 자연광과 실내 암소에 각각 두었고, 0, 2, 5, 10, 30 및 60분경과 후에 채수하여 잔류 C1O2 농도를 전술한 방법으로 측정하였다.
- 일정 시간 C1O2 희석액과 실험균을 반응시킨 후, 반응을 정지시키는 목적으로 사용하기 위하여 MEM (minimum essential medium), FBS (fetal bovine serum), BHI broth 및 PBS를 대상으로 잔류 C1O2 환원 효과를 비교하였다. 실험은 1 ppm의 C1O2 희석액에 각각의 유기물을 첨가하여 30초, 1분, 10분, 20분 및 30 분간 반응시킨 후에 잔류 C1O2 농도를 측정하였다.
- 실험은 1 ppm의 C1O2 희석액에 각각의 유기물을 첨가하여 30초, 1분, 10분, 20분 및 30 분간 반응시킨 후에 잔류 C1O2 농도를 측정하였다. 자연 광선과 암소 노출에 따른 해수중 C1O2 잔류 농도를 경시적으로 조사하였다. 여과해 수(공경, 5 pm)를 알루미늄 호일로 차광시킨 여과용 유리 삼각플라 스크(용량, 500 ml)에 채우고 C1O2 농도가 1 ppm이 되도록 구배하였다.
대상 데이터
- 세균과의 반응 실험을 위한 이산화염소희석용액은 원액 (Oxycraft, 5,000 ppm)을 멸균 증류수로 희석하여 설정 농도가 되도록 제조한 즉시 실험에 사용하였다. 각 농도별 희석 반응액은 C1O2 실제 농도를 확인하기 위하여 빛을 차광시킨 시험관에 희석액을 각각 10 ml 취하여 ion chromatography (Dionex-600, USA)로 정량하였다.
- 각 농도별 희석 반응액은 C1O2 실제 농도를 확인하기 위하여 빛을 차광시킨 시험관에 희석액을 각각 10 ml 취하여 ion chromatography (Dionex-600, USA)로 정량하였다. 측정은 용매로서 2.7 mM Na2CO3^-1 mM NaHCCb를, flow rate는 1.2ml/min.로 조정흥!.
이론/모형
- C1O2 농도별로 반응시킨 실험균의 생균수를 측정하기 위하여 agar plating법을 이용하였다. 반응 종료 후 실험균 부유액을 멸균 PBS로 연속 희석한 후 1.
성능/효과
- 5). 0.455 ppm 에 노출된 실험세균은 30초간 반응 후 그 증식이 완전히 저해되었으나, 0.129 ppm과 0.246 ppm에서는 배양 3시간 및 & 시간 이후부터 균의 생존에 의한 증식이 확인되었다. 또한 0.
- 0.5% FBS의 경우 실험구에 첨가한 뒤 1분 후부터 검출되지 않았으며, MEMe 환원 시간이 매우 길어 0.5%의 경우 10 분이 소요되었다. PBS는 동일 농도 조건에서 감소 효과를 보이지 않아 반응 정지용으로 적절하지 않은 것으로 나타났다.
- 3과 4에 나타내었다. E. tarda는 V anguillarume- 마찬가지로 0.246 ppm 이상의 염소 농도로 30초간 처리 시증식이 완전히 저해되었으나, 0.129 ppm에서는 배양 후 7시간 이후부터 완만한 증식이 이루어짐을 확인할 수 있었다 (Fig. 3).하지만 0.
- 1). 그러나 0.129 ppm에서 반응시간을 달리하여 균의 생존에 따른 성장을 관찰한 결과, 30초와 1분 동안 반응한 V. anguillarMine각각 배양 후 5시간과 8시간 이후부터 균의 성장이 관찰되었으며 , 3분과 5분간 반응시킨 균은 배양 종료 시에 약간의 증식이 확인되는 것으로 보아 ClOg] 의해 균의 증식이 저해받은 것은 사실이나 100% 완벽한 사멸 효과는 인정할 수 없는 것으로 판단되었다. 한편 이 농도에서 10분 동안 반응한 균은 배양 기간 동안 증식이 완전히 저해되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 5분이 소요됨을 확인하였다. 그리고 C1O2 농도가 0.75 ppm이고, 온도가 5~32℃ 범위인 조건에서 Bacillus 균체에 대한 살균능은 온도가 10℃ 증가할수록 살균 시간은 1/2로 줄어들어 고수온에서 살균 효과가 훨씬 강화되는 것을 보여주었다. 본 실험은 pH 7.
- 85X 108 CFU/ml이었다(Table 2). 그리고 각 실험 균의 살균 효과 실험에 실제 적용된 C1O2 유효농도는 0.129, 0.246 및 0.455 ppm이었다.
- 넙치 감염어 유래 V anguillarume: 0.246 및 0.455 ppm의 CICh로 30초간 반응시킨 후 12시간 동안 배양한 실험에서 배양균의 증식이 완전히 저해되어 0.246 ppm 이상의 염소 처리에 의해 균이 모두 사멸되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 그러나 0.
- 246 ppm, Streptococcus sp.는 0.129 ppm의 C1O2 농도로 30초 전후로 처리하는 조건이 가장 효과적임을 본 연구를 통해 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 그람양성균인 Staphylococcus sp.는 그람 음성균인 V. anguillarum과 E. tarda에 비하여 C16에 비교적 영향을 적게 받는 결과를 보인 점은 이들과 유사한 경향이였지만 그람양성균의 일종인 Streptococcus sp는 저농도 조건인 0.129 ppm에서 30초의 반응으로도 사멸되어져서 그람 음성균인 V anguillarume E. tarda 에 비하여 오히려 감수성이 높은 것으로 나타났다. 따라서 그람 염색성에 따른 어병세균들의 C1O2 살균 효과에 관한 비교는 더욱 검토가 필요할 것으로 판단되어졌다.
- Streptococcus sp.는 실험에 사용된 어병세균들 중 이산화염소 처리에 가장 민감한 것으로 확인되었는데, 이는 본 실험의 C1O2 최저 반응 농도인 0.129 ppm에서 30초간 처리하는 조건에서 균이사멸되는 것으로 알 수 있었다 (Fig. 7).
- 살균 효과가 높고, 직사광선이 없는 암소 조건에서는 잔류시간이 길며, chlorination 과정에 유기물 및 질소화합물과 반응하여 trihalomethane 이나 chloramine을 생성하지 않는 등 환경적 위해성이 적은 화학 소독제인 것으로 여겨진다. 따라서 수산양식장의 사육 원수에 대한살균처리, 기구의 표면소독, 오염된 유출수의 처리를 비롯한 양식장 사육관리상의 살균제로서 이산화염소 처리법은 유용하게 사용되어질 수 있을 것으로 사료된다.
- 75 ppm이고, 온도가 5~32℃ 범위인 조건에서 Bacillus 균체에 대한 살균능은 온도가 10℃ 증가할수록 살균 시간은 1/2로 줄어들어 고수온에서 살균 효과가 훨씬 강화되는 것을 보여주었다. 본 실험은 pH 7.0, 온도가 20℃ 전후인 실온 조건에서 4종류의 어병세균을 대상으로 C1O2의 살균 능을 조사한 결과 Staphylococcus sp는 0.455 ppm, V augu讥arum과 E. tarda는 0.246 ppm, Streptococcus sp는 0.129 ppm의 이산화염소에서 30초 동안 처리하였을 때 사멸되었다. 저농도 0.
- 실험에 적용된 C1O2 농도는 실험균에 대하여 10, 5, 1, 0.5 및 0.1 ppm에 살균능을 조사한 예비실험에서 높은 살균력을 나타내는 최저 농도 0.5 ppm을 기준으로 희석하여 실측 농도 0.129, 0.246 및 0.455 ppm으로 구배되었다. C1O2 희석액과 세균 부유액의 반응은 1:1 정량 비로 행하였으며, 반응 시간은 30초, 1분, 3분, 5분, 10분으로 하였다.
- 129 ppm의 이산화염소에서 30초 동안 처리하였을 때 사멸되었다. 저농도 0.129 ppm에서는 반응 시간이 10분으로 길어질수록 V anguillarume 서는 생잔균의 증식은 관찰되지 않았으며, E. tarda는 생잔 균의 증식이 현저하게 지연되는 것이 확인되었다.
후속연구
- tarda 에 비하여 오히려 감수성이 높은 것으로 나타났다. 따라서 그람 염색성에 따른 어병세균들의 C1O2 살균 효과에 관한 비교는 더욱 검토가 필요할 것으로 판단되어졌다.
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