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문제 정의
- 본 연구에서는, 박테리오파아지 P2-P4 시스템의 연구를 위한변형체 P4인 플라스미드 상태의 P4 ash8(sid71) tetR을 in vitro 에서 생성하고 이를 미생물학적 방법으로 생물학적 활성을 갖는파아지로 얻어낸 다음 이에 대한 생물학적 연구를 수행하였다. 이렇게 얻어진 변형체 P4는 박테리오파아지 P2-P4 시스템을 이용한 packaging 연구에 유용한 연구 수단으로 쓰일 것이다.
제안 방법
- 숙주세포를 2xl08cells/ml의 농도까지 배양한 후이를 원심분리 하여 칼슘이 5mM 함유된 LB 배지에 녹였다. M.O.I. (multiplicity of infection) 값이 3정도 되도록 실험하고자하는 박테리오파아지를 파아지 stock으로부터 가해주고 7분간 흡착하도록 하였다. LB 배양액으로 100배 희석하여 37℃에서 배양하며, 원래 배양액의 흡광도 측정을 통해 파아지에 의한 완전용해가 일어날 때까지 배양을 계속하였다.
- 1, 380 bp 씩 genome이 증가하게 된다. P4 ash8(sid71) tetR 파아지의 CsCl 부양 균등밀도 편차실험을 통해 이러한 genome의 즣가가 어떻게 packaging에 영향을 끼치는지를 살펴보았다.
- P4 ash8(sid71) tetR을 플라스미드 상태로 함유하고 있는 E. coli Cla의 lawn을 만들고, P2 virl 파아지 용액을 그 위에 떨어뜨린 후 배양하여 용해지역(lysis area)을 얻었다. 용해지역의 agar plug를 멸균된 파스퇴르피펫으로 1 ml의 LB 배양액에 옮기고 5분 간 방치하여 agar plug와 함께 옮겨진 파아지가 용출되도록 하였다.
- 가능하다. P4 ash8(sid71) tetR이 박테리오파아지 형태로 증식할 수 있는지 여부를 보이기 위하여, 플라스미드 P4 ash8{sid71) tetR을 함유하는 E. coli Cl a의 lawn 에 도움 파이-지인 P2 virl 을감염시켜 파아지용액을 얻었다. 얻어진 파아지용액을 P2와 P4를 구분할 수 있는 지시숙주세포(indicator strain)에 각각 plating 한 결과, 파아지용액은 P4 지시숙주세포에서만 plaque를 형성하였으므로, 용출되어 나온 박테리오파아지가 P4 ash8(sid7J) tetR 인 것으로 확인하였다(자료 미제시).
- 이러한 유도체는 플라스미드 상태로 유지되며 항생제 내성 유전자의 도입으로쉽게 선택될 수 있는 이점이 있다. P4 크기의 머리(small head) 에만 들어갈 수 있는 P4 as과 P2 크기의 머리 (large head)에들어갈 수 있는 P4 ash8 에서 각각 똑같은 방법으로 새로운 플라스미드를 조성하여, 두 가지 다른 크기의 파아지 머리 내에 packaging 되는 P4 유도체를 얻었다. 편의상, sid기을 괄호안에 표기하여 두 가지 종류의 조성 및 반응이 일어난 것을 나타내었다.
- P4가 파아지로 증식하는 데에 영향을 끼치지 않는 것으로 알려진 P4 genome의 전반부에 위치하는 유전자 gop과 beta(Fig. 1) 부위를 tetracyclin 내성 유전자로 치환하기로 하였다. 재료 및 방법에 서술한 과정을 거쳐 tetracyclin 내성을 가지는 형질 전환체를 얻고 형질 전환체 플라스미드 DNA의 제한효소 단편 분석을통해 계획대로 조성된 P4 플라스미드 유도체인 P4 ash8(sid71) tetR을 확인하였다.
- PvII로 절단된 출발물질 P4 ash8(sid71)을 P4 DNA의 염기 배열번호 220에 있는 EcoRI 부위에서만 자르기 위해 EcoRI의 부분 절단반응(partial digestion)을 시행하였다. 반응시간과 효소 양을 달리하여 반응시킨 산물을 agarose gel 상에서 분석하여 원하는 10.
- Tetracyclin 내성 유전자를 얻기 위하여 pBR322를 우선 Aval 으로 절단하여 선형화한 후, Klenow fragment를 처리하여 양 말단을 blunt-end로 만들었다. 이것을 EcoRI으로 완전 절단하여 1.
- Transduction 실험을 수행하여 이를 입증하였는데, 우선 파아지용액을 E. coli Cla lawn에 spot하여 tetracyclin에 내성을 보이는 transductant를 얻고 여기에서 다시 플라스미드를 추출하여 제한효소 절단실험을 거쳐, 플라스미드가 P4 ash8(sid71) tetR 임을 agarose gel 상에서 확인할 수 있었다(자료 미제시).
- 원심 분리 후 튜브의 밑에 구멍을 내어 8방울을 한 분획(fraction) 으로 하여 모았다. 각 분획의 박테리오파아지 역가를 P4 지시 숙주세포를 상대로 plaque assay를 통해 결정하여 밀도 변화에 따른 파아지 분포도(density gradient profile)를 구하였다.
- 단일 플라크로부터 얻은 P4 ash8(.sid71) WR의 파아지 stock을 가지고 1단계 생장실험을 수행하여 burst size를 구하였다(Table 1). Table 1에서 보듯이, 유전자 재조합 과정을 통해 얻어진 P4의 유도체 파아지인 P4 ash8(sid71) tetR도 원형인 P4 ash8(sid71)과같이 활발히 박테리오파아지로 증식하였다.
- 박테리오파아지 P4 stock의 머리 크기 분포를 알아보기 위해파아지 stock의 일부(0.1 ml 이하)를, 평균 밀도가 1.38 g/ml 로맞추어진 CsCl 용액이 함유된 원심분리 튜브에 가하였다. 이 튜브를 Beckman L3-40 초고속 원심분리기를 사용하여 4P에서 55, 000 g(SW41.
- 박테리오파아지나 플라스미드를 갖고 있지 않은 coli Cla의 lawn을 tetracyclin 함유 평판배지에 만들었다. 실험하고자 하는 P4 변이체 파아지용액을 한 방울 떨어뜨려 371에서 배양하면, tetR 유전자를 가진 P4 변이체가 감염된 박테리아는 tetracyclin에내성을 나타내어 그 부위에서 colony를 형성하고 transductant로얻어진다.
- 절단반응(partial digestion)을 시행하였다. 반응시간과 효소 양을 달리하여 반응시킨 산물을 agarose gel 상에서 분석하여 원하는 10.67 kb, 0.96 kb 두 개의 단편이 나타나는 조건을 찾아 내었다. 그 조건은 1 gg P4 DNA 당 0.
- LB 배양액으로 100배 희석하여 37℃에서 배양하며, 원래 배양액의 흡광도 측정을 통해 파아지에 의한 완전용해가 일어날 때까지 배양을 계속하였다. 완전 용해된 배양액의 plaque assay를 통해 얻은 후손 파아지의 역가를, 처음 감염된숙주세포의 수로 나누어 burst size로 삼았다.
- 1 rotor 사용)로 60시간 동안 원심분리 하였다. 원심 분리 후 튜브의 밑에 구멍을 내어 8방울을 한 분획(fraction) 으로 하여 모았다. 각 분획의 박테리오파아지 역가를 P4 지시 숙주세포를 상대로 plaque assay를 통해 결정하여 밀도 변화에 따른 파아지 분포도(density gradient profile)를 구하였다.
- blunt-end로 만들었다. 이것을 EcoRI으로 완전 절단하여 1.42 kb의 te7(tetracyclin resistance) 유전자를 분리 하였다. 이 렇게 얻어진 tetR 함유 단편은 EcoRI 말단과 blunt-end 말단을 가지게 되고, 이를 P4 ash8 #에서 얻어진 Pwdl와 EcoRI으로부분 절단된 10.
- 1) 부위를 tetracyclin 내성 유전자로 치환하기로 하였다. 재료 및 방법에 서술한 과정을 거쳐 tetracyclin 내성을 가지는 형질 전환체를 얻고 형질 전환체 플라스미드 DNA의 제한효소 단편 분석을통해 계획대로 조성된 P4 플라스미드 유도체인 P4 ash8(sid71) tetR을 확인하였다.
- 항상 숙주세포내에서 플라스미드로 존재할 수 있는 P4 ash8을시작 물질로 삼아, 항생제 내성 유전자를 도입하고 도입 후 생물학적으로 완전한 파아지가 생성되도록 전체 P4 genome 의 크기를 조정하여 P4 플라스미드 유도체를 조성하였다. 이러한 유도체는 플라스미드 상태로 유지되며 항생제 내성 유전자의 도입으로쉽게 선택될 수 있는 이점이 있다.
대상 데이터
- Circular genetic map of P4 ash8(sid71) tetR. The fragment from EcoRl at 220 to Pvz/II at 1180 of P4 DNA sequence (refer to Fig. 1) was swapped with tetR of pBR322. The PvuH site was destroyed during construction, so the position of ligation is shown as (PvwII) at 1645 of P4 ash8(sid71) tetR DNA.
- 여러 종류의 제한효소, Klenow fragment, T4 DNA ligase등은 Gibco-BRL, NEB사 제품을 구입하여 생산자가 권고하는 조건에맞추어사용하였다. 본 실험에 사용된 일반적인 유전자 재조합기법은 Sambrook 등이 저술한 실험서에 따라 행하였다(9).
이론/모형
- 용하였다. 본 실험에 사용된 일반적인 유전자 재조합기법은 Sambrook 등이 저술한 실험서에 따라 행하였다(9).
성능/효과
- CsCl 균등밀도 분포 실험을 통해 P4 ash8(sid71) tetRe 2개의 genome이 P2 크기의 파아지 머리에 packaging되고, P4 ash8 sid기은 2개 또는 3개의 genome이 P2 크기의 파아지 머리에 packaging되는 것을 알게 되었다. P2 크기의 파아지 머리에는 2개의 P4 genome 크기 DNA(23.
- 9 kb)가 P2 크기 파아지 머리에 packaging된 2종류의 파아지들이 동일한 비율로 증식되어 얻어진 것이다. P4 ash8(sid71) R의 burst size가 P4 ash8 sid71^\ burst size 보다 크게 즉정되었는데 (Table 1 참조), 이를 통해 2개의 P4 또는 P4 유도체의 genome이 P2 크기의 머리에 packaging될 때 3개의 P4 genome 보다 더 효율적으로 packaging 되는 것을 알 수 있다.
- 2에 나타내었다. P4 ash8(sid71) WR의 전체 genome의 크기는, 이미 알고 있는 P4 및 tetracyclin 내성 유전자 함유 단편의 크기로부터 12.089 kb로 계산되어졌다. 이것은 출발물질인 P4 ash8 sid기의 11.
- P4 ash8 의 burst size 가 출발물질인 P4 ash8 보다 적게 얻어진 것은, P4 ash8 보다 460bp 큰 P4 ash8 R의 genome이 P4 크기의 파아지 머리에보다 덜 효율적으로 packaging되기 때문인 것으로 추정된다. P4 ash8(sid71) wR의 경우, P4 ash8 sid71 보다 효율적으로 P2 크기의 파이-지 머리에 packaging되는 것으로 나타났다. 이에 대한 분석은 CsCl 부양 균등밀도 편차실험결과와 같이 수행되어야 하므로 아래에서 논의 하겠다.
- coli Cl a의 lawn 에 도움 파이-지인 P2 virl 을감염시켜 파아지용액을 얻었다. 얻어진 파아지용액을 P2와 P4를 구분할 수 있는 지시숙주세포(indicator strain)에 각각 plating 한 결과, 파아지용액은 P4 지시숙주세포에서만 plaque를 형성하였으므로, 용출되어 나온 박테리오파아지가 P4 ash8(sid7J) tetR 인 것으로 확인하였다(자료 미제시).
- 25 kb인 P4 ash8(sid71) tetR의 3개의 genomee packaging되지 않았다. 이상을 통해 볼 때, P2 크기파아지 머리의 packaging 상한은 약 35.7 kb 일 것이라고 추정할수 있다.
후속연구
- 수행하였다. 이렇게 얻어진 변형체 P4는 박테리오파아지 P2-P4 시스템을 이용한 packaging 연구에 유용한 연구 수단으로 쓰일 것이다.
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