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문제 정의
- Bio-antimutagene 질병은 물론 유전독성물질에 의해 유도되는 돌연변이를 차단하여 암의 예방에 기여하기 때문에(13), 이에 저자들은 가시오갈피의 항돌연변이 물질을 규명하기 위해서 가시오갈피 뿌리의 클로르포름 분획물로부터 항돌연변이 성분을 분리, 동정하는 연구를 수행하는 중에 있다.
제안 방법
- 실시하였다. 즉 균 배양액(1~"IO, CFU/mL) 3 mL에 변이원인 1-NP 60 11L(12 |ig)를 첨가하고 37℃ 에서 210 rpm 으로 20분간 진탕배양하여 DNA 손상을 유도한 다음, 4, 500xg로 20분간 원심 분리하여 집균하였다. 집균한 균체를 3 mL의 0.
- 이러한 결과는 가시오갈피의 클로로포름 분획층이 간접변이원인 Trp-P-1과 2-AF에 대해 용량 의존적으로 돌연변이 억제효과를 나타내었다는 Park 등(12)의 연구 결과와 일치하고 있으며, 직접변이원에 대한 항돌연변이 효과를 나타내는 유효성분이 비극성 물질임을 시사하고 있다. 1-NP의 변이원성에 대한 억제효과가 확인됨에 따라 클로로포름 층을 10-300 ug/plate의 농도로 첨가하여 농도의 증가에 따른 돌연변이 억제효과를 검토하였다(Fig. 2). 5.
- Ames test (5. typhimurium TA98, TA100)에서 6종의 직접 변이 원에 대한 가시오갈피(뿌리, 줄기, 잎)의 메탄올 추출물 및 용매 분획물의 항돌연변이 효과를 고찰하였다. Salmonella typhimuriun TA98, TA100에서, 6종의 직접변이원으로 유도된 각각의 변이원성에 대한 가시오갈피 뿌리, 줄기 및 잎의 메탄올 추출물의 돌연변이 억제효과를 검색한 결과 1-nitropyrene의 변이원성에 대하여 선택적으로 강한 억제 효과를 나타내었다.
- Bio-antimutagen 시험에 있어서 1-NP로 돌연변이를 일으킨 균체에 가시오갈피 뿌리의 클로로포름 층 분획물을 50% 정도의 돌연변이 억제효과를 나타내는 농도인 200 yg/plate (뿌리와 줄기)와 100 ug/plate (잎)의 농도로 각각 첨가하고 37 ℃ 에서 0~60분간 진탕배양한 다음, Ames te効로 조사하였다. 1-NP에 의해 변이가 유도된 균체와 클로로포름 층 분획물이 접촉 반응하는 시간이 증가함에 따라 S.
- 가시오갈피의 뿌리, 줄기 및 잎 중 뿌리와 줄기는 증류수로 2~3회 수세한 다음 음건하였고, 잘게 세정하였다. 이들 시료의 일정량을 삼각플라스크에 넣고 10배량의 80% 메탄올을 첨가하여 40℃에서 10시간씩 3회 진탕 추출한 다음 여과하였다.
- 이 여과액을 4℃에서 12시간 동안 냉각하여 다시 여과하고, 그의 여과액을 감압 농축한 후 동결건조를 하였다. 각각의 부위에서 얻어진 80% 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 클로로포름, 부탄올 및 물층으로 순차적으로 분획하고 감압 농축한 다음 동결건조를 하였으며, 이 추출물들은 -20 ℃ 에 보관하고 dimethyl sulfoxide (DMSO) 에 용해하여 실험에 사용하였다.
- 항돌연변이 효과(억제율)는 [M-Si / (M-So) X 10이으로 계산하였고, 돌연변이원을 첨가하였을 때 복귀 돌연변이 주의 수를 M, 자연 복귀 돌연변이주의 수를 So, 돌연변이원과 시료를 첨가했을 때의 복귀 돌연변이주의 수를 &으로 나타내었다. 각각의 실험은 2반복 (2 plate x 2) 실시하였다.
- 기여하므로 그 중요성이 강조되고 있다(13). 따라서 가시오갈피 추출물의 이러한 가능성을 검토하기 위하여 저자들은 각각의 직접 변이원 (4-NQO, MNNG, NaN3, 4-NPD, 2-NF, l-NP)에 의해 유도된 돌연변이에 대한 가시오갈피 메탄올 추출물의 억제효과 및 그의 작용방식을 Ames test로 조사하였다.
- 5 mM histidine과 biotin을 함유한 top agar 2 mL를 혼합한 다음, minimal 이ucose agar plate 상에 도포하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 발생한 복귀 돌연변이주의 수를 계수하여 비교 판정하였다.
- 2에 하룻밤 배양시킨 균 배양액 (l~2xl09 CFU/mL) 100 uL를 혼합하고,37℃에서 210 rpm으로 20분간 진탕 배양하였다. 배양액에 0.5 mM histidine과 biotin을 함유한 top agar 2 mL를 혼합한 후 minimal glucose agar plate [agar 15 g, 멸균수 930 mL, 50 x VB salt 20 mL, 40% glucose 50 mL] 상에 도포, 37 ℃ 에서 48 시간 배양하여 발생한 복귀 돌연변이주 (his* revertant colony)의 수를 계수하여 항돌연변이원성을 판정하였다. 항돌연변이 효과(억제율)는 [M-Si / (M-So) X 10이으로 계산하였고, 돌연변이원을 첨가하였을 때 복귀 돌연변이 주의 수를 M, 자연 복귀 돌연변이주의 수를 So, 돌연변이원과 시료를 첨가했을 때의 복귀 돌연변이주의 수를 &으로 나타내었다.
- 1 M 인산나트륨 완충용액으로 세정하여 원심분리하고 다시 동량의 인산 완충용액으로 현탁하였다. 이 현탁액 100 J1L에 0.1 M 인산나트륨 완충용액 0.5 mL, 가시오갈피의 클로로포름 분획층 50 J1L (뿌리, 줄기 200 (ig/plate; 잎 100 Ug/plate)를 첨가하고, 37 ℃ 에서 0, 5, 10, 20, 40, 60분간 각각 진탕 배양하였다. 배양액에 0.
- 5%의 잎 분획물을 얻었다. 이를 이용하여 세포독성을 나타내지 않는 300 jig/plate (클로로포름 층, 부탄올 층)와 400 Jig/plate (물 층)의 농도에서 돌연변이 억제효과를 검색하였다(Fig. 1). S.
- 직접돌연변이원인 4-NQO, MNNG, NaN3, 4-NPD, 2-NF 및 1- NP에 의해 유도된 돌연변이에 대한 가시오갈피 뿌리, 줄기, 잎의 80% 메탄올 추출물의 억제효과를 S. typhimurium TA98과 TA100 균주를 이용하여 Ames test로 평가하였으며, 그 결과는 Table 1과 같다. 4NQO, MNNG, NaN3, 4-NPD 및 2- NF로 각각 돌연변이를 유발하였을 경우, 생육억제 및 돌연변이 원성을 나타내지 않는 농도인 500 yg/plate 농도(12)에서 8.
- 직접변이원의 경우 cytochrome P450에 의한 대사활성화 없이도 돌연변이를 유발할 수 있어 직접변이원에 대한 항돌연변이 원성은 세포 내 및 세포외 항돌연변이원성으로 정확하게 평가될 수 있기 때문에 직접 돌연변이원인 1-NP에 대한 가시오갈피 뿌리, 줄기, 잎의 클로로포름 층의 bio-antimutagen 및 desmutagen으로서의 작용기작을 검토하였다.
- 5 mM histidine과 biotin을 함유한 top agar 2 mL를 혼합한 후 minimal glucose agar plate [agar 15 g, 멸균수 930 mL, 50 x VB salt 20 mL, 40% glucose 50 mL] 상에 도포, 37 ℃ 에서 48 시간 배양하여 발생한 복귀 돌연변이주 (his* revertant colony)의 수를 계수하여 항돌연변이원성을 판정하였다. 항돌연변이 효과(억제율)는 [M-Si / (M-So) X 10이으로 계산하였고, 돌연변이원을 첨가하였을 때 복귀 돌연변이 주의 수를 M, 자연 복귀 돌연변이주의 수를 So, 돌연변이원과 시료를 첨가했을 때의 복귀 돌연변이주의 수를 &으로 나타내었다. 각각의 실험은 2반복 (2 plate x 2) 실시하였다.
대상 데이터
- Salmonella typhimurium TA98 (hisD3052 rfa AuvrB pKMIOl)과 TA100 (hisG46 rfa AuvrB pKMIOl)은 한국생명공학연구원 유전자 은행으로부터 분양 받아 각각의 유전형질을 확인한 후 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 가시오갈피는 전라북도 장수에서 재배된 시료를 장수 가시오갈피 영농조합으로부터 기증 받아 사용하였으며, 돌연변이원인 4-nittoquinoline N-oxide (4NQO)은 Sigm血사, 7V-methyl-/V-nitro-Ae -nitrosoguanidine (MNNG) 는 Fluk 사, sodium azide (NaN) 는 Junsei Chemical사, 4-nitro-l, 2-phenylenediamine (4-NPD), 2-nitrofluorene (2-NF), 1-nitropyrene (1- NP) 은 Aldrich 사 제품을 사용하였다. Salmonella typhimurium TA98 (hisD3052 rfa AuvrB pKMIOl)과 TA100 (hisG46 rfa AuvrB pKMIOl)은 한국생명공학연구원 유전자 은행으로부터 분양 받아 각각의 유전형질을 확인한 후 사용하였다.
이론/모형
- Bio-antimutagen 시험은 Ames test(14, 15)에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 즉 균 배양액(1~"IO, CFU/mL) 3 mL에 변이원인 1-NP 60 11L(12 |ig)를 첨가하고 37℃ 에서 210 rpm 으로 20분간 진탕배양하여 DNA 손상을 유도한 다음, 4, 500xg로 20분간 원심 분리하여 집균하였다.
- 돌연변이 억제시험은 Ames test (preincubation method) 로 실시하였다(14). 멸균시킨 시험관에 각 농도의 변이원 50 J1L, 0.
성능/효과
- typhimurium TA98과 TA100 균주를 이용하여 Ames test로 평가하였으며, 그 결과는 Table 1과 같다. 4NQO, MNNG, NaN3, 4-NPD 및 2- NF로 각각 돌연변이를 유발하였을 경우, 생육억제 및 돌연변이 원성을 나타내지 않는 농도인 500 yg/plate 농도(12)에서 8.9% 이하의 낮은 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 그러나 1-NP로 돌연변이를 유발하였을 경우, 틀변경 변이주인 S.
- 5%의 돌연변이 억제효과를 각각 나타내어 용량 의존적으로 돌연변이를 억제하였다. S. typhimurium TA100에서도 뿌리, 줄기, 잎의 억제효과는 최저 농도인 10 U g에서 7.6, 4.9, 24.5%, 최고 농도인 300 职에서 66.5, 66.3, 88.6%의 돌연변이 억제효과를 각각 나타내어 용량 의존적으로 돌연변이를 억제하였다.
- 따라서 1-nitropyrene 변이원의 돌연변이 원성에 대한 용매분획물의 활성을 비교한 결과 클로로포름 분획물이 가장 강한 억제효과를 나타내었다. S. typhimurium TA98, TA100에서, 뿌리의 클로로포름 분획물은 세포 내 항돌연변이 효과를 강하게 나타낸 반면 줄기와 잎은 세포 내 돌연변이 억제효과를 나타내지 않았다. 이 결과로부터 가시오갈피 뿌리에는 주로 세포 내 항돌연변이 효과를, 줄기와 잎에는 세포 외 항돌연변이 효과를 강하게 나타내는 활성 성분이 함유되어 있음을 알 수 있었다.
- 1). S. typhimurium TA98에서 가시오갈피의 뿌리 분획물은 각각 66.5, -4.8, 44%, 줄기 분획물은 각각 58.6, -5.6, -7.6%, 잎 분획물은 각각 86.5, -1.9, -0.7%의 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 또한 S.
- typhimurium TA98, TA100)에서 6종의 직접 변이 원에 대한 가시오갈피(뿌리, 줄기, 잎)의 메탄올 추출물 및 용매 분획물의 항돌연변이 효과를 고찰하였다. Salmonella typhimuriun TA98, TA100에서, 6종의 직접변이원으로 유도된 각각의 변이원성에 대한 가시오갈피 뿌리, 줄기 및 잎의 메탄올 추출물의 돌연변이 억제효과를 검색한 결과 1-nitropyrene의 변이원성에 대하여 선택적으로 강한 억제 효과를 나타내었다. 따라서 1-nitropyrene 변이원의 돌연변이 원성에 대한 용매분획물의 활성을 비교한 결과 클로로포름 분획물이 가장 강한 억제효과를 나타내었다.
- 3%의 억제효과를, 5. typhimurium TA100에서 각각 16.3, 21.7, 20.9%의 억제효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 6종의 직접변이원에 대한 가시오갈피 부위별 추출물은 1-NP의 변이원성에 대한 선택적인 억제효과를 나타내며, 부위별로는 뿌리 추출물이 가장 강한 억제효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 5. typhimurium TA98에서 뿌리, 줄기, 잎의 억제효과는 최저 농도인 10 Ug에서 6.9, 11.5, 1.0%, 최고 농도인 300 mg에서 61.6, 50.2, 84.5%의 돌연변이 억제효과를 각각 나타내어 용량 의존적으로 돌연변이를 억제하였다. S.
- 가시오갈피 뿌리, 줄기 및 잎의 메탄올 추출물을 순차적으로 용매 분획하여 클로로포름, 부탄올, 물 층으로 분획하였으며, 각각 수율 19.9, 21.2, 55.2%의 뿌리 분획물, 9.9, 15.8, 73.0%의 줄기 분획물, 7.3, 38.2%, 51.5%의 잎 분획물을 얻었다. 이를 이용하여 세포독성을 나타내지 않는 300 jig/plate (클로로포름 층, 부탄올 층)와 400 Jig/plate (물 층)의 농도에서 돌연변이 억제효과를 검색하였다(Fig.
- 9% 이하의 낮은 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 그러나 1-NP로 돌연변이를 유발하였을 경우, 틀변경 변이주인 S. typhimurium TA98에서는 뿌리, 줄기, 잎 추출물의 돌연변이 억제 효과는 각각 54.9, 29.5, 32.9%를 나타내었고, 염기쌍 치환 변이주인 S. typhimurium TA100에서는 각각 59.7, 30.2, 43.6%의 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 한편 100 ug/plate 농도를 처리했을 때는 S.
- Salmonella typhimuriun TA98, TA100에서, 6종의 직접변이원으로 유도된 각각의 변이원성에 대한 가시오갈피 뿌리, 줄기 및 잎의 메탄올 추출물의 돌연변이 억제효과를 검색한 결과 1-nitropyrene의 변이원성에 대하여 선택적으로 강한 억제 효과를 나타내었다. 따라서 1-nitropyrene 변이원의 돌연변이 원성에 대한 용매분획물의 활성을 비교한 결과 클로로포름 분획물이 가장 강한 억제효과를 나타내었다. S.
- 7%의 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 또한 S. typhimurium TA100에서 가시오갈피의 뿌리 분획물은 각각 69.1, 13.4, 12.2%, 줄기 분획물은 각각 64.1, 13.9, 11.9%, 잎 분획물은 각각 82.8, 9.2, 13.5%의 돌연변이 억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 가시오갈피의 클로로포름 분획층이 간접변이원인 Trp-P-1과 2-AF에 대해 용량 의존적으로 돌연변이 억제효과를 나타내었다는 Park 등(12)의 연구 결과와 일치하고 있으며, 직접변이원에 대한 항돌연변이 효과를 나타내는 유효성분이 비극성 물질임을 시사하고 있다.
- 1-NP에 의해 변이가 유도된 균체와 클로로포름 층 분획물이 접촉 반응하는 시간이 증가함에 따라 S. typhimurium TA98과 TA100에서 돌연변이 억제효과가 뚜렷하게 나타났고, 。분에 각각 188, 128개이었던 돌연변이주의 수가 60분간 접촉 반응하였을 때에는 각각 75, 86개로 감소하였으며 대조 구와 비교한 결과 각각 67.5, 39.4%의 억제효과를 나타내었다. 염기쌍 치환 변이주인 S.
- 4%의 억제효과를 나타내었다. 염기쌍 치환 변이주인 S. typhimurium TA100에서 보다 틀변경 변이주인 S. typhimurium TA98에서 강한 억제 효과를 나타내었다. 가시오갈피 줄기와 잎의 클로로포름 층에서는 접촉 반응시간이 증가하여도 돌연변이 억제효과를 거의 나타내지 않았다(Table 2).
- typhimurium TA98, TA100에서, 뿌리의 클로로포름 분획물은 세포 내 항돌연변이 효과를 강하게 나타낸 반면 줄기와 잎은 세포 내 돌연변이 억제효과를 나타내지 않았다. 이 결과로부터 가시오갈피 뿌리에는 주로 세포 내 항돌연변이 효과를, 줄기와 잎에는 세포 외 항돌연변이 효과를 강하게 나타내는 활성 성분이 함유되어 있음을 알 수 있었다.
- 9%의 억제효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 6종의 직접변이원에 대한 가시오갈피 부위별 추출물은 1-NP의 변이원성에 대한 선택적인 억제효과를 나타내며, 부위별로는 뿌리 추출물이 가장 강한 억제효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 가시오갈피 줄기와 잎의 클로로포름 층에서는 접촉 반응시간이 증가하여도 돌연변이 억제효과를 거의 나타내지 않았다(Table 2). 이러한 결과로부터 가시오갈피의 뿌리에는 세포 내에서 1-NP에 의해 손상된 DNA의 수복과 복제 등 DNA 대사에 관여하여 돌연변이 억제 효과를 나타내는 bio-antimutageno] 주로 함유되어 있고, 줄기와 잎에는 세포 밖에서 1-NP를 흡착하여 돌연변이 억제 효과를 나타내는 desmutagen 성분(22)이 함유되어 있음이 시사되었다.
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