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문제 정의
- 그동안 다양한 화학물질, 농약 및 오존 등의 산화촉진제에 노출된 동물모델을 대상으로 타우린의 항산화 활성을 보고한 연구는 다수 있었으나, 고지 혈증 상황에서 타우린의 항산화기능은 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구는 혈중 지질저하 효능을 지닌 타우린이 고콜레스테롤 식이뿐 아니라 무콜레스테롤식이를 섭취하는 흰쥐의 혈장과 간조직의 항산화 체계에 미치는 영향을 평가하고, 동시에 체내 콜레스테롤 및 타우린농도와 항산화체계와의 상관관계를 밝히고자 시도되었다.
- 본 논문은 타우린 및 콜레스테롤이 체내 항산화체계 및 지질과 산화물농도에 미치는 영향을 평가하기 위해 흰쥐를 대상으로 콜레스테롤(1.5%) 및 타우린(1.5%)이 첨가된 식이로 5주간 사육하였으며, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 첫 번째로 혈장의 MDA 농도는 콜레스테롤 또는 타우린 첨가에 의 해 유의한 영향을 받지 않은 반면, 간조직 의 MDA 농도는 HCD군에서 CD군에 비해 70% 유의하게 증가하였다(p< 0.
가설 설정
- 3)Values are mean ± SE of 8 rats.
제안 방법
- 5주간의 사육이 끝난 후 공복상태의 흰쥐를 에테르 마취하에 개복하고, 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취한 후 간을 적출하였다. 혈액은 heparin으로 처리된 튜브에 채취한 후, 4℃, 2,000xg에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하고, -70℃에 냉동 보관하였다.
- 00(34℃, 12분)을 25 mL/h의 유속에서 단계적으로 사용하였다. Column을 통해 분리 된 아미 노산을 ninhydrin 시 약으로 발색 시 킨 후 570 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 각 시료의 타우린함량은 아미노산 표준용액에서 얻어진 타우린 peak의 면적과 비교함으로써 계산하였다.
- 간조직 의 glutathione peroxidase(GSH-Px) 활성 은 Paglia 와 Valentine(21)과 Deagen 등(22)의 방법을 수정 하여 측정하였다. 간조직 에 0.
- 간조직의 총 superoxide dismutase(SOD) 활성은 Mar-klund와 Marklund(19) 및 Sheri 등(20)의 방법을 수정 하여 pyrogallol의 autooxidation 억제 정도를 측정하여 평가하였다. 간조직 에 0.
- , Mel Bourne, Australia)을 사용하였다. 기타 실험식이는 CD와 동일하되, HCD에는 1.5%의 콜레스테롤을, HTD에는 1.5%의 타우린을, 그리고 HCHTD에는 1.5%의 콜레스테롤과 함께 1.5%의 타우린을 각기 첨 가시 켰다. HCD, HTD 및 HCHTD의 총 중량은 첨가된 콜레스테롤과 타우린의 양만큼 당질의 양에서 제하여 일정하게 조절하였으며, 실험식이의 자세한 조성은 Table 1에 제시된 바와 같다.
- 섭취시켰다. 동물은 스텐레스 사육장에서 네 마리씩 분리 사육하였고, 실험기간동안 매주 2회 체중을 측정하였다.
- 0) 를 가하여 균질화시키고, 23, 700 x g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상층액 1 UL에 0.8 mL 반응혼합물(4.5 mM EDTA, 4.7 mM sodium azide를 포함한 0.125 M phosphate buffer, pH 7.0, 2.8 nM NADPH, 49.9 nM reduced glutathione, 0.67 units glutathione reductase)과 0.1 mL의 0.25 mM H2O2를 가하여 반응을 일으킨 즉시, 산화형 glutathione(GSSG)의 형성에 따른 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 341 nm에서 3분 동안 측정하였다. 즉, GSH-Px의 존재 하에 H2O2를 첨가시키면 산화형 glu-tathione(GSSG)이 생성되고, 반응액내에 존재하는 glutathione reductase와 NADPH에 의해 GSSG가 다시 GSH로 환원 되는 속도를 관찰함으로써 GSH-Px의 활성을 산출하였다.
- 이를 냉각시킨 후 n-butanol을 가하여 잘 섞어준 다음 17, 400Xg 에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 취하여 luminescence spectrophotometer(Aminco Bowman Series 2, #FA255, Am-inco, USA)를 이용하여 발양(excitation) 파장, 500 nm, 그리고 방출(emission) 파장, 553 nm에서 형 광강도를 각기 측정하였다. 이때 표준물질로는 1, 1, 3, 3-tetramethoxy propane(Sigma Co.
- 2 PL filter(PVDF Aerodisc, Gelman Sciences, USA)를 사용하여 여과하였다. 전처리된 시료의 타우린 농도는 ion-exchange chromatography (24) 에 입각한 아미노산 전용분석기 (Biochrom 20, Pharmacia LKB Biotech, Cambridge, England)를 사용하여 측정하였다. 즉, 여과된 시료 20 UL를 sample loading capsule을 통해 lithium high performance column(90 x 4.
- 25 mM H2O2를 가하여 반응을 일으킨 즉시, 산화형 glutathione(GSSG)의 형성에 따른 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 341 nm에서 3분 동안 측정하였다. 즉, GSH-Px의 존재 하에 H2O2를 첨가시키면 산화형 glu-tathione(GSSG)이 생성되고, 반응액내에 존재하는 glutathione reductase와 NADPH에 의해 GSSG가 다시 GSH로 환원 되는 속도를 관찰함으로써 GSH-Px의 활성을 산출하였다. 효소 1 unite 혈청 1 mL당 1분 동안 산화된 NADPH의 nmole 수로 나타내 었고, specific activity는 1 mg 단백질에 해당하는 효소 unit으로 환산하였다.
- 체중이 110~130 g인 Sprague-Dawley 계통의 수컷 흰쥐를 1주일간 환경 에 적응시 킨 후, 난괴 법 에 의해 8마리씩 4군으로 분류하여 각기 대조식이 (control diet, CD), 고타우린식이 (high-taurine diet, HTD), 고콜레스테롤식 이 (high-cho-lesterol diet, HCD), 그리고 고콜레스테롤 및 고타우린식이(high-cholesterol and high-taurine diet, HCHTD)로 5주간 사육하였다 . CD 는 무 콜레스테롤식이로서 지방 급원으로 10 %의 옥수수유를, 그리고 단백질급원으로는 18%의 카제인(Murray Glubum Cooperative Co.
- 혈장의 GSH-Px 활성을 측정하기 위하여는, 혈장 20 ㎕ 에 증류수를 가하여 100 UL로 채운 후, 0.8 mL 반응혼합물과 0.1 mL의 0.25 mM H2O2를 가하여 반응을 일으킨 즉시 , 간조직에서와 동일한 방법으로 흡광도의 변화를 측정하여 효소 활성을 산출하였다.
데이터처리
- 4)Values with different alphabets in the same row are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.
- 혈장과 간 조직의 항산화체계와 콜레스테롤 또는 타우린농도와의 상관관계는 Pearson correlation test로 분석하였다. 모든 수치의 통계분석은 SAS(SAS/STAT Version 6, SAS Institute Inc. Cary, NC, USA)를 이용하여 실시하였다.
- 모든 분석수치는 mean±SE로 표시하였다. 타우린 및 콜레스테롤 첨가식이가 체내 항산화체계에 미치는 효과는 two-way ANOVA(analysis of variance) 테스트에 의해 p<0.05 또는 p<0.01 수준에서 유의 성 여 부를 검 증하였으며 , 유의성이 나타날 경우 실험군간의 평균값의 차이는 Duncan's multiple range test에 의해 유의 성 을 검 증하였다. 혈장과 간 조직의 항산화체계와 콜레스테롤 또는 타우린농도와의 상관관계는 Pearson correlation test로 분석하였다.
- 01 수준에서 유의 성 여 부를 검 증하였으며 , 유의성이 나타날 경우 실험군간의 평균값의 차이는 Duncan's multiple range test에 의해 유의 성 을 검 증하였다. 혈장과 간 조직의 항산화체계와 콜레스테롤 또는 타우린농도와의 상관관계는 Pearson correlation test로 분석하였다. 모든 수치의 통계분석은 SAS(SAS/STAT Version 6, SAS Institute Inc.
이론/모형
- 간조직 과 혈장의 지질과산화물농도는 Buckingham(18)의 방법을 이용하여 malondialdehyde(MDA)농도를 측정하여 평가하였다. 간조직의 3배에 해당하는 0.
- 간조직의 콜레스테롤함량을 측정하기 위하여 우선 Folch 등(25)의 방법에 따라 약 1~2 g의 냉동 보관된 간조직을 chloroform-methanol 용액(2 :1, v/v)에서 균질화한 후 지질을 추출하였다. 지질 추출액에 함유된 콜레스테롤농도는 Zak(26)의 방법에 준하여 ferric chloride 시 약으로 발색 시 켜 560 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.
- 시료의 단백질함량은 Lowry 등(23)의 방법에 의해 정량하였으며, 단백질 표준물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 추출하였다. 지질 추출액에 함유된 콜레스테롤농도는 Zak(26)의 방법에 준하여 ferric chloride 시 약으로 발색 시 켜 560 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 혈장의 콜레스테롤 농도는 효소비색법(27)을 이용한 상업용 kit(Eiken Chemical Co.
- 지질 추출액에 함유된 콜레스테롤농도는 Zak(26)의 방법에 준하여 ferric chloride 시 약으로 발색 시 켜 560 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 혈장의 콜레스테롤 농도는 효소비색법(27)을 이용한 상업용 kit(Eiken Chemical Co., Japan)를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 3)Mineral mixture contained (g/100 g) CaCOs 29.29; CaHPO4 - 2H2O 0.43; KH2PO4 34.31; NaCl 25.06; MgSO4 - 7H2O 9.98; Fe(C6H5O7) - 6H2O 0.623; CuSO4 , 4H2O 0.156; MnSO4 • H2O 0.121; ZnCl2 0.02; KI 0.0005; NaaSeCh • H2O 0.0015; (NHeMsCe • 4H2O 0.0025.
- 05). HCD군의 간 무게는 CD군에 비해 유의적으로 증가하였으나, HCD에 타우린을 첨가해 준 결과 대조군과 비슷한 수준으로 감소하여 콜레스테롤 첨가에 의한 간 무게의 증가 현상이 타우린에 의해 상쇄되어짐을 알 수 있었다.
- 두 번째, 혈장 및 간조직의 GSH-Px 활성은 식이내 콜레스테롤 및 타우린 첨 가에 의해 유의한 영향을 받지 않았다. 간조직의 총SOD 활성은 타우린 첨가에 의해 감소되었으며 (p<0.05), HTD군에서 CD군에 비해 유의하게 감소하였고 (p<0.05), HCHTD군의 경우에는 HCD군에 비해 감소하는 경 향을 보였으나, 통계적 유의성은 나타나지 않았다. 세 번째, 혈장 및 간조직의 지질과산화물농도, 항산화효소 활성, 콜레스테롤 및 타우린농도와의 상관관계를 평가한 결과, 혈장 총콜레스테롤농도는 간조직의 콜레스테롤농도와 매우 유의한 양의 상관관계를 보였다(r=0.
- 05). 고콜레스테롤식이에 타우린을 첨가해 준 결과 간조직의 지질과산화물 농도가 HCD군에 비해 유의하게 감소한 반면 (p< 0.05), 콜레스테롤을 섭 취 하지 않는 상태에서 타우린을 첨가한 HTD군의 경우에는 간조직 MDA 농도가 대조군(CD)과 유의적인 차이를 나타내지 않아 식이내 타우린 첨가가 간의 지질과산화물 농도에 미치는 영향은 콜레스테롤 섭취 수준에 의해 그 결과가 상이하게 나타남을 알 수 있었다. 두 번째, 혈장 및 간조직의 GSH-Px 활성은 식이내 콜레스테롤 및 타우린 첨 가에 의해 유의한 영향을 받지 않았다.
- 05), 콜레스테롤을 섭 취 하지 않는 상태에서 타우린을 첨가한 HTD군의 경우에는 간조직 MDA 농도가 대조군(CD)과 유의적인 차이를 나타내지 않아 식이내 타우린 첨가가 간의 지질과산화물 농도에 미치는 영향은 콜레스테롤 섭취 수준에 의해 그 결과가 상이하게 나타남을 알 수 있었다. 두 번째, 혈장 및 간조직의 GSH-Px 활성은 식이내 콜레스테롤 및 타우린 첨 가에 의해 유의한 영향을 받지 않았다. 간조직의 총SOD 활성은 타우린 첨가에 의해 감소되었으며 (p<0.
- 본 연구결과에 의하면 같은 항산화효소이면서도 타우린 보충에 의해 간조직의 총 SOD 활성은 유의적으로 감소한 반면, GSH-Px 활성 에는 유의한 차이가 나타나지 않았는데(Table 3과 4), 이는 체내 항산화 방어체계에 있어서 위의 두 가지 효소가 작용하는 단계가 서로 다르기 때문인 것으로 풀이된다. Extracellular SOD, Mn-SOD와 Cu, Zn-SOD의 세 가지 형태로 존재하는 SOD는 항산화방어체계의 첫 번째 단계에서 작용하는 효소로서 독성이 강한 자유산소라디칼을 H2O2로 전환시 키 는 과정을 촉매 하고, 후자는 다시 gluta-thione peroxidase 또는 catalase의 촉매 작용에 의해 독성이 없는 물과 산소로 분해된다(40).
- 본 연구에서 간조직의 총 SOD 활성은 HTD군에서 CD군에 비해 유의하게 감소하였고(p<0.05), HCHTD군의 경우에는 HCD군에 비해 통계적 유의성은 나타나지 않았으나 감소하는 경향을 보였다. 이와 같이 타우린 보충섭취 에 의해 간조직의 SOD 활성이 감소한 본 연구의 결과는 식이에 비타민 E 또는 셀레늄-이 풍부할수록 체내 항산화효소의 활성이 감소된다는 선행 연구결과(31)를 고려할 때 타우린 또한 다른 항산화영 양소와 마찬가지로 체내에서 SOD 효소를 절약해 주는 효과가 있음을 시사하는 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과 혈장 및 간조직의 GSH-Px 활성은 식이내 콜레스테롤 및 타우린 첨 가에 의해 유의한 영향을 받지 않았다(Table 3). Yuan 등(30)은 다가불포화지 방산이 풍부한 생선유 또는 콩기 름을 지 질 급원으로 섭 취하는 흰쥐에게 콜레스테롤(0.
- 05), HCHTD군의 경우에는 HCD군에 비해 감소하는 경 향을 보였으나, 통계적 유의성은 나타나지 않았다. 세 번째, 혈장 및 간조직의 지질과산화물농도, 항산화효소 활성, 콜레스테롤 및 타우린농도와의 상관관계를 평가한 결과, 혈장 총콜레스테롤농도는 간조직의 콜레스테롤농도와 매우 유의한 양의 상관관계를 보였다(r=0.712 p<0.001). 혈장(r= 0.
- 05)를 나타냈다. 아울러 간조직의 콜레스테롤농도 역시 간 조직의 MDA농도와 유의한 양의 상관관계 (r=0.429, p<0.05) 를 나타냈으며, 이와 같은 결과는 고콜레스테롤혈증 상황에서 조직 의 지질과산화가 촉진될 수 있음을 시사하는 것이다. 혈장 타우린농도는 간조직의 콜레스테롤농도와 양의 상관성을 보였으나, 이 경우 통계적 인 유의성은 관찰되지 않았으며 (r=0.
- 05), 콜레스테롤의 과잉 섭취가 간조직의 지질과산화를 촉진시켰음을 알 수 있다. 여기서 흥미로운 점은 고콜레스테롤식이에 타우린을 첨가해 준 결과 간조직의 지질과산화물 농도가 HCD군에 비해 유의하게 감소한 반면(p<Q05), 콜레스테롤을 섭취하지 않는 상태에서 타우린을 첨가한 HTD군의 경우에는 간조직 MDA 농도가 대조군(CD)과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이와 같은 본 연구의 결과로 미루어 볼 때 식이내 타우린 첨가가 간의 지질과산화물 농도에 미치는 영향은 콜레스테롤 섭취수준에 의해 그 결과가 상이하게 나타남을 알 수 있다.
- Yuan 등(30)의 실험에서도 기능적으로 짝을 이룬 SOD와 catalase, 그리고 GSH-Px와 glutathione reductase 효소들이 식 이 지 방에 의해 서로 다르게 조절되는 것으로 보고되어 본 연구의 결과와 일치하고 있다. 이상에서와 같이 식 이내 타우린첨가가 간조직의 SOD 활성을 감소시키고 특히 고콜레스테롤식이 섭취시 간조직의 MDA 수준을 유의하게 감소시 킨 본 연구의 결과로 미루어 볼 때, 산화적 손상을 초래하지 않는 안전한 혈중 지질저하제로서 타우린의 이용 가능성을 전망해 볼 수 있겠다.
- 05), HCHTD군의 경우에는 HCD군에 비해 통계적 유의성은 나타나지 않았으나 감소하는 경향을 보였다. 이와 같이 타우린 보충섭취 에 의해 간조직의 SOD 활성이 감소한 본 연구의 결과는 식이에 비타민 E 또는 셀레늄-이 풍부할수록 체내 항산화효소의 활성이 감소된다는 선행 연구결과(31)를 고려할 때 타우린 또한 다른 항산화영 양소와 마찬가지로 체내에서 SOD 효소를 절약해 주는 효과가 있음을 시사하는 것으로 사료된다.
- 비율은 Table 2에 제시된 바와 같다. 절대적인 간 무게와 체중에 대한 간 무게의 비율 모두 식이내 콜레스테롤 첨가에 의해 유의적으로 증가하였으며 (p<0.05), 타우린 첨가에 의 해서는 유의적으로 감소하였다(p<0.05). HCD군의 간 무게는 CD군에 비해 유의적으로 증가하였으나, HCD에 타우린을 첨가해 준 결과 대조군과 비슷한 수준으로 감소하여 콜레스테롤 첨가에 의한 간 무게의 증가 현상이 타우린에 의해 상쇄되어짐을 알 수 있었다.
- 5%)이 첨가된 식이로 5주간 사육하였으며, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 첫 번째로 혈장의 MDA 농도는 콜레스테롤 또는 타우린 첨가에 의 해 유의한 영향을 받지 않은 반면, 간조직 의 MDA 농도는 HCD군에서 CD군에 비해 70% 유의하게 증가하였다(p< 0.05). 고콜레스테롤식이에 타우린을 첨가해 준 결과 간조직의 지질과산화물 농도가 HCD군에 비해 유의하게 감소한 반면 (p< 0.
- 001) 를 나타내, 두 가지 항산화효소의 활성이 서로 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있었다. 콜레스테롤이 산화촉진제로 작용하여 조직의 지질과산화가 촉진된 상황에서 타우린의 보충 섭취가 간조직의 SOD 활성을 감소시키고 MDA 수준을 유의하게 감소시킨 본 연구의 결과로 미루어 볼 때, 산화적 손상을 초래 하지 않는 안전한 혈중 지 질저 하제로서 타우린의 이용 가능성이 전망된다.
- 혈장의 MDA 농도는 콜레스테롤 또는 타우린 첨가에 의해 유의한 영향을 받지 않았다. 한편, 간조직의 MDA 농도는 HCD군에서 CD군에 비해 70% 유의하게 증가한 것으로 나타나(p< 0.05), 콜레스테롤의 과잉 섭취가 간조직의 지질과산화를 촉진시켰음을 알 수 있다. 여기서 흥미로운 점은 고콜레스테롤식이에 타우린을 첨가해 준 결과 간조직의 지질과산화물 농도가 HCD군에 비해 유의하게 감소한 반면(p<Q05), 콜레스테롤을 섭취하지 않는 상태에서 타우린을 첨가한 HTD군의 경우에는 간조직 MDA 농도가 대조군(CD)과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
- 01)를 나타냈다. 한편, 간조직의 총 SOD 활성은 간조직의 GSH-Px 활성과 유의한 양의 상관관계 (r=0.554, p< 0.001) 를 나타내, 두 가지 항산화효소의 활성이 서로 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있었다. 콜레스테롤이 산화촉진제로 작용하여 조직의 지질과산화가 촉진된 상황에서 타우린의 보충 섭취가 간조직의 SOD 활성을 감소시키고 MDA 수준을 유의하게 감소시킨 본 연구의 결과로 미루어 볼 때, 산화적 손상을 초래 하지 않는 안전한 혈중 지 질저 하제로서 타우린의 이용 가능성이 전망된다.
- 001). 혈장 총 콜레스테롤농도는 혈장 MDA 농도와 유의한 상관성을 나타내지 않은 반면(-0.136, p>0.05), 간조직의 MDA농도와는 유의한 양의 상관관계(r=0.399, p< 0.05)를 나타냈다. 아울러 간조직의 콜레스테롤농도 역시 간 조직의 MDA농도와 유의한 양의 상관관계 (r=0.
- 미치는 영향이 Table 3에 제시되어 있다. 혈장 타우린 농도는 식이내 타우린 첨가(1.5%) 시 타우린을 첨가하지 않은 군의 5.6~6.6배로 유의하게 증가하였다. 혈장의 MDA 농도는 콜레스테롤 또는 타우린 첨가에 의해 유의한 영향을 받지 않았다.
- 05)는 간조직 의 MDA농도와 유의한 양의 상관관계를 나타냈다. 혈장 타우린농도는 간조직의 GSH-Px 활성과는 유의하지는 않지만 음의 상관관계(r=-0.188, p>0.05)를, 그리고 간 조직 의 SOD 활성 과는 유의 적 인 음의 상관관계 (r=-0.481, p<0.01)를 나타냈다. 한편, 간조직의 총 SOD 활성은 간조직의 GSH-Px 활성과 유의한 양의 상관관계 (r=0.
- 05) 를 나타냈으며, 이와 같은 결과는 고콜레스테롤혈증 상황에서 조직 의 지질과산화가 촉진될 수 있음을 시사하는 것이다. 혈장 타우린농도는 간조직의 콜레스테롤농도와 양의 상관성을 보였으나, 이 경우 통계적 인 유의성은 관찰되지 않았으며 (r=0.200, p>0.05), 아울러 혈장 타우린농도와 혈장 또는 간 조직 의 MDA 농도 간에 는 유의 적 인 상관관계가 관찰되지 않았다. 혈장 타우린농도는 간조직의 GSH-Px 활성과는 유의하지는 않지만 음의 상관관계(r=-0.
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