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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 동결건조 녹용을 물추출하는 방법, 동결건조 녹용에 단백질 가수분해 효소를 작용 시키는 방법, 동결건조 녹용을 30분간 끓여서 단백질 가수분해 효소를 작용시키는 방법으로 효과적인 녹용 추출 방법을 찾았다. 그 결과, 비가열녹용은 6% 농도에서 6시간 후 추출율은 14.
- 그러나, 아직까지 녹용의 추출 및 가용화에 대한 과학적인 데이타가 없다. 본 연구는 동결건조 녹용을 대상으로 유효성분이 변질되지 않도록 저온에서 물추출 하고, 남은 부분을 가열 또는, 가열하지 않은 조건에서 단백질 가수분해효소로 추출하여 HPLC 분석, 단백질 및 아미노산 함량 분석, 분광광도 분석, 무기물 분석 등을 한 결과이다.
- 이어지는 논문은 녹용을 주줄하고 폐기하는 각질을 단백질 가수분해효소 및 염산으로 가용화시켜서 이용하는 방법을 찾아 분석한 결과이다.
제안 방법
- 100ml 삼각플라스크에 녹용을 각각 1%, 2%, 4%, 6%, 12% 가하고 나머지를 물로 채워 100ml로 만든 다음 50℃에서 시간별로 3ml씩 취하여 HPLC, 280nm에서의 흡광도 5% TCA 처리 용액의 흡광도를 분석하였다.
- 15) 10ml를 가하여 100ml로 하였다. 37℃에서 반응시키면서 1시간, 3시간 5시간째 샘플을 취하여 분해도, HPLC, 흡광광도 스펙트럼을 분석하였다.
- 동결건조 녹용을 물과 단백질 가수분해 효소로 추출하였다. 동결건조녹용을 물추출하는 경우, 추출효율 은 5% 농도로 50℃에서 6시간 추출하는 것이 가장 높았다.
- 시마쯔 HPLC(LC-10AD 펌프, SPD-10A 분광광도 검출기, 크로마토팩 C-R5A 적산기)를 사용하여 이동상은 0.2M NaCl을 함유한 0.1M K-인산완충액(pH 6.3), 고정상은 파마시아의 Superose 12(1.0 X 30cm), 유속 0.7ml/min로 280nm 및 210nm에서 검출하였다. 시료는 원심분리 (15,000rpm, 10분)하여 상징액을 주입하였다.
- 양이온성 무기물은 금속이온 유도결합 플라즈마 Mode Optima 3300(Perkinelmer사)을 사용하여 분석하였다. ICP-AES는 RF power 1300W, Coolant 가스유속 은 15리터/min, auxiliary 가스유속은 0.
- 와 Jet-tip nebulizer 을 사용하였다. 음이온성 무기물은 Water사 2690 HPLC 를 사용한 이온교환크로마 토그래피로, 컬럼은 IC Pak anion HR(4.6 X75mm)을 사용하여 Na2CO3 1.4mM과 NaHCOs 1.6mM 완충액으로 유속 Iml/min으로 분석하였다.37)
- 식품공전38)일반시험법의 회분시험법에 따랐다. 즉, 회화용기에 추출하여 동결건조한 녹용가루 2g을 넣고 회화로에서 600℃ 로 항량이 될 때까지 가열하여 중량을 측정하였다.
대상 데이터
- 녹용은 엔지디 코리아(주)의 뉴질 랜드산 적록녹용 의 동결건조 제품을 사용하였다. 분자량 표준물질은 시그마 제품을 사용하였다.
- 분자량 표준물질은 시그마 제품을 사용하였다. 단백질 가수분해 효소는 태평양(주)의 Protease NP(서Kt, 활성 470, 000pc/g), 시그마의 papain(EC 3.4.1.2, 파파야, 0.5unit/mg), pepsin A(EC 3.4.23.1, 돼지 위, 51unit/mg)을 사용하였다.
- 단백질은 시마쯔사의 분광광도기 UV-1601 을 사용하여 280nm에서 흡광도로 측정하였다. 아미노산은 시료 3ml에 5% trichloroacetic acid(TCA) 5ml를 가하고, No.
- 시료는 원심분리 (15,000rpm, 10분)하여 상징액을 주입하였다. 분자량 마커는 시그마사의 thyroglobulin(MW 670, 000), bovine serum albumin(MW 67, 000), ammonium moly- bdate(MW 1, 236), acetone(MW 56)을 사용하였다.
- 녹용은 엔지디 코리아(주)의 뉴질 랜드산 적록녹용 의 동결건조 제품을 사용하였다. 분자량 표준물질은 시그마 제품을 사용하였다. 단백질 가수분해 효소는 태평양(주)의 Protease NP(서Kt, 활성 470, 000pc/g), 시그마의 papain(EC 3.
- Biuret법을 사용하여 시료 Iml에 Biuret 시 약 4ml를 가한 다음 540nm에서 비색정량하였다. 표준 단백질로는 Hammerstein 카제인을 사용하였다.35)
이론/모형
- Biuret법을 사용하여 시료 Iml에 Biuret 시 약 4ml를 가한 다음 540nm에서 비색정량하였다. 표준 단백질로는 Hammerstein 카제인을 사용하였다.
- Nynhydrin법을 사용하여 시료 IrM에 0.2M 시트르산 완충액(pH 5.0) 0.5ml와 닌히드린 용액 1.2ml를 가하고 끓는 물로 15분동안 가열한 다음 60% 에탄올 10ml를 가하여 570iun에서 비색정 량하였다. 표준 아미노산으로는 L-leucine를 사용하였다36)
- 식품공전38)일반시험법의 회분시험법에 따랐다. 즉, 회화용기에 추출하여 동결건조한 녹용가루 2g을 넣고 회화로에서 600℃ 로 항량이 될 때까지 가열하여 중량을 측정하였다.
성능/효과
- 파파인은 분해율이 낮고, 210nm에서 더 큰 분자량으로 중합되었다. 280nm에서 30분보다 느린 피크는 패턴이 동일하였으나, 파파인은 다른 효소를 사용한 경우보다 39분 피크가 높았다. 생녹용 Blank의 21분보다 빠르게 유출되는 분자량 1백만 이상의 피크 넷은, 가장 큰 것만 남고 없어졌는데, 단백질이 열변성으로 침전되었기 때문이다.
- 효소는 세균 protease의 효율이 가장 높고, 다음 펩신이 었으나, 파파인은 효과가 미미하였다. 280nm의 흡광도로 단백질 추출율을 분석한 결과, 세균 protease는 비가열 녹용에 대하여 13.25, 가열녹용에 대하여 12.54를 나타내어 가 열 녹용이 1.8 낮았다. 추출된 것은 비가열 녹용 및 가 열녹용 모두 96%가 TCA에 침전되는 저분자 펩티 드와 아미노산이었다.
- 30분 끓인 녹용에 단백질 가수분해 효소를 가하여 5(TC 에서 5시간 추출한 결과, Table 3과 같이 세균 protease 추출액은 47.6%(흡광도 12.54)가 가용화되었고, 파파인추출액은 26.4%(흡광도 7.48), 펩신추출액은 45.6%(흡광도 7.23)로 세균 protease의 효율이 가장 높았다.
- HPLC로 분석한 결과는 Fig. 4와 같이 Blank의 21분 보다 빠른 분자량 100만 이상의 고분자 단백질은 세균 protease와 펩신을 사용한 경우 모두 분해되었다. 그래서 세균 protease 추출액은 210nm에서 24.
- HPLC로 추출물을 분석한 결과는 Fig. 1의 blank와 같이 일곱 가지 물질이 나타났고, 210nm와 280nm의 모습은 같으나, 210nm의 26분 피크는 280nm에서는 없고, 280nm에서 29.5분 피크는 16.0%였으나, 210nm에 서는 3.0%였다. 280nm의 36.
- 가열 녹용의 효소추출액을 분광광도계로 스캐닝 한 결과, Fig. 5와 같이 280nm의 흡광도는 세균 protease가 가장 많이 증가하였고, 그 다음 펩신, 파파인의 순이었으나 파파인은 거의 변화가 없었다. 생녹용의 400nm 피크는 가열로 침전되어 없어졌다.
- 따라서 본 연구에서는 동결건조 녹용을 물추출하는 방법, 동결건조 녹용에 단백질 가수분해 효소를 작용 시키는 방법, 동결건조 녹용을 30분간 끓여서 단백질 가수분해 효소를 작용시키는 방법으로 효과적인 녹용 추출 방법을 찾았다. 그 결과, 비가열녹용은 6% 농도에서 6시간 후 추출율은 14.37이었다. 효소는 세균 protease의 효율이 가장 높고, 다음 펩신이 었으나, 파파인은 효과가 미미하였다.
- 녹용농도가 높으면 녹용 부피가 많아져서 녹용에 남는 부분이 많아지므로 추출효율은 떨어지고 녹용농도가 낮으면 추출양은 많지만 추출물 농도가 낮아서 농축에 많은 경비가 들어서 비경제적이다. 그러므로 작업성과 효율성, 변성, 미생물 부패 등을 고려하면 녹용 5% 농도, 50 ℃ 에서 5시간 추출하는 것이 효과적인 것으로 판단된다.
- 23)였다. 단백질함량은 물추출액은 52.1%, 세균 protease 추출액은 37.8%였고, 아미노산 함량은 물추출액 은 16.3%, 세균 protease 추출액은 31.9%였다. 회분함량은 물추출액은 8.
- 추출된 것은 비가열 녹용 및 가 열녹용 모두 96%가 TCA에 침전되는 저분자 펩티 드와 아미노산이었다. 비가열 녹용에 대한 세균 protease의 가용화율은 33.4%이었으나 가열녹용은 47.6%로 14.2 %나 높았다. 이 같이 녹용을 가열하여 세균 protease를 작용시키면 비가열 녹용에 비하여 단백질 추출율은 저하되고, 다른 성분의 추출율이 높아졌다.
- 45 (73%)였다. 생녹용 결과와 비교하여, 세균 protease는 0.69, 펩신은 3.51 저하하였으나 파파인은 0.32 증가하였다. 이것은 가열로 단백질이 변성 침전되었으나 펩신과 파파인의 가수분해력이 부족하여 가용화시키지 못한 부분이 많은 것을 의미한다.
- 생녹용 추출액을 분광광도계로 스캐닝한 결과, Fig. 3과 같이 시간 경과에 따라 세균 protease와 펩신추출 액의 흡광도는 많이 증가하였으나, 파파인추출액은 그다지 증가하지 않았다. 파파인과 펩신추출액은 400nm의 피크에 변화가 없으나 세균 protease 추출액은 피크 높이가 낮아졌는데, 혈액성분이 일부 분해되었기 때문이다.
- 저분자화율은 세균 protease를 사용한 경우가 가장 높고 다음 pepsin인데, papain의 효과는 적었다. 생녹용에 단백질 가수분해 효소를 5시간 작용시켜서 얻은 추출액의 추출율은 세균 protease는 33.4% (280nm의 흡광도 13.25), papaine 22.4%(흡광도 10.06), pepsine 30.2%(흡광도 11.34)였다. 30분동안 끓인 녹용에 단백질 가수분해 효소를 5시간 작용시킨 용액의 추출율은 세균 protease는 47.
- 생녹용에 단백질 가수분해 효소를 가하여 5(rc에서 5시간 작용시킨 결과, Table 2와 같이 세균 protease추출액은 녹용의 33.4%(흡광도 13.25), 파파인 추출액은 22.4%(흡광도 10.06), 펩신 추출액은 30.2%(흡광도 11.34)가 가용화되어 세균 protease의 효율이 가장 높고, 파파인이 가장 낮았다. 대조군은 20.
- 1과 같다. 세균 protease 추출액은 blank의 21분보다 빠른 분자량 100만 이상의 피크들이 25분보다 느린 작은 분자량으로 분해되었고, 210nm에서는 검출되지 않는 작은 성분들이 280nm에서 검출되었다. 가장 많은 것은 25분의 분자량 1000 정도의 펩티드 피크로 세균 protease 추출액 은 210nm에서 추출물의 65.
- 이상의 결과로부터 동결건조 녹용을 50℃에서 6시간 물추출한 것은 효소 추출한 용액과 단백질 함량이 비슷하므로 먼저 저온에서 물추출하고, 남은 잔사에 효그 중 세균 protease 를 가하여 추출하는 방법이 좋고, 가열하면 단백질 추출량이 떨어지므로 단백질 추출을 목적으로 할 때는 가열하지 않는 것이 좋은 것으로 나타났다.
- 8 낮았다. 추출된 것은 비가열 녹용 및 가 열녹용 모두 96%가 TCA에 침전되는 저분자 펩티 드와 아미노산이었다. 비가열 녹용에 대한 세균 protease의 가용화율은 33.
- 동결건조녹용을 물추출하는 경우, 추출효율 은 5% 농도로 50℃에서 6시간 추출하는 것이 가장 높았다. 추출물을 HPLC 분석한 결과, 물추출액에 존재하던 고분자 단백질은 단백질 가수분해 효소에 의해 저분자화되었다. 저분자화율은 세균 protease를 사용한 경우가 가장 높고 다음 pepsin인데, papain의 효과는 적었다.
- 280nm에서의 흡광도는 세균 protease 추출액이 가장 높았다. 추출액에 TCA를 가하여 단백질을 제거하고 흡광도를 분석한 결과 세균 protease 추출액은 12.05 (96%), 펩신추출액은 7.14(98%), 파파인추출액은 5.45 (73%)였다. 생녹용 결과와 비교하여, 세균 protease는 0.
- 280nm의 흡광도는 세균 protease가 가장 높았다. 추출액에 TCA를 가하여 단백질을 제거하여 아미노산 및 펩티드의 흡광도를 분석한 결과는 세균 protease 추출 액은 12.74(96%), 펩신 추출액은10.65(94%)로 대부분 작은 펩티드나 아미노산으로 나타났다. 그러나 파파인 추출액은 5.
- 추출율은 생녹용을 효소로 추출한 것보다 세균 protease는 14.2%, 펩신은 7.23%, 파파인은 3% 증가되었다. 끓여서 녹는 성분이 증가하였기 때문이다.
- 추출물의 60~70%는 TCA에 침전되지 않는 아미노산 및 펩티드 기타 280nm 흡광성 물질이고 나머지 30~40%가 단백질로 볼 수 있다. 추출효율을 1%로 환산하면 1%일 때가 가장 높아서 6시간 후 3.61 이 었고, 6%는 2.40, 2%는 2.24를 나타냈다. 녹용농도가 높으면 녹용 부피가 많아져서 녹용에 남는 부분이 많아지므로 추출효율은 떨어지고 녹용농도가 낮으면 추출양은 많지만 추출물 농도가 낮아서 농축에 많은 경비가 들어서 비경제적이다.
후속연구
- 단백질 가수분해 효소에 의하여 추출된 녹용이 본래의 생리활성을 어느 정도 유지하는가에 대해서는 후속 연구에서 밝히려고 한다.
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