[논문]쇠고기 부산물로부터 혈압 상승 억제 펩타이드 분리 및 정제

장성현; 장애라; 김기진; 천용헌; 민중석; 이상옥; 이무하

doi:10.5187/jast.2003.45.2.319

쇠고기 부산물로부터 혈압 상승 억제 펩타이드 분리 및 정제
Purification and Isolation for Antihypertensive Peptides from Beef Heart and Spleen 원문보기

한국동물자원과학회지 = Journal of animal science and technology, v.45 no.2, 2003년, pp.319 - 326

장성현 (서울대학교 대학원 농생명공학부 근육식품학실) , 장애라 (서울대학교 대학원 농생명공학부 근육식품학실) , 김기진 (서울대학교 대학원 농생명공학부 근육식품학실) , 천용헌 (서울대학교 대학원 농생명공학부 근육식품학실) , 민중석 (서울대학교 대학원 농생명공학부 근육식품학실) , 이상옥 (서울대학교 대학원 농생명공학부 근육식품학실) , 이무하 (서울대학교 대학원 농생명공학부 근육식품학실)

초록
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본 실험은 쇠고기의 비 선호부위를 고도로 이용하기 위한 연구의 일환으로 쇠고기의 염통과 지라를 각종효소로 가수분해하여 얻은 분획물을 한외여과와 gel-filtration, 그리고 HPLC를 이용하여 분리 및 정제하여 얻은 펩타이드의 ACE 저해 활성을 검토한 실험이다. 쇠고기 염통과 지라에서 수용성 단백질을 추출한 다음 효소 처리하여 4, 8, 12, 24시간 동안 37$^{\circ}C$에서 배양하였다. 염통과 지라단백질의 가수분해물의 ACE 저해 활성을 측정한 결과 염통에서는 Thermolysin과 Proteinase A 효소를 12시간 혼합처리한 가수분해물에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여주었고 지라에서는 Thermolysin과 Protease 효소를 24시간 혼합처리한 가수분해물에서 ACE 저해 효과가 가장좋았다. ACE 저해효소가 가장 좋은 가수분해물을 Ultrafiltration 통해 분리하였으며, 분리 정제된 가수분해물을 Gel-filtration을 통해서 분획 하였다. 이때 염통에서는 F11, F36, F51, F63, F72의 큰 분획물을 얻었고 지라에서는 F30, F55, F71, F91에서 큰 분획물을 얻었다. 이 분획물들의 ACE 저해 활성을 측정한 결과 염통에서는 F72에서 $IC_{50}$값 0.37mg/ml로 ACE 저해 활성이 가장 좋았다. 지라에서는 F30에서 $IC_{50}$값 1.840 mg/ml로 ACE 저해 활성이 가장 좋았다. 그리고 여기서 활성이 좋은 염통을 가지고 Reversed- Phase HPLC를 이용하여 분리 한 결과 4개의 큰 피크들을 얻을 수 있었다. 그 결과 peak 1, peak 2, peak 3, peak 4의 IC50값은 각각 0.28mg/ml, 0.26mg/ml, 0.25mg/ml, 0.35mg/ml이었다. 이 peak들의 아미노산을 분석한 결과, peak 1에서는 glycine과 methionine, peak 2는 proline, cystine, methionine, peak 3는 proline, peak 4는 alanine, methionine, leucine 이 주요 구성 성분 아미노산이었다. 위 실험 결과로서, 염통과 지라에서의 ACE저해 활성은 염통이 지라보다 좋았고, 특히 Thermolysin과 Proteinase A 효소를 12시간 배양한 염통단백질 가수분해물에서 가장 좋은 ACE 저해 활성 peptide을 얻을 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Angiotensin-I converting enzyme(ACE)inhibitor was isolated from beef by-products. The beef by- product hydrolysates prepared with various proteases were tested for the inhibitory effects against ACE. The proteases used were proteinase A from bakers yeast, protease type ⅩIII fungal and thermolysin. The maximum inhibitory effect was observed after hydrolysis for 12hrs(beef heart) and 24hrs(beef spleen), respectively. After gel filtration, IC50 value was 0.37mg/ml in beef heart and 1.84mg/ml in beef spleen. After RP-HPLC, the IC50 value of peak 1, peak 2, peak 3 and peak-4 were 0.28mg/ml, 0.26mg/ml, 0.25mg/ml and 0.35mg/ml, respectively. In the results of amino acid composition of peak 1, peak 2, peak 3 and peak 4, it was observed that peak 1 was consisted mainly of glycine and methionine, peak 2 was proline, cystine and methionine, peak 3 was proline and peak 4 was alanine, methionine and leucine. In conclusion, beef heart hydrolysate treated with thermolysin+ proteinase A was shown to have the highest inhibitory effect for 12hrs incubation at 37$^{\circ}C$.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 실험은 쇠고기의 비 선호부위를 고도로 이용하기 위한 연구의 일환으로 쇠고기의 염통과 지라를 각종효소로 가수분해하여 얻은 분획 물을 한외여과와 gel-filtration, 그리고 HPLC를 이용하여 분리 및 정제하여 얻은 펩타이드의 ACE 저해 활성을 검토한 실험이다.
본 연구에서는 쇠고기의 비 선호부위를 고도로 이용하기 위한 연구의 일환으로 쇠고기의 염통과 지라를 각종효소로 가수분해하여 얻은 펩타이드를 한외여과, gel 여과, RP-HPLC를 통해 분리 및 정제하여 얻은 펩타이드의 ACE 저해 활성을 검토하였다.

제안 방법

1. (cid:3372)(cid:2263)(cid:2496)(cid:1)(cid:1646)(cid:1842)(cid:1)(cid:1086)(cid:2299)(cid:2073)(cid:3303)(cid:1947)(cid:2628)(cid:1)ACE (cid:2679)(cid:3303)(cid:1)(cid:3357)(cid:2239) 염통단백질과 지라단백질을 0, 4, 8, 12, 24시간 동안 Thermolysin, Protease type (cid:470)(cid:463), Pro- teinase A, Thermolysin+Protease type (cid:470)(cid:463), Thermolysin+Proteinase A, Protease type (cid:470)(cid:463)(cid:1) + Proteinase A의 효소들을 첨가하여 단백질을 가수분해한 단백질의 ACE저해 활성을 측정하였다(Table 1, Table 2).
염통과 지라단백질의 가수분해물의 ACE 저해 활성을 측정한 결과 염통에서는 Thermolysin과 Proteinase A 효소를 12시간 혼합처리한 가수분해물에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여주었고 지라에서는 Thermolysin과 Protease 효소를 24시간 혼합처 리한 가수분해물에서 ACE 저해 효과가 가장좋았다. ACE 저해효소가 가장 좋은 가수분해 물을 Ultrafiltration 통해 분리하였으며, 분리 정 제된 가수분해물을 Gel-filtration을 통해서 분획 하였다
Pharmachia Biotech XK26을 이용하여 분자량별로 Auto fraction collector로 받아낸 후 UV-spectrophotometry에서 측정하였다. 이때 She- phadex G-25 Column을 사용하였고 Flow rate는 1.
좋았다. ultrafiltration과 gel 여과를 통해 얻은 분획물에서, ACE 저해 활성이 가장 좋은 분획물(F72)을 가지고, RP-HPLC를 사용하여 다시 분리 및 정제하여 4개의 피크들을 얻었다 (Fig. 3). 이 피크들을 분획한 다음 각각의 분획물의 ACE 저해 활성을 측정하였다.
전 처리된 시료를 건조시키고 다시 증류수를 첨가한 후, 시료를 유도 체화 시킨 후, HPLC 분석을 행하였다. 분석은 WatersTM 600s controller, Waters TM 626pump, WatersTM 474 Scanning Fluorescence Detecter를 사용하였고 columne AccQ-Tag Amino Acid Analysis Column을 사용하였으며 분석 중에는 37(cid:141)로 유지하였다. 이때 이동상으로는 Eluent A를 사용하였고, Eluent B는 60% acetonitrile를 사용하였다.
쇠고기 염통과 지라에서 수용성 단백질을 추 출한 다음 효소 처리하여 4, 8, 12, 24시간 동 안 37℃에서 배양하였다. 염통과 지라단백질의 가수분해물의 ACE 저해 활성을 측정한 결과 염통에서는 Thermolysin과 Proteinase A 효소를 12시간 혼합처리한 가수분해물에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여주었고 지라에서는 Thermolysin과 Protease 효소를 24시간 혼합처 리한 가수분해물에서 ACE 저해 효과가 가장좋았다.
염통단백질과 지라단백질을 0, 4, 8, 12, 24시 간동안 Thermolysin, Protease type ⅩⅢ, Proteinase A, Thermolysin+Protease type ⅩⅢ, Thermolysin+Proteinase A, Protease type ⅩⅢ + Proteinase A의 효소들을 첨가하여 단백질을 가 수분해한 단백질의 ACE저해 활성을 측정하였 다(Table 1, Table 2).
3). 이 피크들을 분획한 다음 각각의 분획물의 ACE 저해 활성을 측정하였다. 그 결과 peak 1, peak 2, peak 3, peak 4의 각각 IC₅₀값은 0.
sep-pak C₁₈ cartridge(Waters, USA)를 통과시켜 단백질, 지질 등의 고분자 물질과 색소를 제거하였다. 전 처리된 시료를 건조시키고 다시 증류수를 첨가한 후, 시료를 유도 체화 시킨 후, HPLC 분석을 행하였다. 분석은 WatersTM 600s controller, Waters TM 626pump, WatersTM 474 Scanning Fluorescence Detecter를 사용하였고 columne AccQ-Tag Amino Acid Analysis Column을 사용하였으며 분석 중에는 37(cid:141)로 유지하였다.

대상 데이터

실험에 사용될 샘플은 지라, 염통, 허파, 간을 예비실험 하여 ACE저해 활성이 좋은 쇠고기 염통과 지라를 선택하여 무균 상태에서 근내지방을 완전히 제거한 후 수용성 단백질을 추출하여 동결 건조시킨 deep freezer에 보관하였다. Rabbit lung acetone powder, Proteinase A (bakers yeast), Protease type (cid:470)(cid:463)(cid:1) fungal, Thermolysin, 기질로 쓰이는 Hippuryl-histidyl- leucine (Hip-His-Leu)는 Sigma Chemical Co.
분석은 WatersTM 600s controller, Waters TM 626pump, WatersTM 474 Scanning Fluorescence Detecter를 사용하였고 columne AccQ-Tag Amino Acid Analysis Column을 사용하였으며 분석 중에는 37(cid:141)로 유지하였다. 이때 이동상으로는 Eluent A를 사용하였고, Eluent B는 60% acetonitrile를 사용하였다.(cid:463).

이론/모형

ACE 저해효과 측정은 Cushman(1971) 등의 방법에 의하여 행하였다. 즉, 반응 구는 0.
Peptide의 총 아마노산 분석은 AccQ-Tag 방법에 따랐다. 적당량의 시료에 6N HCl 200(cid:587)를 넣고 Vacuum-nitrogen flushing step을 3차례 교대로 실시한 후 112~116(cid:141)에서 20~24시간 가수 분해시킨다.
단백질 정량은 Lowry 등의 방법을 따라 측정하였으며, Bovine serum albumin(Sigma Co. USA)을 사용한 표준 곡선에 의하여 환산하였다.

성능/효과

RP-HPLC 통해서 얻은 분획물(peak 1, peak 2, peak 3, peak 4)을 AccQ-Tag 방법으로, RP-HPLC(AccQ-Tag Amino Acid Analysis Column) 를 사용하여 얻은 분획물의 아미노산 조성을 분석한 결과 peak 1에서는 glycine(74.0%) and methionine (10.6%), peak 2는 proline (18.0%), cystine(28.7%), methionine (36.5%), peak 3는 proline(58.5%), peak 4는 alanine(19.9%), meth- ionine(24.1%) and leucine (24.5%)이 주요 구성성분 아미노산이었다(Table 4).
이 피크들을 분획한 다음 각각의 분획물의 ACE 저해 활성을 측정하였다. 그 결과 peak 1, peak 2, peak 3, peak 4의 각각 IC₅₀값은 0.28, 0.26, 0.25, 0.35mg/(cid:588)값을 얻을 수 있었다. 이 피크들의 분획물의 ACE 저해활성은 이제까지 보고된 ACE 저해 펩타이드들의 IC₅₀ 값들과 비교하였을 때 다소 낮은 값을 나타내었다(Ariyoshi 등, 1993).
결과이다. 그 결과 염통에서는 5개의 큰 fraction(F11, F36, F51, F63, F72)을 얻게 되었고(Fig. 1), 이들 fraction들의 ACE 저해 활성을 측정결과, F72에서 IC₅₀값 0.37mg/(cid:588)로 ACE 저해 활성이 가장 좋았다. 지라에서는 4개의 큰 fraction(F30, F55, F71, F91)을 얻게 되었고 (Fig.
지라의 ACE 저해 효과는 Thermolysine 8시간배양, Protease type (cid:470)(cid:463)는 12시간배양, Proteinase A, Thermolysin+Proteinase A, Thermolysin+Protease type (cid:470)(cid:463), Protease type (cid:470)(cid:463)+Proteinase A 는 24시간 배양에서 ACE활성이 가장 좋았다 (Table 2). 그 중에서도 24시간 배양 한 Ther- molysin+Protease type (cid:470)(cid:463)가 지라 단백질에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여주었다. 위에
840 mg/㎖로 ACE 저해 활성이 가장 좋았다. 그리 고 여기서 활성이 좋은 염통을 가지고 ReversedPhase HPLC를 이용하여 분리 한 결과 4개의 큰 피크들을 얻을 수 있었다. 그 결과 peak 1, peak 2, peak 3, peak 4의 IC50값은 각각 0.
여러가지 효소 처리한 염통단백질 중에서 Thermolysin+Proteinase A를 12시간 배양한 후 얻은 가수분해물이 가장 ACE 저해 활성이 가장 좋았다. ultrafiltration과 gel 여과를 통해 얻은 분획물에서, ACE 저해 활성이 가장 좋은 분획물(F72)을 가지고, RP-HPLC를 사용하여 다시 분리 및 정제하여 4개의 피크들을 얻었다 (Fig.
쇠고기 염통과 지라에서 수용성 단백질을 추 출한 다음 효소 처리하여 4, 8, 12, 24시간 동 안 37℃에서 배양하였다. 염통과 지라단백질의 가수분해물의 ACE 저해 활성을 측정한 결과 염통에서는 Thermolysin과 Proteinase A 효소를 12시간 혼합처리한 가수분해물에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여주었고 지라에서는 Thermolysin과 Protease 효소를 24시간 혼합처 리한 가수분해물에서 ACE 저해 효과가 가장좋았다. ACE 저해효소가 가장 좋은 가수분해 물을 Ultrafiltration 통해 분리하였으며, 분리 정 제된 가수분해물을 Gel-filtration을 통해서 분획 하였다
위 실험 결과로서, 염통과 지라에서의 ACE 저해 활성은 염통이 지라보다 좋았고, 특히 Thermolysin과 Proteinase A 효소를 12시간 배 양한 염통단백질 가수분해물에서 가장 좋은 ACE 저해 활성 peptide을 얻을 수 있었다.
이때 염통에서는 F11, F36, F51, F63, F72의 큰 분획물을 얻었고 지라에서는 F30, F55, F71, F91에서 큰 분획물을 얻었다. 이 분획물들의 ACE 저해 활성을 측정한 결과 염통에서는 F72 에서 IC50값 0.37mg/㎖로 ACE 저해 활성이 가 장 좋았다. 지라에서는 F30에서 IC50값 1.
37mg/(cid:588)로 ACE 저해 활성이 가장 좋았다. 지라에서는 4개의 큰 fraction(F30, F55, F71, F91)을 얻게 되었고 (Fig. 2), 이들 fraction들의 ACE 저해 활성을 측정한 결과, F30에서 IC₅₀값 1.84mg/(cid:588)로 ACE 저해 활성이 가장 좋았다.
12시간 동일 Thermolysin +Proteinase A를 처리배양한 염통단백질에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여준다. 지라의 ACE 저해 효과는 Thermolysine 8시간배양, Protease type (cid:470)(cid:463)는 12시간배양, Proteinase A, Thermolysin+Proteinase A, Thermolysin+Protease type (cid:470)(cid:463), Protease type (cid:470)(cid:463)+Proteinase A 는 24시간 배양에서 ACE활성이 가장 좋았다 (Table 2). 그 중에서도 24시간 배양 한 Ther- molysin+Protease type (cid:470)(cid:463)가 지라 단백질에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여주었다.
12시간 동일 Thermolysin +Proteinase A를 처리배양한 염통단백질에서 가 장 좋은 ACE 저해 효과를 보여준다. 지라의 ACE 저해 효과는 Thermolysin은 8시간배양, Protease type ⅩⅢ는 12시간배양, Proteinase A, Thermolysin+Proteinase A, Thermolysin+Protease type ⅩⅢ, Protease type ⅩⅢ+Proteinase A는 24시간 배양에서 ACE활성이 가장 좋았다 (Table 2). 그 중에서도 24시간 배양 한 Thermolysin+Protease type ⅩⅢ가 지라단백질에서 가장 좋은 ACE 저해 효과를 보여주었다.

참고문헌 (23)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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