본 연구는 후각점막에 내재하는 zinc의 분포를 형태학적으로 뚜렷이 보여준 예가 없기에 조직화학적으로 염색한 후 광학 및 전자현미경으로 이들의 분포를 기술하고자 하였다. 실험동물로는 성숙한 수컷 랫드(SD 계통)를 사용하였다. 우선 동물은 전신마취시킨 후 만들어진 selenium 용액 $100{\mu}l$를 복강에 주사하였고(i.p 실험군), 다른 방법으로는 selenium 용액 $100{\mu}l$를 비강 깁숙히 플라스틱관을 삽입한 후 Hamilton 주사기로 한 방울씩 떨어뜨렸다(i.n 실험군). 후각점막내 zinc를 조직화학법으로 동정하기 위해서 zinc 특이성이 높은 AMG법(Danscher, 1985)을 이용하였다. 각 실험군의 동물은 주사 후 2시간에 이르러 3% Glutaraldehyde 고정액으로 관류함으로써 희생시켰다. 고정후 비중격을 포함하여 후각부위를 떼어낸 수 $30{\mu}l$ 두께의 관상절편을 만들었다. AMG 반응이 끝나면 toluene blue (TB)로 대조염색하고, 알코올과 자일렌 등을 이용한 탈수과정 및 청명과정을 거쳐 광학현미경하에서 관찰하였다. 전자현미경적 절편을 만들기 위해 전자현미경 관찰을 위한 실험으로 vibratome을 사용하여, $100{\mu}m$ 두께의 가로절편을 만들었고, AMG염색이 끝나면 일반적인 전자현미경적 관찰을 위한 일련의 과정을 거쳐 투과전자현미경하에서 관찰하였다. Selenium 용액을 복강에 투여한 i.p 실험군에서는 $30{\mu}m$ 두께의 후각점막의 상층부와 기저부에서 강한 AMG 반응산물(silver grains)이 관찰되었으나 기저막아래 고유판에서는 전혀 관찰되지 않았다. 반면 selenium 용액을 비강점막에 직접 도포한 i.n 실험군에서는 i.p 실험군과 같이 후각점막에서 강한 AMG 반응이 관찰되었을 뿐만 아니라 이러한 반응이 기저막내 후각실의 주행을 따라 관찰되었다. 투과전자현미경으로 관찰된 후각상피에서는 AMG 과립이 지지세포의 세포 상층부에서 관찰되는 분비과립에 국한되는 소견이며, 이곳에서 관찰된 AMG은 과립(silver grains)은 원형 또는 난원형으로 그 크기는 다양하였다. 반면 세포체 하부에서 관찰된 AMG grains은 주로 용해소체위에서 밀집되어 관찰되었으며, 핵주변부 및 세포사이공간(intercellular space)에서는 AMG grains이 낱개로 구분, 관찰되었다. 한편 i.n 실험군에서 관찰된 후각점막의 전반적인 구조가 손상된 소견을 보였으며, 지지세포의 위쪽에서는 전자밀도가 높고 간상의 crystalloid structure가 다수 관찰되었고, 이들 구조에 다수의 AMG 과립이 붙어 있었다. 본 연구의 결과를 요약하면 랫드 후각점막에 존재하는 zinc는 지지세포의 분비과립과 후각세포의 축삭다발인 후각실에서 관찰되었는데 이는 zinc가 후각기능과 매우 밀접한 관련있음을 시사하며, 이는 향후 후각기능과 zinc의 연관성을 연구하는데 소중한 자료가 될 것으로 믿는다. 또한 본 연구의 결과는 후각점막의 이상으로 나타나는 여러 가지 질환의 병리에서 zinc가 영위하는 신경생물학적 기능을 밝히는데 유용한 기초자료가 될 수 있을 것으로 기대한다.
본 연구는 후각점막에 내재하는 zinc의 분포를 형태학적으로 뚜렷이 보여준 예가 없기에 조직화학적으로 염색한 후 광학 및 전자현미경으로 이들의 분포를 기술하고자 하였다. 실험동물로는 성숙한 수컷 랫드(SD 계통)를 사용하였다. 우선 동물은 전신마취시킨 후 만들어진 selenium 용액 $100{\mu}l$를 복강에 주사하였고(i.p 실험군), 다른 방법으로는 selenium 용액 $100{\mu}l$를 비강 깁숙히 플라스틱관을 삽입한 후 Hamilton 주사기로 한 방울씩 떨어뜨렸다(i.n 실험군). 후각점막내 zinc를 조직화학법으로 동정하기 위해서 zinc 특이성이 높은 AMG법(Danscher, 1985)을 이용하였다. 각 실험군의 동물은 주사 후 2시간에 이르러 3% Glutaraldehyde 고정액으로 관류함으로써 희생시켰다. 고정후 비중격을 포함하여 후각부위를 떼어낸 수 $30{\mu}l$ 두께의 관상절편을 만들었다. AMG 반응이 끝나면 toluene blue (TB)로 대조염색하고, 알코올과 자일렌 등을 이용한 탈수과정 및 청명과정을 거쳐 광학현미경하에서 관찰하였다. 전자현미경적 절편을 만들기 위해 전자현미경 관찰을 위한 실험으로 vibratome을 사용하여, $100{\mu}m$ 두께의 가로절편을 만들었고, AMG염색이 끝나면 일반적인 전자현미경적 관찰을 위한 일련의 과정을 거쳐 투과전자현미경하에서 관찰하였다. Selenium 용액을 복강에 투여한 i.p 실험군에서는 $30{\mu}m$ 두께의 후각점막의 상층부와 기저부에서 강한 AMG 반응산물(silver grains)이 관찰되었으나 기저막아래 고유판에서는 전혀 관찰되지 않았다. 반면 selenium 용액을 비강점막에 직접 도포한 i.n 실험군에서는 i.p 실험군과 같이 후각점막에서 강한 AMG 반응이 관찰되었을 뿐만 아니라 이러한 반응이 기저막내 후각실의 주행을 따라 관찰되었다. 투과전자현미경으로 관찰된 후각상피에서는 AMG 과립이 지지세포의 세포 상층부에서 관찰되는 분비과립에 국한되는 소견이며, 이곳에서 관찰된 AMG은 과립(silver grains)은 원형 또는 난원형으로 그 크기는 다양하였다. 반면 세포체 하부에서 관찰된 AMG grains은 주로 용해소체위에서 밀집되어 관찰되었으며, 핵주변부 및 세포사이공간(intercellular space)에서는 AMG grains이 낱개로 구분, 관찰되었다. 한편 i.n 실험군에서 관찰된 후각점막의 전반적인 구조가 손상된 소견을 보였으며, 지지세포의 위쪽에서는 전자밀도가 높고 간상의 crystalloid structure가 다수 관찰되었고, 이들 구조에 다수의 AMG 과립이 붙어 있었다. 본 연구의 결과를 요약하면 랫드 후각점막에 존재하는 zinc는 지지세포의 분비과립과 후각세포의 축삭다발인 후각실에서 관찰되었는데 이는 zinc가 후각기능과 매우 밀접한 관련있음을 시사하며, 이는 향후 후각기능과 zinc의 연관성을 연구하는데 소중한 자료가 될 것으로 믿는다. 또한 본 연구의 결과는 후각점막의 이상으로 나타나는 여러 가지 질환의 병리에서 zinc가 영위하는 신경생물학적 기능을 밝히는데 유용한 기초자료가 될 수 있을 것으로 기대한다.
The present study was designed to demonstrate ionic zinc in the rat nasal mucosa by means of zinc selenium autometallography ($ZnSe^{AMG}$). Rats were given sodium selenide either intraperitoneally (i.p) or intranasally (i.n). Prior to the i.n. administration the rats were anesthetized wi...
The present study was designed to demonstrate ionic zinc in the rat nasal mucosa by means of zinc selenium autometallography ($ZnSe^{AMG}$). Rats were given sodium selenide either intraperitoneally (i.p) or intranasally (i.n). Prior to the i.n. administration the rats were anesthetized with pentobarbital sodium (30 mg/kg, i.p.). A thin plastic tube coupled to a Hamilton syringe was then inserted into the right nostril and $10{\mu}l$ of the solution was instilled. For the i.p. administration non-anesthetized rats were given $100{\mu}l$ of the sodium selenide solution (10 mg/kg). Control rats were instilled with saline. After 2 hrs survival, the rats were anaesthetized and transcardially perfused with 3% glutaraldehyde. The olfactory area was removed and put into same fixative. The nose was then sectioned ($30{\mu}m$) horizontally, autometallography (AMG) was performed according to Danscher et al. (1997). After silver enhancement, fine AMG grains were scattered in the whole length of the olfactory epithelium containing olfactory receptor neurons, sustentacular and basal cells. However, much higher concentration of the AMG grains occupied near the surface and in the basal region of the olfactory epithelium. Both groups of i.p. and i.n. administration showed almost same level in the concentration of the AMG grains. In i.n. group, few AMG grains were also found in olfactory nerves of the lamina propria, suggesting zinc transport into the olfactory bulb via olfactory axons. At the electron microscopic level, the AMG grains were most entirely found in the supporting cells of the olfactory epithelium, and they were mostly localized in lysosome-like organelles. The i.n. group showed various signs of tissue damage of the olfactory mucosa, where dense concentration of AMG grains were localized at crystalloid structures. The present study demonstrated dense population of ionic zinc in the rat olfactory epithelium. zinc may play a role in the olfactory functioin and in the pathogenesis of the neurodegerative disorders affecting nose.
The present study was designed to demonstrate ionic zinc in the rat nasal mucosa by means of zinc selenium autometallography ($ZnSe^{AMG}$). Rats were given sodium selenide either intraperitoneally (i.p) or intranasally (i.n). Prior to the i.n. administration the rats were anesthetized with pentobarbital sodium (30 mg/kg, i.p.). A thin plastic tube coupled to a Hamilton syringe was then inserted into the right nostril and $10{\mu}l$ of the solution was instilled. For the i.p. administration non-anesthetized rats were given $100{\mu}l$ of the sodium selenide solution (10 mg/kg). Control rats were instilled with saline. After 2 hrs survival, the rats were anaesthetized and transcardially perfused with 3% glutaraldehyde. The olfactory area was removed and put into same fixative. The nose was then sectioned ($30{\mu}m$) horizontally, autometallography (AMG) was performed according to Danscher et al. (1997). After silver enhancement, fine AMG grains were scattered in the whole length of the olfactory epithelium containing olfactory receptor neurons, sustentacular and basal cells. However, much higher concentration of the AMG grains occupied near the surface and in the basal region of the olfactory epithelium. Both groups of i.p. and i.n. administration showed almost same level in the concentration of the AMG grains. In i.n. group, few AMG grains were also found in olfactory nerves of the lamina propria, suggesting zinc transport into the olfactory bulb via olfactory axons. At the electron microscopic level, the AMG grains were most entirely found in the supporting cells of the olfactory epithelium, and they were mostly localized in lysosome-like organelles. The i.n. group showed various signs of tissue damage of the olfactory mucosa, where dense concentration of AMG grains were localized at crystalloid structures. The present study demonstrated dense population of ionic zinc in the rat olfactory epithelium. zinc may play a role in the olfactory functioin and in the pathogenesis of the neurodegerative disorders affecting nose.
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제안 방법
그 후 Jar를 꺼내어 developer를 40°C 수돗물로 몇 차례 헹군다. AMG 반옹이 끝나면 toluene blue (TB)로대조염색하고, 알코옱과 자일렌 동을 이용한 탈수과정 및 청명과정을 거쳐 반영구적인 광학현미경 조지표본을 완성 하여, 광학현미경 하에서 관찰하였다.
전혀 없었다. TB로 염색된 랫드 후각점막의 일반적인 구조를 관찰하였다 후각상피와 고유판 (lamina propria)으로 이루어진 후각점막으로 덮여 있으며, 코안의 천정을 이루는 뼈바깥막 (periosteum)에 붙어 있다. 후각점막의 고유판은 성긴결합조지으로 뼈 바깥막에 붙어 있으며, 그 속에 혈관, 림프관, 후각신경 및 후각샘 (Bowman^ gland)이 존재하였다(Fig.
n)하는 실험군으로 대별하였다. 복강주사를 위해서는 우선 동물은 전신마취시킨 후 만들어 진 selenium 용액 100 u1를 복강에 주사하였고, 다론 방법으로는 selenium 용액 10u1를 비강깊숙히 플라스릭관을 삽입한 후 Hamilton 주사기로 한 방을씩 떨어뜨렸다.
우선생리식염수만을 복강에 주사한 대조군, selenium을복강주사한 실험군, 그리고 selenium을 지접 비강점막에 투여한 실험군 등 3개의 실험군으로 나누어 각군에 10마리씩 배정하였다.
이를 위해 sodium selenide (20 mg/kg, Sigma)를 생리식염수 5 mb에 늑여 만든 selenium용액을 만들었다. 이 연구에서는 두 가지 다론 방법, 즉 복강주사(i.p)하는 실험군과 비강내 지접 점적 (i.n)하는 실험군으로 대별하였다. 복강주사를 위해서는 우선 동물은 전신마취시킨 후 만들어 진 selenium 용액 100 u1를 복강에 주사하였고, 다론 방법으로는 selenium 용액 10u1를 비강깊숙히 플라스릭관을 삽입한 후 Hamilton 주사기로 한 방을씩 떨어뜨렸다.
selenium을 생체내에 주사하여야 한다. 이를 위해 sodium selenide (20 mg/kg, Sigma)를 생리식염수 5 mb에 늑여 만든 selenium용액을 만들었다. 이 연구에서는 두 가지 다론 방법, 즉 복강주사(i.
또한 cytotoxic reactive oxygen species의 형성과 oxidative stress를 억제하는 copper-zinc supero xide dismustase가 rective oxygen species의 투여 에 의해 사람의 후각점막에서 고농도로 발현된다는 것을면역조지화학법으로 보여준 바 있다 (Kulkarni-Narla etaL, 1996). 이상의 연구들은 후각점막내 zinc가 고능도로 존재하며, 그 곳에서 이들이 갖는 기능 또한 다양할 것임을 시사하고 있으나 아지까지 후각점막에 내재하는 zinc의 분포를 형태학적으로 기슽된 연구가 부족한 실정 이다따라서 본 연구에서는 랫드후각점막에 분포하는 zinc를 조지화학적으로 동정하고 이들의 분포양상을 광학 및 전자현미경하에서 기슽하고자 하였다.
이어서 AMG법은 위에서 말한 동일한 방법으로 하되 단지 다른점 은 슬라이 드와 Jar를 이 용하지 않고, 유리 그롯안에서 염색이 이루어졌다 그후 일반적인 전자현미 경 포매 과정 , 즉 후고정 , 틸수 및 epon 포매과정 을거쳐, ultramicrotome 에서 2 |im 두께의 semi thin sec-tion을 만들어 광학현미 경 으로 관찰하고, 필요한 부위를 찾아 100nm의 thin section을 만들어 우라닐과 납 을 이용한 이중염색을 시행한 후 투과전자현미경(Zeiss TEM 109, Germany)하에서 관찰하였다.
전자현미경적 절편을 만들기 위해 전자현미경 관찰을 위한 실험으로 vibratome을 사용하여, 100um 두께의 가로절편을 만들어 유리그롯에 모았다. 이어서 AMG법은 위에서 말한 동일한 방법으로 하되 단지 다른점 은 슬라이 드와 Jar를 이 용하지 않고, 유리 그롯안에서 염색이 이루어졌다 그후 일반적인 전자현미 경 포매 과정 , 즉 후고정 , 틸수 및 epon 포매과정 을거쳐, ultramicrotome 에서 2 |im 두께의 semi thin sec-tion을 만들어 광학현미 경 으로 관찰하고, 필요한 부위를 찾아 100nm의 thin section을 만들어 우라닐과 납 을 이용한 이중염색을 시행한 후 투과전자현미경(Zeiss TEM 109, Germany)하에서 관찰하였다.
대상 데이터
이번 연구에서는 성숙한 수컷 랫드 (Sprague- Dawley 계 통) 30마리 를 실험동물로 사용하였다. 우선생리식염수만을 복강에 주사한 대조군, selenium을복강주사한 실험군, 그리고 selenium을 지접 비강점막에 투여한 실험군 등 3개의 실험군으로 나누어 각군에 10마리씩 배정하였다.
이론/모형
후각점막내 zinc를 조지화학법으로 동정하기 위해서 zinc 룩이 성 이 높은 AMG법 (Danscher, 1985)을 이용하였다. 각 실험군의 동물은 주사 후 2시 간에 이 르러 pentobarbital sodium(30mg/kg, i.
성능/효과
; 1995). 이상의 결과들은 zinc가 분명 정상적인 신경계동의 발달 뿐만 아니라 노화에 따론 신경기능의 저하에 밀접한 관련 이 있옴을 시사한다.
zinc pool이 있었다. 즉, 분비과립 또는 용해 소체 위에 밀집되어 있는 것과 륵정 세포소기관과 관련 없이 사이토졸 (cytosol)에 낱개로 혼어져 존재하고 있는 것으로 구분되었다. 더욱이 분비과립에 따라 과립의 능도가 다르게 나타났는뎨 전자밀도가 높고 크기가 작은 과립에 가장 높은 밀집도를 보였다 이러한 결과는 Jo etaL(2000)가 파네스세포에서 보고한 결과와도 일치하는 것으로 이는 분비과립의 발생단계 또는 분비 과립의 화학적 조성에 따른 차이라고 사료된다 본 연구에서 는 대부분의 AMG 과립 이 후각세 포를 주변의 지지세포에 밀집되어 있었으며, 룩히 분비 과립과 용해소체에 국한되어 있었다.
후각소포에는 다수의 긴 사립체와 소량의 과립세포질세망이 있었고, 후각섬모가 상피의 표면쪽으로 뻗어 있었다. 지지세포에는 많은 미세융모가 나 있었으며, 핵은 세포의 위쪽에 위치하였고, 이질염색질이 적었고, 뚜렷한 핵소체를 갖고 있었다세포질에는 다량의 사립서L 과립세포질세망, 골지체 등의 소기관들이 잘 발달되어 있었으며, 자유면 쪽에는 전자밀도가 낮은 점액과립 이 관찰되었다. 기저세포는 지저막쪽에 치우쳐 있으며, 세포질 내 소기관의 발달은 미약하였다.
후속연구
본 연구에서는 selenium 용액을 후각점막에 지접도포하였을 때의 AMG 결과가 복강내 투여한 것과그 양상에 뚜렷한 차이를 보였다 룩히 후각점막의조지학적 인 구조가 파괴되고, 미세구조에 변형 이 초래되었옴은 sodium selenide 자체의 득성을 의미하며, 이는 약물투여 후 30분 이내에 실험동물에서 심한호홉곤란이 초래되고 치사율이 높았던 것과 상호 관련이 있다고 판단된다 그러나 문헌에서 후각점막에대한 selenium의 세포독성에 관한 연구를 찾을 수 없었으며, 이는 비강으로 투여하는 selenium의 종류, 능도 루여량 및 투여 후 경과시간에 따론 세포득성의양상이 어떻게 다론지 연구되어야 할 과제 이다 한편변형된 세포질내에는 전자밀도가 높고, 막대모양의결정 체 (crystalloid structures)가 세 포체 위 쪽, 즉 자유면에 가까운 곳에서 다수 관찰되 었고 룩이하게도 다량의 AMG 과립들이 이들 구조에 밀착되어 있옴이관찰되었다, 본 연구자들은 이러한 결정구조의 본체가 무엇인지는 모르지만 AMG과립 이 밀집되었던 점으로 미루어 복강투여군에서 보여준 분비과립들이 selenium의 독성으로 변성되어 나타난 것이 아닌가사료된다, 세포득성에 따론 결정구조의 출현에 관한연구로 Kim et aL(1994)이 세포토닌 억제제인 para- chloro phenyl alanine 이 랫드 췌장에 대한 득성으로 과립형질내세망(rough endoplasmic reticulum, RER)내 결정함유물 (crystalline inclusion)을 만든다고 보고한바 있다
본 연구의 결과는 후각점막의 이상으로 나타나는여러 가지 질환의 병리에서 zinc가 영위하는 신경생물학적 기농을 밝히는뎨 유용한 기초자료가 될 수있을 것으로 기대한다
본 연구의 결과룰 요약하면 랫드 후각점막에 존재하는 zinc는 지지세포의 분비과립과 후각세포의 축삭 다발인 후각실에서 관찰되 었는뎨 이는 zinc가 후각 기능과 매우 밀접한 관련있음을 시사하며, 이는 향후 후각 기능과 zinc의 연관성을 연구하는뎨 소중한 자료가 될것으로 믿는다
참고문헌 (26)
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