Objectives : Peripheral blood-buffy coat fractions (N=14,956) have been stored at $-70^{\circ}C$ in the headquarter of the Korean Multicenter Cancer Cohort (KMCC), since 1993. To study the future molecular etiology of cancers using specimens of the cohort, properly stored specimens are ne...
Objectives : Peripheral blood-buffy coat fractions (N=14,956) have been stored at $-70^{\circ}C$ in the headquarter of the Korean Multicenter Cancer Cohort (KMCC), since 1993. To study the future molecular etiology of cancers using specimens of the cohort, properly stored specimens are necessary, Therefore, the DNA-viability of the bully coat samples was investigated. Methods : Buffy coat fraction samples were randomly selected from various collection areas and years (N=100). The DNA viability was evaluate from the UV-absorbent ratios at 260/280nm and the PCH for $\beta$-globin was performed with genomic DNA isolated from the buffy coat. Results : PCR products were obtained from 85 and 98% of the C and H area-samples, respectively, using 50 or $100{\mu}l$ of the buffy coat. There were significant differences in the yields of the PCR-amplifications from the C and H areas (p<0.05), which was due to differences in the homogenization of the buffy coat fractions available as aliquots. The PCR-products were obtained from all of the samples (N=7) stored at the C area-local confer, but the other aliquots stored at the headquarter were not PCR-amplified, Therefore, the PCR products in almost all the samples, even including the DNA-degraded samples, were obtained. In addition, an improvement in the DNA isolation, i,e. approx. 1.6 fold, was found after using extra RBC lysis buffer. Conclusions : PCR products for $\beta$-globin were obtained from nearly all of the samples. The regional differences in the PCR amplifications were thought to have originated from the different sample-preparation and homogenization performance. Therefore, the long term-stored buffy coat species at the KMCC can be used for future molecular studies.
Objectives : Peripheral blood-buffy coat fractions (N=14,956) have been stored at $-70^{\circ}C$ in the headquarter of the Korean Multicenter Cancer Cohort (KMCC), since 1993. To study the future molecular etiology of cancers using specimens of the cohort, properly stored specimens are necessary, Therefore, the DNA-viability of the bully coat samples was investigated. Methods : Buffy coat fraction samples were randomly selected from various collection areas and years (N=100). The DNA viability was evaluate from the UV-absorbent ratios at 260/280nm and the PCH for $\beta$-globin was performed with genomic DNA isolated from the buffy coat. Results : PCR products were obtained from 85 and 98% of the C and H area-samples, respectively, using 50 or $100{\mu}l$ of the buffy coat. There were significant differences in the yields of the PCR-amplifications from the C and H areas (p<0.05), which was due to differences in the homogenization of the buffy coat fractions available as aliquots. The PCR-products were obtained from all of the samples (N=7) stored at the C area-local confer, but the other aliquots stored at the headquarter were not PCR-amplified, Therefore, the PCR products in almost all the samples, even including the DNA-degraded samples, were obtained. In addition, an improvement in the DNA isolation, i,e. approx. 1.6 fold, was found after using extra RBC lysis buffer. Conclusions : PCR products for $\beta$-globin were obtained from nearly all of the samples. The regional differences in the PCR amplifications were thought to have originated from the different sample-preparation and homogenization performance. Therefore, the long term-stored buffy coat species at the KMCC can be used for future molecular studies.
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문제 정의
있다. KMCC 코호트는 한국인에서 빈발하는 암의 원인을 역학적으로 구명하기 위하여 전향적 코호트 연구를 수행할 수 있는 지역사회 단위 대규모 전향적 코호트를 구축함을 목적으로 하였다 [1, 2]. 이 코호트를 통하여 특정 암과 개인 생활습관, 환경적 요인 및 숙주 요인과의 관련성을 역학적으로 규명함은 물론, 암 발생에 관련된 여러 생체지표, 개인 숙주 감수성 및종양 표지자와의 관련성을 분자역학적으로 구명함으로써 향후 암의 원인에 관한 새로운 가설을 증명할 수 있도록 생체시료 은행을 연구 개시단계에서 구축하는것을 또 하나의 목적으로 하였다.
본 연구에서는 2003년 현재, 최장 10년간 냉동 보관되고 있는 생체시료, buffy coat의 DNA 생활성도를 점검함으로써 향후 DNA 분석을 중심으로 하는 연구의 타당성을 평가해 보고자 하였다.
KMCC 코호트는 한국인에서 빈발하는 암의 원인을 역학적으로 구명하기 위하여 전향적 코호트 연구를 수행할 수 있는 지역사회 단위 대규모 전향적 코호트를 구축함을 목적으로 하였다 [1, 2]. 이 코호트를 통하여 특정 암과 개인 생활습관, 환경적 요인 및 숙주 요인과의 관련성을 역학적으로 규명함은 물론, 암 발생에 관련된 여러 생체지표, 개인 숙주 감수성 및종양 표지자와의 관련성을 분자역학적으로 구명함으로써 향후 암의 원인에 관한 새로운 가설을 증명할 수 있도록 생체시료 은행을 연구 개시단계에서 구축하는것을 또 하나의 목적으로 하였다. 한국인을 대표하는 대규모 인구집단을 대상으로 코호트로 구축하고자 KMCC 코호트는 일반 지역사회에 거주하는 지역 주민중 현지에서 수행되는 암 선별검진사업(cancer screening)0]] 자발적으로 참여하는 30세 이상 성인 남-녀 모두를 대상에 포함하였다.
제안 방법
house keeping gene인 /?-globin 유전자의 PCR을 시행하였으며 [6], PCR의 증폭유무로 buffy coat로부터 얻은 DNA의 생활성도를 평가하였다. 즉, buffy coat 50 또는 100 R로부터 genomic DNA를 추출한 후, 2 用의 genomic DNA (DNA량으로 약 100 ng), 각 20 pmole의 primer (sense, 5'-CCACCTCA TCCACGTTCACC-3; antisense, 5' -G A AG AGCC AAGGA-CAGGTAC-3), universal PCR mixture (Bioneer, Daejon, Korea)을 혼합한 20 R 의 PCR 반응 액 을 thermocycler(GeneAmp PCRsystem 2700, Applied Biosystem, Foster city, CA)에 적용하여 PCR (94 °C, 4분; '94 분; 54 1 분; 72 t, 1 분 으로 35 cycle; 72 °C, 5분)을 실시하였다.
즉, buffy coat 50 또는 100 R로부터 genomic DNA를 추출한 후, 2 用의 genomic DNA (DNA량으로 약 100 ng), 각 20 pmole의 primer (sense, 5'-CCACCTCA TCCACGTTCACC-3; antisense, 5' -G A AG AGCC AAGGA-CAGGTAC-3), universal PCR mixture (Bioneer, Daejon, Korea)을 혼합한 20 R 의 PCR 반응 액 을 thermocycler(GeneAmp PCRsystem 2700, Applied Biosystem, Foster city, CA)에 적용하여 PCR (94 °C, 4분; '94 분; 54 1 분; 72 t, 1 분 으로 35 cycle; 72 °C, 5분)을 실시하였다. PCR 산물의 생성 여부는 PCR이 끝난 반응액을 5 用 씩 1.5 % agarose gel 상에 전기 영동 후 ethidium bromide로 염색하여 Mylmager™ (서린바이오사이 언스, Seoul, Korea)로 확인하였다.
각 buffy coat로부터 Wizard Genomic DNA purification kit (Promega, Madi son, WI)와 동회사에서 제공한 protocol 에 따라 genomic DNA를 추출하고, UV-spectrophoto meter로 DNA의 흡광도를 측정하여 DNA의 질과 양을 평가하였다.
house keeping gene인 /?-globin 유전자의 PCR을 시행하였으며 [6], PCR의 증폭유무로 buffy coat로부터 얻은 DNA의 생활성도를 평가하였다. 즉, buffy coat 50 또는 100 R로부터 genomic DNA를 추출한 후, 2 用의 genomic DNA (DNA량으로 약 100 ng), 각 20 pmole의 primer (sense, 5'-CCACCTCA TCCACGTTCACC-3; antisense, 5' -G A AG AGCC AAGGA-CAGGTAC-3), universal PCR mixture (Bioneer, Daejon, Korea)을 혼합한 20 R 의 PCR 반응 액 을 thermocycler(GeneAmp PCRsystem 2700, Applied Biosystem, Foster city, CA)에 적용하여 PCR (94 °C, 4분; '94 분; 54 1 분; 72 t, 1 분 으로 35 cycle; 72 °C, 5분)을 실시하였다. PCR 산물의 생성 여부는 PCR이 끝난 반응액을 5 用 씩 1.
한편, DNA 추출시 그 추출 수득률을 높이기 위 한 방법으로 적혈구 용해 (RBC lysis)가 불완전하지 않았나 의심하여 1차 PCR에서 PCR 산물을 얻지 못한 본부 보관 시료 (N=28) 에 Promega사 kit 에서 제공하지 않는 RBC lysis buffer (Promega)를 추가로 가하여 1차 PCR 실험시와 동일한 양인 buffy coat 50 面에서 DNA를 추출, PCR를 실시하였다. 그 결과, 이 중 16개의 시료에서 PCR산물을 얻을 수 있었으며 전체적으로 PCR 수득률은 72 %에서 88 %로 증가하였다.
대상 데이터
956). 이 연구에서는 보관 중인 buffy coat 시료 중 채취 지역과 채취 연도를 고려하여 이역의 1996년, 1998년, 20()1년 시료오+, H지역의 1995년과 1997년 시료, 즉 두 지역, 5개 년도의 시료를 각 20 개씩 난수표를 이용한 무작위 선정으로 총 100 개의 시료에 대하여 분석하였다. 본 실험을 위하여 무작위선정한 시료 기증자들의 성 별분포는 남자 32 %, 여자 68 %이었으며, 연령분포는 49세 이하 35 %; 50세~59세, 22 %; 60세~69세, 28%; 70세 이상 15 %로, 전체 코호트 대상자들의 성별 및 연령분포와 유의적 차이가 없었다.
이 코호트를 통하여 특정 암과 개인 생활습관, 환경적 요인 및 숙주 요인과의 관련성을 역학적으로 규명함은 물론, 암 발생에 관련된 여러 생체지표, 개인 숙주 감수성 및종양 표지자와의 관련성을 분자역학적으로 구명함으로써 향후 암의 원인에 관한 새로운 가설을 증명할 수 있도록 생체시료 은행을 연구 개시단계에서 구축하는것을 또 하나의 목적으로 하였다. 한국인을 대표하는 대규모 인구집단을 대상으로 코호트로 구축하고자 KMCC 코호트는 일반 지역사회에 거주하는 지역 주민중 현지에서 수행되는 암 선별검진사업(cancer screening)0]] 자발적으로 참여하는 30세 이상 성인 남-녀 모두를 대상에 포함하였다. 생체시료은행 구축을 위해서는 참여자의 동의를 받아 개개인으로부터 기증받은 혈액 및 소변을 장기간 보관하고 있다.
데이터처리
대상 시료 기증자들의 분포와 UV 흡광도 측정 결과는 빈도분석으로 제시하였고, 각 단계에서 DNA 추출 후의 PCR 결과는 PCR 증폭 여부를 [yes/no]로 이분변수 화하여 지역별과 지역내 연도별로 Fisher s exact test 또는 two sided 必-test로 비교하였으며, DNA 농도와 PCR 증폭 강도의 관계는 상관분석으로 분석하였다. 모든 자료의 분석에는 SPSS 프로그램 (ver 10.
성능/효과
260/280 흡광도 ratio의 분포는 0.5-2.5(median 1.55)로 normal distribution (Shapiro-Wilk W test, p=0.19)을 따르며 각 시료에서 분리된 DNA 농도와 PCR 수득률 사이에는 유의한 양의 상관관계가 있었다 (P< 0.01).
18 % 증가하였다 (Table 2). 2차 PCR 후, 각 지 역내에서 연도별 차이가 없었으나, PCR 수득률이 H지역 (98 %)이 C지역 (85 %)보다 유의하게 높았으므로 지역 간 차이의 원인을 조사한 결과, H지역은 전혈에서 buffy coat 분리 후 1개 tube로 본부에서만 보관한 반면, C 지역은 분리한 buffy coat를 균질화 하지 않고, 2 개의 tube로 분주 (aliquot)하여 본부와 C지역센터에 각각 보관하고 있는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, C지 역센터보관 시료의 DNA 농도는 본부의 것과 차이가 의심되었다.
결론적으로 현재 초저온냉동고(섭씨 -70P)에서 장기간 보관 중인 KMCC-buffy coat 시료의 보관상태는 양호하며, 현재의 보관방법을 유지함은 향후 PCR 을 주 내용으로 하는 유전자다형 진단 등 KMCC시료를 사용한 분자역학적 암-병인학 연구를 위하여 문제가 없는 것으로 판단된다.
않는 RBC lysis buffer (Promega)를 추가로 가하여 1차 PCR 실험시와 동일한 양인 buffy coat 50 面에서 DNA를 추출, PCR를 실시하였다. 그 결과, 이 중 16개의 시료에서 PCR산물을 얻을 수 있었으며 전체적으로 PCR 수득률은 72 %에서 88 %로 증가하였다. 즉, 완전한 적혈구 용해는 DNA 분리 수득률과, 나아가 PCR 수득률을 높이는 것으로 밝혀졌다.
다음으로 시료량에 따라 PCR 수득률이 달라지는지를 평가하기 위하여 1차 실험에서 PCR 산물을 얻지 못 한 28 개의 시료에 대하여 시료량을 2배로 증량,buffy coat 100 R로 2차 PCR을 시행한 결과, 28 개의 시료 중 18 개의 시료에서 PCR 산물을 얻어, buffy coat 50 伉를 사용한 1차 PCR 결과에 합하여 PCR 수득률은 전체적으로 72 %에서 90 %로 처음보다 18 % 증가하였다 (Table 2). 2차 PCR 후, 각 지 역내에서 연도별 차이가 없었으나, PCR 수득률이 H지역 (98 %)이 C지역 (85 %)보다 유의하게 높았으므로 지역 간 차이의 원인을 조사한 결과, H지역은 전혈에서 buffy coat 분리 후 1개 tube로 본부에서만 보관한 반면, C 지역은 분리한 buffy coat를 균질화 하지 않고, 2 개의 tube로 분주 (aliquot)하여 본부와 C지역센터에 각각 보관하고 있는 것으로 밝혀졌다.
매회 분리한 genomic DNA 1 R를 그대로 2 % agarose gel에 적용하여 DNA 손상 (degradation)-g- 조사한 결과, 전체적으로 평균 30 %에서 손상된 패턴을 보였지만 (Figure 2), 앞서 기술한 실제 PCR 결과, 거의 전 시료에서 PCR 산물을 얻을 수 있었으므로 손상된 DNA 시료라 하더라도 PCR에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 평가되었다.
현 시점에서 암코호트의 중요한 요소인 생체시료의 적절한 보관 및 생활성도 평가는 향후보관된 시료를 이용하게 될 연구의 질을 결정하는 중요한 사항이다. 이 연구에서는 이러한 목적에서 KMCC의 생체 시료 은행에서 무작위로 선정한 bufiy coat 시료 (N=100)를 이용하여 DNA 생활성도를 검사하였으며, 그 결과, 본부에만 있고 지역센터에 없던 3개 시료를 제외하고 본부 또는 지역센터에서 보관해온 전체 buffy coat에서 PCR 증폭이 가능했다.
그러므로, C지 역센터보관 시료의 DNA 농도는 본부의 것과 차이가 의심되었다. 이를 확인하기 위하여, 2차 PCR 후에도 본부 시료로는 PCR 산물을 얻을 수 없었던 총 9개 시료 중 달리 분주되어 C지역센터 보관중인 7개 시료를 이용하여 3차 PCR을 시행한 결과, 7개시료 모두에서 PCR 산물을 얻었다 (Table 3). 이로써 지 역 간의 PCR 수득률 차이는 전처 리차이, 즉, 분주 전 buffy coat fraction을 균질화했는 지 여부에 의한 것으로 사료된다.
그 결과, 이 중 16개의 시료에서 PCR산물을 얻을 수 있었으며 전체적으로 PCR 수득률은 72 %에서 88 %로 증가하였다. 즉, 완전한 적혈구 용해는 DNA 분리 수득률과, 나아가 PCR 수득률을 높이는 것으로 밝혀졌다.
목적으로 PCR 실시한 결과는 Figure 1과 같다. 총 100 개의 시료 중 72개의 시료로부터 PCR 산물을 얻었으며 (PCR 수득률, 72 %), 지역이나, 각 지역내 연도에 따른 PCR 수득률의 유의 한 차이는 없었다 (Table 1).
후속연구
분자역학적 암-병인학 연구가 가능하리라고 예상된다. 또한, bufiy coat로부터 genomic DNA를 분리할 때 적혈구 용해를 완전히 하는 것이 DNA 수득률을 높이는 것으로 관찰되었으므로 향후 상품화된 DNA 분리용 kit 사용 시에는 불완전한 적혈구 용해를 막기 위해 적혈구 용해용 buffer의 추가 사용이 권장된다.
본 연구 결과, DNA 손상정도, UV 260/280 nm ratio, 실제 PCR 증폭 등 일련의 과정에서 시료의 거의 전부에서 성공적 인 PCR 결과를 보였으므로 현재 보관 중인 KMCC 시료를 이용한 향후의 특정 유전자다형 진단을 포함하는 일련의 분자역학적 암-병인학 연구가 가능하리라고 예상된다. 또한, bufiy coat로부터 genomic DNA를 분리할 때 적혈구 용해를 완전히 하는 것이 DNA 수득률을 높이는 것으로 관찰되었으므로 향후 상품화된 DNA 분리용 kit 사용 시에는 불완전한 적혈구 용해를 막기 위해 적혈구 용해용 buffer의 추가 사용이 권장된다.
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