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문제 정의
- I/cBa의 분해 경로이다. 본 연구에서는 기관지 상피세포와 폐포대식세포에서 CsA 또는 FK506을 전처치 한 후에 외부 자극을 가했을 때, IKK 활성화가 억제되지 않았다 이는 CsA 또는 FK506이 외부 자극에 의한 IcBa의 분해를 억제하는 데는 IKK 활성화의 억제가 아닌 다른 경로가 존재함을 시사하는 소견이다. 실제로 몇몇 연구에서 calcineurin(Ca, 7calmodulin-dependent protein pho- sphatase)이 RB의 분해를 통해 NF-kB를 활성화 시킨다는 사실이 보고되었고。'22, calcineurin의 작용은 CsA와 FK506에 의해 억제된다고 알려져 있다 歸 따라서, CsA와 FK506에 의한 I/rBa의 분해 억제는 IKK와는 무관하게, calcineurin 억제에 의하여 이루어질 가능성을 생각할 수 있다.
- 그러나 CsA와 FK506이 기관지 상피세 포에서 UB/NF- kB 경로에 미치는 효과에 관해서는 알려져 있지 않고, 각종 염증 세포에서의 차이에 관해서도 보고가 미미한 실정이디-. 본 연구에서는 비염증세포인기관지상피세포외-, 폐의 염증에 중요한 역할을 하는 염증 세포(폐포대식세포, 단핵구, 림프구)에서 CsA와 FK50涵이 以Ba의 분해에 미치는 영향과 그 기전을 평가하였다.
제안 방법
- FK506 또는 CsA 전처치 후 TNF-a로 자극하고 anti-"Ba 항체를 이용한 Western blot 으로 I#Ba의 분해 여부를 관찰하였다. 염증세포로는 폐포대식세포, 말초혈액 단핵구 및 림프구를 이용하였고, 역시 FK506 또는 CsA 전처치 후 TNF-a, IL-18, LPS로 자극하고 anti-以Ba 항체를 이용한 Western blot으로 I/cBa의 분해 여부를 관찰하였다.
- CsA가 기관지 상피세포주에서 TNF-a 자극에 의한 I/cBa의 분해에 미치는 효과를 평가하기 위하여, A549와 BEAS-2B 세포를 25, 50, 100, 200, 500 //g/ml 농도의 CsA로 2시간동안 전처치한 후, TNF-a (5ng/ml)로 30분간 자극하고 I/cBa의 발현을 Western 분석으로 분석하였다. A549와 BEAS-2B 세포 모두에서 TNF-a 처치로 I&Ba 의 분해가 관찰되었다(Fig.
- FK506이 기관지 상피세포주에서 TNF-a 자극에 의한 I/cBa의 분해에 미치는 효과를 평가하기 위하여, BEAS-2B 세포에 20ng/ml의 FK506을 1시간에서 24시간까지 전처치한 후, TNF-ff(5ng/ml) 로 30분간 자극하고 I/cBa의 발현을 Western 분석으로 분석하였다. FK506 단독 처치는 I/cBa의발현에 아무런 영향을 미치지 않았다(Fig.
- 。] RB에 미치는 효과에 관해서는 알려져 있지 못한 실정이다 본 연구에서는 비염 증세 포인 기관지用피세포와 염증세포인 말초혈액 단핵구, 림프구, 폐至대식세포에서 각각 CsA와 FK506 이 I&B의 분해에 미치는 영향을 평가하였다
- Buffer。】% Nonidet P40, 5 mM EDTA, 50mM Tris, pH 7.5- 8.0, 250 mM NaCl, 50 mM NaF)로 추출한 후 bicinchoninic acid법으로 단백 농도를 측정하였다. 30 “g의 단백을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다.
- 1% trypan blue를 사용하여 세포수를 확인한 후 5-10x10%!!로 세포수를 맞추어 1ml PHS로 처리한 tissue culture dish에 5ml씩 넣어 37°C 배양기에 1시간동안 배양하였다. 비부착세포를 씻어내고 2-5ml의 HBSS(GibcoBRL, Grand island, NW를 넣어 4°C 냉장고에 20-30분간 넣어둔 후 cell scraper로 부착세포를 분리하여 1% glutamine, 2% HEPES buffer, 5% 자가혈청을 함유한 RPMI1640 배양액으로 세포수를 IxloZml로 맞추었다. 이렇게 분리된 단핵구를 round botton 96 well plate에 100(1 씩 넣어 37°C, 5% CQ 베양기에 밤새 배양하였다.
- FK506 또는 CsA 전처치 후 TNF-a로 자극하고 anti-"Ba 항체를 이용한 Western blot 으로 I#Ba의 분해 여부를 관찰하였다. 염증세포로는 폐포대식세포, 말초혈액 단핵구 및 림프구를 이용하였고, 역시 FK506 또는 CsA 전처치 후 TNF-a, IL-18, LPS로 자극하고 anti-以Ba 항체를 이용한 Western blot으로 I/cBa의 분해 여부를 관찰하였다. IKK의 활성도는 GST-I&Ba를기질로 이용한 in vitro immune complex kinase assay로 평가하였다.
- 염증세포에서 FK506이 외부자극에 의한 의 분해에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 폐포대식세포, 말초혈액 단핵구, 말초혈액 림프구에서 FK506 전처치가 외부자극에 의한 I/cBa의 분해에 미치는 효과를 평가하였다. 폐포대식세포에서 1 시간의 LPS(1 "g/ml) 자극으로 I/cBa가 분해되었는데, RBa의 분해는 20ng/ml의 FK506의 2시간 전처치로 억제되었다(Fig.
- 키나아제 반응물은 SDS/PAGE 10% gel 에서 nitrocellulose membrane으로 tran- sfer시틴 후 autoradiography로 관찰한다. 이 mem brane^ 후에 anti-IKK a 항체를 이용한 immuno - blot으로 동량의 키나아제를 확인하는데 이용하였다.
- 헤파린을 첨가한 주사기에 말초혈액을 채취한 후 말초혈액 단핵구를 Ficoll-Hypaque(Sigma Diag nostics, St.Louis, U.S.A.)을 사용한 density sedi mentation method 를 이용하여 분리한 후 RPMI1640(GibcoBRL, Grand island, NN)으로 두 번 세척하고, 5% PHS (pooled human serum) 과 5% FCS(fetal calf serum) 으로 재부유하였다. 0.
- 회수된 용액을 세 장의 무균 거즈를 통과 시켜 점액을 걸러내고 RPMI1640 배양액으로 3회 세척한 후 총 세포수를 측정하고, Wright 염색법으로 구성세포를 확인하여 1% glutamine, 2% HEPES buffer, 5% 자가혈청을 함유한 RPMI1640 배양액으로 폐포 대식세포가 이 되도록 세포 수를 맞추었다. 이렇게 분리된 폐포 대식세포를 round botton 96 well plate에 100 “1 (세포수 1 X105) 씩 넣어 37°C, 5% CO2 배양기에 밤새 배양하였다.
대상 데이터
- BEAS-2B 는 KGM배지 (Clonetics, Walkersville, MD)에서, 그리고 A549는 10% FBS, 60 "g/ml penicillin, 100 “g/ml streptomycin이 포함된 RPMI 1640를 이용하여 37°C하에 5%CO2 배양기에서 배양하였다.
- Rabbit의 polyclonal anti-human I/cBa항체, anti-IKK» 항체, 재조합(GST)-I/cBa는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 에서 구입하였다.
- Recombinant human TNF- a, IL-1/3, LPS는 R& D System(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고 phosphate buffered saline(PBS)에 녹인 후 여러 개로 나누어 사용할 때까지 -70 °C에 보관하였다. Rabbit의 polyclonal anti-human I/cBa항체, anti-IKK» 항체, 재조합(GST)-I/cBa는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 에서 구입하였다.
- 비염증세포로는 BEAS-2B 와 A549 세포주를 이용하였다. FK506 또는 CsA 전처치 후 TNF-a로 자극하고 anti-"Ba 항체를 이용한 Western blot 으로 I#Ba의 분해 여부를 관찰하였다.
- 정상 사람의 기관지 상피세포인 BEAS-2B 세포주와, 제2형 폐포세포주인 A549를 사용하였다. BEAS-2B 는 KGM배지 (Clonetics, Walkersville, MD)에서, 그리고 A549는 10% FBS, 60 "g/ml penicillin, 100 “g/ml streptomycin이 포함된 RPMI 1640를 이용하여 37°C하에 5%CO2 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
- 염증세포로는 폐포대식세포, 말초혈액 단핵구 및 림프구를 이용하였고, 역시 FK506 또는 CsA 전처치 후 TNF-a, IL-18, LPS로 자극하고 anti-以Ba 항체를 이용한 Western blot으로 I/cBa의 분해 여부를 관찰하였다. IKK의 활성도는 GST-I&Ba를기질로 이용한 in vitro immune complex kinase assay로 평가하였다.
- 배양된 세포들을 lysis buffer에 작용시킨 후 원심분리하고 supernatant만을 새 tube에 옮기고 단백질 정량을 시행하고 이후 실험에 사용할 때까지 -70°C 냉장고에서 보관한다. 단백질 정량은 Bio-Rad Assay 방법으로 시행하였는데 Bovine Serum Albumin 표준용액을 사용하여 시행하였다.
- 총단백질을 추출하는 방법은 주로 Dejardin 등이 사용한 방법을 이용하였다20 먼저 .'Western" Ly sis Buffer를 0.
성능/효과
- CsA 단독 처치는 I zcBa의 발현에 영향을 미치지 않았다(data not 아iown). A549 와 BEAS-2B 세포에서 각각 50 “ g/ml과 25 “g/ml의 CsA 전처치로 TNF- a 에의한 I/cBa의 분해가 억제되기 시작하였고, 농도가 증가함에 따라 농도 의존성으로 분해의 억제가 증가되었다(Fig. 1). 이 결과는 CsA가 기관지 상피세포에서 외부 자극에 의한 I/cBa의 분해를 효과적으로 억제함을 시사하는 소견이다.
- 영향을 미치지 않았다. 기관지 상피세포에서 TNF-a 자극에 의한 RBa의 분해는 CsA의 전처치로 억제되었으나, FK506의 전처치로는 억제되지 않았다. 단핵구, 림프구 및 폐포대식세포에서 외부자극에 의한 以Ba의 분해는 CsA 또는 FK506의 전처치로 억제되었으나 IKK활성은 억제되지 않았다.
- 기존의 알려져 있는 CsA와 FK506의 세포 내 작용 기전이 상당히 유사함에도 불구하고, 기관지 상피세포에서 CsA와 FK506이 외부 자극에 의한 WBa의 분해에 미치는 효과는 차이를 보였다. 즉, CsA 전처치로 외부자극에 의한 %Ba의 분해가 억제되었지만, FK506 전처치로는 외부자극에 의한 의 분해가 억제되지 않았다 기관지 상피세포에서와는 달리, 폐포 대식세포, 림프구, 단핵구 등의 염증 세포에서는 외부자극에 의한 I&B。 의 분해가 FK506에 의해 억제되었다 이는 이전의 연구 결과와 일치하는 소견으로서⑶1 FK506의 면역 저하 효과의 일부는 염증 세포에서 UB/NF-/C B 경로의 활성화 차단을 통하여 이루어질 가능성을 시사하는 소견이다.
- 기관지 상피세포에서 TNF-a 자극에 의한 RBa의 분해는 CsA의 전처치로 억제되었으나, FK506의 전처치로는 억제되지 않았다. 단핵구, 림프구 및 폐포대식세포에서 외부자극에 의한 以Ba의 분해는 CsA 또는 FK506의 전처치로 억제되었으나 IKK활성은 억제되지 않았다.
- 본 연구에서 CsA와 FK506 자체는 기관지 상피세포에서 I/rBa의 발현에 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 FK506이 쥐의 섬유아세포와 사구체 간질세포에서 오히려 NF-&B를 활성화 시키고, 이를 통한 IL-6의 증가가 FK506의 신독성과 관련이 있을 가능성을 제시한 Muraoka 등의 연구是 결과와 상반된 결과이다.
- 것은 중요한 일이다. 본 연구에서 저자들은 기관지 상피세포에서 CsA와 FK506이 외부자극에 의한 I/rBa의 분해에 미치는 영향이 다르고, 단핵구, 림프구 및 폐포대식세포에서 이 약제들에 의한 IK*활성 억제와는 무관하게 이루어짐을 확인하였다. 이러한 억제가 CsA와 FK506의 면역억제작용의 일부를 이룬다고 생각되며, 폐의 염증과 관련된 여러 세포에서의 CsA, FK50涵의 I/cBa 분해에 미치는 영향을 규명하였다는데 이 연구의 의의가 있다
후속연구
- 그러나 쥐의 섬유아세포나 사구체간질 세포와는 달리 기관지 상피세포에서 FK506 자체가 I/cBa 의 분해를 유도하지 않는 기전®% CsA와 FK506 이 기관지 상피세포에서 I/cBa의 분해에 미치는 효과의 차이, 단핵구, 림프구 및 폐포대식세포에서 CsA와 FK506에 의한 RBa의 분해 억제의 기전 등에 대하여는 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다. 향후 이 부분에 대한 추가적인 연구는 CsA 와 FK506의 효과나 부작용의 차이 등에 대한 이해뿐 아니라, 염증유발성 사이토카인의 발현 및 염증의 발생에 대한 세포내 기전을 이해하는데 많은 도움을 줄 것으로 기대한다.
- 향후 이 부분에 대한 추가적인 연구는 CsA 와 FK506의 효과나 부작용의 차이 등에 대한 이해뿐 아니라, 염증유발성 사이토카인의 발현 및 염증의 발생에 대한 세포내 기전을 이해하는데 많은 도움을 줄 것으로 기대한다.
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