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문제 정의
- 대두되고 있다. 본 연구에서는 82종의 약용식물을 대상으로 하여 SOD 및 phenol 화합물의 함량을 검정하여 스트레스에 대한 내성 평가함으로써 약용식물에서의 항산화 기구를 이해하고 스트레스와 관련된 인자를 탐색하며 나아가 형질전환에 의한 환경내성 약용식물 신품종육성 및 이러한 약용식물을 이용하여 인간 건강에 이로운 유용물질을 대량생산하기 위한 기초 자료로 사용하고자 한다.
제안 방법
- SOD 효소활성 검정은 SOD의 효소활성이 NBT의 환원을 저해하는 능력을 검정하는 photochemical NBT (Nitroblue tetrazolium) method# 사용하였다 (Beyer & Fridovich, 1987). 추출한 조효소 60 ㎕와 3.0 ㎖ assay-buffer (pH7.8, 50 mM phosphate, 9.9 mM l- methionine, 57 "M NBT, 0.025% Triton X-100, 0.0044% riboflavin)를 혼합하여 식물 생장상 (25℃, 20W, 7 min., 45 "mol/nf s1 fluorescent, Sylvania Groiux) 에서 균일하게 조사시켰다. SOD의 활성은 NBT 환원법에 의하여 흡광도 560 ran에서 측정하였고, 항산화 활성 정도는 NBT의 환원 저해율로 표시하였으며 각 시료에 대하여 3회 반복하였다 [항산화활성, NBT의 환원 저해율 (%) = (1 - A / B) X 100, A: 시료의 흡광도, B: 대조구의 흡광도].
- HPLC 기기는 LC-10A liquid chromato- graphy (Shimadzu Kyoto, Japan) 를 사용하였으며 분석조건은 다음과 같다 (Table 1). Phenol 화합물의 정성 및 정량 분석은 16종의 phenolics 표준물질의 peak area와 retention time을 비교하였고 표준물질을 각각 0 ppm, 1 ppm, 50 ppm, 100 ppm의 일정 한 비율로 희석하여 각각의 회귀곡선 식을 구한 다음, 각 sample의 HPLC 분석에서 얻어진 면적을 Y에 대입하여 X 값을 구한 다음, µg/g의 양으로 환산하였다 (Table 2.).
- , 45 "mol/nf s1 fluorescent, Sylvania Groiux) 에서 균일하게 조사시켰다. SOD의 활성은 NBT 환원법에 의하여 흡광도 560 ran에서 측정하였고, 항산화 활성 정도는 NBT의 환원 저해율로 표시하였으며 각 시료에 대하여 3회 반복하였다 [항산화활성, NBT의 환원 저해율 (%) = (1 - A / B) X 100, A: 시료의 흡광도, B: 대조구의 흡광도]. Protein 정량은 Peterson (1979)의 방법에 의거 하여 bovine serum albumin (BSA) 을 사용하여 정량하였다.
- 분석하였다. 시료 200 ㎕에 1 ㎖의 Folin-Denis reagent 와 0.8 ㎖의 sodium cabonate (7.5%)를 첨가한 후 45분 동안 암 상태에서 incubation 시킨 후에 spectrophotometer (760 nm, HITACHI Instrument, Inc) 를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 gallic acid (Sigma Chemical Company, 2002)을 이용하여 검량곡선을 작성하였다.
- 약용식물 82종에 대한 16종의 phenol 화합물 함량을 HPLC로 정 량 분석하였다 (Table 4). Gentisic acid는 감초 {Glycyrrhiza uralensis Fisch), 복분자 (Rubus chingii Hu) 에서 각각 3183.
- ). 원심분리하여 얻은 상등액을 탈염 완충용액 (50 mM phosphate, pH 7.0, 0.2 mM EDTA)으로 평형 시키고, Sephadex G-25 column을 이용하여 탈염 시킨 다음 효소활성검정 용액으로 사용하였다. SOD 효소활성 검정은 SOD의 효소활성이 NBT의 환원을 저해하는 능력을 검정하는 photochemical NBT (Nitroblue tetrazolium) method# 사용하였다 (Beyer & Fridovich, 1987).
대상 데이터
- 45 //m) 로 여과한 다음, 이 여과액을 HPLC 분석시료로 사용하였다. HPLC 기기는 LC-10A liquid chromato- graphy (Shimadzu Kyoto, Japan) 를 사용하였으며 분석조건은 다음과 같다 (Table 1). Phenol 화합물의 정성 및 정량 분석은 16종의 phenolics 표준물질의 peak area와 retention time을 비교하였고 표준물질을 각각 0 ppm, 1 ppm, 50 ppm, 100 ppm의 일정 한 비율로 희석하여 각각의 회귀곡선 식을 구한 다음, 각 sample의 HPLC 분석에서 얻어진 면적을 Y에 대입하여 X 값을 구한 다음, µg/g의 양으로 환산하였다 (Table 2.
- 재료의 수집은 2003년에 수원 작물과학원 약용식물원, 진안 약초시험장 등에서 직접 채취하였다. 각종 약용식물 중에 약용으로 사용되어지는 부위 (RT, 뿌리 LF, 잎; TB, 구근; ST, 줄기 ; FR, 과실; SD, 종자; FW, 꽃 BB, 인경)를 대상으로 하였으며 실험에 사용되어진 각 부위를 신선한 상태에서 수집하여 완벽히 밀봉된 polyethylene plastic bags (168×150 mm, Glad-Lock zipper sandwich bags, First Brands Corp., Danbury, CT) 에 넣은 후 -80℃ (ULTRA LOW, SANYO) 에서 사용하기 전까지 보관하였으며 수집되어진 시료를 -80℃에서 급속 동결건조 (Biotron, Cleanvac 8B) 시킨 후에 분쇄하였다 (40-mesh).
- 본 실험에서 사용된 약용식물은 오가피 (Acanthopanax gracilistylus W.W. Smith) 를 포함한 총 82종을 대상으로 하였다. 재료의 수집은 2003년에 수원 작물과학원 약용식물원, 진안 약초시험장 등에서 직접 채취하였다.
- Smith) 를 포함한 총 82종을 대상으로 하였다. 재료의 수집은 2003년에 수원 작물과학원 약용식물원, 진안 약초시험장 등에서 직접 채취하였다. 각종 약용식물 중에 약용으로 사용되어지는 부위 (RT, 뿌리 LF, 잎; TB, 구근; ST, 줄기 ; FR, 과실; SD, 종자; FW, 꽃 BB, 인경)를 대상으로 하였으며 실험에 사용되어진 각 부위를 신선한 상태에서 수집하여 완벽히 밀봉된 polyethylene plastic bags (168×150 mm, Glad-Lock zipper sandwich bags, First Brands Corp.
이론/모형
- 82종의 약용식물 건조 시료의 phenol 화합물의 함량 분석에서 사용되어진 추출물에 대한 total phenol 함량을 Folin-Denis method (Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists) 를 사용하여 분석하였다. 시료 200 ㎕에 1 ㎖의 Folin-Denis reagent 와 0.
- SOD의 활성은 NBT 환원법에 의하여 흡광도 560 ran에서 측정하였고, 항산화 활성 정도는 NBT의 환원 저해율로 표시하였으며 각 시료에 대하여 3회 반복하였다 [항산화활성, NBT의 환원 저해율 (%) = (1 - A / B) X 100, A: 시료의 흡광도, B: 대조구의 흡광도]. Protein 정량은 Peterson (1979)의 방법에 의거 하여 bovine serum albumin (BSA) 을 사용하여 정량하였다.
- 2 mM EDTA)으로 평형 시키고, Sephadex G-25 column을 이용하여 탈염 시킨 다음 효소활성검정 용액으로 사용하였다. SOD 효소활성 검정은 SOD의 효소활성이 NBT의 환원을 저해하는 능력을 검정하는 photochemical NBT (Nitroblue tetrazolium) method# 사용하였다 (Beyer & Fridovich, 1987). 추출한 조효소 60 ㎕와 3.
- 약용식물 82종에 대하여 Folin-Denis 법으로 Total phenol의 함량을 측정하였다. Total phenol 함량의 결과는 Table 5와 같다.
- 5%)를 첨가한 후 45분 동안 암 상태에서 incubation 시킨 후에 spectrophotometer (760 nm, HITACHI Instrument, Inc) 를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 gallic acid (Sigma Chemical Company, 2002)을 이용하여 검량곡선을 작성하였다.
성능/효과
- ), 감초 (Glycyrrhiza uralensis Fisch), 연자육 (Nelumbo nucifera Gaertn), 지 황 [Rehmannia glutinosa (Gaertner) Liboshitz], 현삼 {Scrophylaria buergeriana Miq.), 인진 (Artemisia capiHaris Thb.)은 각각 48.30%, 47.87%, 46.53%, 41.53%, 35.63%, 28.70%, 28.43%, 25.97%, 25.40%로 다른 약용작물보다 비교적 높은 SOD 효소 활성 능력을 나타냈다 (Table 3). SOD 활성 이 가장 높은 백편두의 경우 16종의 phenol 화합물에 대해서 gentisic acid (133.
- 32 µg/g의 높은 함량을 보였다. Caffeic acid는 약용식물 82종에 대부분적은 함량을 나타내었으며, 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi) f 지유 (Sanguisorba officinalis L) 에서 각각 97.76 µg/g과 61.14 µg/g의 높은 함량을 보였다. Syringic acid는 속단 (Phiomis umbrosa Turgi) 과 복분자 (R.
- 9 µg/g으로 높은 함량을 나타냈다. Catechin의 함량 분석과정 에서 시료의 건조과정 중 열풍건조와 동결건조 사이에 함량을 비교하여 본 결과 목단피의 경우 열풍건조 (81.3 µg/g) 시보다 동결 건조 시 (259.0 M 3배 이상 높은 함량을 나타내었는데 (자료 미제시) 이러한 것은 열풍건조 시 60℃ 이상의 고온을 통하여 건조하는 과정에서 열에 민감한 catechin과 같은 성분이 산화적인 축합이 일어나거나 변형된 결과라고 생각되어진다. 또한 이러한 결과는 시료의 건조과정 중에 동결건조는 식물체내에 얼음 결정을 형성^하게 하고 이러한 얼음 결정이 식물체의 세포 구조를 더 잘 붕괴시켜 추출용매의 접근을 용이하게 하여 추출효율이 더 높은 수준이 된다는 보고 (Keinanen & Julkunen- Tiitto, 1996) 와도 유사하게 관찰되었다.
- 4 µg/g으로 가장 많은 함량을 보였다. Catechin의 함량은 무 (Raphanus sativus L.), 목단피 (Paeonia suffruticosa Andr.), 오매 (Primus mume) 에서 각각 658.8 jtzg/g, 259.0 µg/g, 216.9 µg/g으로 높은 함량을 나타냈다. Catechin의 함량 분석과정 에서 시료의 건조과정 중 열풍건조와 동결건조 사이에 함량을 비교하여 본 결과 목단피의 경우 열풍건조 (81.
- NBT 환원법 에 의 해 Superoxide anion radical (•O2) 소거에 관련된 SOD 효소 활성을 검정한 결과, 82종의 약용식물 중 77종이 30% 이하의 NBT 환원 저해율을 나타내었으며 약 6.1% (5종/82종)의 약용식물 종에서 30% 이상의 NBT 환원 저해율을 나타내었다. 특히 원지 (Polygala tenuifolia Willd.
- 58 µg/g의 범위를 보였다. Narigin은 목단피 (F. suffruticosa Andr.) 와 속단 (P. umbrosa Turgi) 에서 각각 765.1 µg/g과 289.2 µg/g의 높은 함량을 보였고, 천문동 (.Asparagus cochinchinensis Merr) 과 향부자 (Cyperus rotundas L.) 에서 낮은 함량을 나타냈다. Salicylic acid는 만삼 (Codonopsis lanceolata)과 목단피 (P suffruticosa Andr.
- 40%로 다른 약용작물보다 비교적 높은 SOD 효소 활성 능력을 나타냈다 (Table 3). SOD 활성 이 가장 높은 백편두의 경우 16종의 phenol 화합물에 대해서 gentisic acid (133.9 µg/g)와 catechin (13.7 µg/g)이 소량 검출되었고 total phen이의 경우도 4324 µg/g으로서 매우 적은 함량을 나타내었다. SOD 활성이 비교적 높게 나타난 다른 약용식물 종 백개자, 연자육, 지황 등에서도 total phenol 및 phenol 화합물의 함량이 그 농도의 차이는 있지만 소량으로 함유되어진 것으로 나타났다.
- 7 µg/g)이 소량 검출되었고 total phen이의 경우도 4324 µg/g으로서 매우 적은 함량을 나타내었다. SOD 활성이 비교적 높게 나타난 다른 약용식물 종 백개자, 연자육, 지황 등에서도 total phenol 및 phenol 화합물의 함량이 그 농도의 차이는 있지만 소량으로 함유되어진 것으로 나타났다. 반면 대황의 경우 SOD 활성 뿐만 아니 라 total phenol 및 phenolic acid의 함량이 모두 높게 나타났다.
- ) 에서 낮은 함량을 나타냈다. Salicylic acid는 만삼 (Codonopsis lanceolata)과 목단피 (P suffruticosa Andr.) 에서 현저히 높은 함량을 나타냈다. Hyricetin은 금은화 (L.
- 4 µg/g의 높은 함량을 보였다. The Cinnamic acid는 대체적으로 매우 적은 함량을 보였으며, 원지 (Polygala tenuifolia Willd.) 와 결명자 (Cassia tora L) 에서 각각 37.97 µg/g과 37.31 µg/g의 높은 함량을 나타냈다. Naringenin에서는 현삼 (Scrophylaria buergeriana Miq.
- ), 인진 (A capillaris Thb, )등에서 다른 약용작물보다 비교적 높은 SOD 효소 활성 능력을 나타냈다. Total phenol 함량은 3-249, 731 µg/g의 범위를 보였으며 지유 (S. officinalis L.), 대황 (R. palmatum L.), 복분자 (R.chingii Hu) 에서 각각 249, 731 µg/g, 209, 546 µg/g, 170, 333 µg/g으로 가장 높은 함량을 나타냈다. 16종의 phenol 화합물의 경우에서는 82종의 약용식물이 각기 매우 상이한 농도의 분포를 나타내었다.
- Total phenol 함량의 결과는 Table 5와 같다. Total phenol 함량은 3-249731 µg/g의 범위를 보였으며 지유 (S. officinalis L.), 대황 (R palmatum L.), 복분자 (R.chingii Hu)에서 각각 249, 731 µg/g, 209, 546 µg/g, 170, 333 µg/g으로 가장 높은 함량을 나타냈다. 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사 산물의 하나인 페놀 화합물은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화 환원 반응 시 기질로 작용하며, 미생물의 공격을 막아 식물자체를 보호하는 기능을 수행한다는 점을 고려하여 볼 때 지유, 복분자, 대황 등에 대한 phenol 화합물과 병 저항성 및 작물 특성에 대한 연구가 진행되어져야 할 것이다.
- ρ-Hydroxy benzoic acid는 82종의 약용식물 중에서 작약 (Paeonia lactiflora Pall) 을 포함한 14종에서 만 검출되었고, 작약 (P. lactiflora Pall), 대황 (R. palmatum L.), 치자 (Gardenia jasmonoides Ellis), 복분자 (R chingii Hu)에서 각각 38.10 µg/g, 18.81 µg/g, 15.64 µg/g, 15.38 µg/g으로 높은 함량을 나타냈다. Chlorogenic acid는 금은화 (Lonicer japonica Thunb.
- 8 µg/g이었다. 이러한 결과를 종합하여 보면, phenol 화합물의 정량에서는 만삼 (C. lanceolata)과 목단피 (P. suffruticosa Audr.) 에서 가장 높은 함량인 12, 176 µg/g과 3, 572 µg/g을 나타냈으며, 산약 (Dioscotea opposita Thunb.)과 의이인 [Coix lachrymajobi var. mayuen (Roman.) Stapf], 과루인 (Trichosanthes kirilowii Maxim.)에서는 가장 낮은 함량을 나타내었다.
- 한국에 분포하고 있는 82종의 약용식물에 대하여 환경 내성 및 기능성 소재의 개발을 위한 탐색을 위하여 항산화 효소와 관련된 첫 번째 방어기작인 SOD 효소활성과 phenol 화합물의 함량정도를 검 정하여 본 결과 SOD 효소 활성은 원지 (P tenuifolia Willd.), 백편두 (D lablab L.), 백개자 (S. alba L.), 대황 (R. palmatum L.), 감초 (G. uralensis Fisch), 연자육 (N. nucifera Gaertn), 지황 [R. glutinosa (Gaertner) Liboshitz], 현삼 (S. buergeriana Miq.), 인진 (A capillaris Thb, )등에서 다른 약용작물보다 비교적 높은 SOD 효소 활성 능력을 나타냈다. Total phenol 함량은 3-249, 731 µg/g의 범위를 보였으며 지유 (S.
후속연구
- 항산화 효소 및 phenol 화합물이 많이 함유하여 우수한 기능성을 가지고 있는 것을 확인된 약용식물에 대해 그들의 이용성을 증대시킬 수 있는 구체적인 연구가 수행되어져야 할 것으로 사료된다. 또한 phenol성 물질을 많이 함유하는 약용식물 추출물을 이용한 기능성 식품, 화장품, 천연 보존재 및 의약품 등으로 개발 (Cook & Samman, 1996) 할 수 있을 것으로 판단되 어진다.
- 있다. 또한, 제초제와 살충제의 잦은 사용은 이러한 phenol 화합물의 함량을 낮춘다는 사실 (Macheix et al., 1990)을 고려하여 볼 때 phenolic flavonoid들의 함량이 높은 약용작물의 유기 재배는 더 많은 phenol 화합물을 생성할 수 있을 것으로 사료된다.
- chingii Hu)에서 각각 249, 731 µg/g, 209, 546 µg/g, 170, 333 µg/g으로 가장 높은 함량을 나타냈다. 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사 산물의 하나인 페놀 화합물은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화 환원 반응 시 기질로 작용하며, 미생물의 공격을 막아 식물자체를 보호하는 기능을 수행한다는 점을 고려하여 볼 때 지유, 복분자, 대황 등에 대한 phenol 화합물과 병 저항성 및 작물 특성에 대한 연구가 진행되어져야 할 것이다.
- 반면 대황의 경우 SOD 활성 뿐만 아니 라 total phenol 및 phenolic acid의 함량이 모두 높게 나타났다. 일반적으로 대황은 건위 (健胃), 지사 (止瀉), 사하 (瀉下), 행어혈 (行瘀血), 사열독 (瀉熱毒), 특히 강력한 사하 및 항균 작용 및 구취 억제능 등이 있는 것으로 알려져 있으나 본 실험의 결과 높은 항산화 효소 활성 및 phenol compound 화합물을 다수 포함하고 있어 대황의 약효에 대해서는 항산화 활성과 관련하여 새로운 접근이 모색되어야 할 것이다.
- 앞으로의 연구에서는. 항산화 효소 및 phenol 화합물이 많이 함유하여 우수한 기능성을 가지고 있는 것을 확인된 약용식물에 대해 그들의 이용성을 증대시킬 수 있는 구체적인 연구가 수행되어져야 할 것으로 사료된다. 또한 phenol성 물질을 많이 함유하는 약용식물 추출물을 이용한 기능성 식품, 화장품, 천연 보존재 및 의약품 등으로 개발 (Cook & Samman, 1996) 할 수 있을 것으로 판단되 어진다.
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