Bacillus속이 생산하는 Cyclodextrin Glucanotransferase에 의한 Stevioside로의 당전이반응 Transglucosylation to Stevioside by Cyclodextrin Glucanotransferase from Bacillus sp.원문보기
Cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)를 생성하는 Bacillus sp. 균주를 토양으로부터 분리하였으며, CGTase 생성을 위하여 0.1% albumin, 2% $NH_4Cl$, 2% soluble starch, 0.2% $NH_2PO_4$를 효소생산배지에 첨가하여 $37^{\circ}C$에서 72시간 배양 시 최대의 활성을 나타내었다. Sephadex G-100과 G-150을 사용한 gel filtration과 DEAE-cellulose를 이용한 이온 교환 크로마토그래피로 9.72배 정제하였으며, specific activity는 528.02 unit/mg이었다. CGTase의 효소학적 특성은 최적 pH, 최적 온도는 pH 8.0과 $80^{\circ}C$였으며, pH $8.0{\sim}11.0$과 $60{\sim}80^{\circ}C$에서 안정하였다. 금속이온 중 $Pb^{2+},\;Hg^{2+}$와 $Zn^{2+}$에서 효소활성이 억제되었다. CGTase의 첨가 효소량을 $20.5{\sim}410$ unit 까지 변화시키며 stevioside로의 당전이능을 조사한 결과 20.5 unit 및 41 unit 처리 시 당전이율은 74.9%와 75,7%로 높게 나타났으며, 205 unit 처리시에는 당전이율은 68.7%로 비슷하였으나 갈변화가 진행되었다. 효소의 농도를 높여 410 unit를 처리했을 때 당전이율은 57.9%로 더욱 떨어졌으며 역시 갈변화가 진행되어 제품의 물성을 나쁘게 하였고, 당전이 산물 중 pentaglycoside와 hexaglycoside가 검출되지 않아 필요이상의 효소사용량은 오히려 당전이 반응에 역효과가 나타났다.
Cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)를 생성하는 Bacillus sp. 균주를 토양으로부터 분리하였으며, CGTase 생성을 위하여 0.1% albumin, 2% $NH_4Cl$, 2% soluble starch, 0.2% $NH_2PO_4$를 효소생산배지에 첨가하여 $37^{\circ}C$에서 72시간 배양 시 최대의 활성을 나타내었다. Sephadex G-100과 G-150을 사용한 gel filtration과 DEAE-cellulose를 이용한 이온 교환 크로마토그래피로 9.72배 정제하였으며, specific activity는 528.02 unit/mg이었다. CGTase의 효소학적 특성은 최적 pH, 최적 온도는 pH 8.0과 $80^{\circ}C$였으며, pH $8.0{\sim}11.0$과 $60{\sim}80^{\circ}C$에서 안정하였다. 금속이온 중 $Pb^{2+},\;Hg^{2+}$와 $Zn^{2+}$에서 효소활성이 억제되었다. CGTase의 첨가 효소량을 $20.5{\sim}410$ unit 까지 변화시키며 stevioside로의 당전이능을 조사한 결과 20.5 unit 및 41 unit 처리 시 당전이율은 74.9%와 75,7%로 높게 나타났으며, 205 unit 처리시에는 당전이율은 68.7%로 비슷하였으나 갈변화가 진행되었다. 효소의 농도를 높여 410 unit를 처리했을 때 당전이율은 57.9%로 더욱 떨어졌으며 역시 갈변화가 진행되어 제품의 물성을 나쁘게 하였고, 당전이 산물 중 pentaglycoside와 hexaglycoside가 검출되지 않아 필요이상의 효소사용량은 오히려 당전이 반응에 역효과가 나타났다.
Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) of Bacillus sp. isolated from soil was purified and its enzymological characteristics were investigated. It was found that the production of CGTase reached to the maximum when the strain was cultured in the broth containing 0.1 % albumin, 2% $NH_4Cl$
Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) of Bacillus sp. isolated from soil was purified and its enzymological characteristics were investigated. It was found that the production of CGTase reached to the maximum when the strain was cultured in the broth containing 0.1 % albumin, 2% $NH_4Cl$, 2% soluble starch and 0.2% $NH_2PO_4$ for 72 hrs at $37^{\circ}C$. The purity of CGTase was increased by 9.7 folds through purification procedures by the following column chromatography DEAE-cellulose ion exchange chromatography and Sephadex G-100, G-150 gel filtration and its specific activity was 528.0 unit/mg. The optimum pH and temperature for the CGTase activity were 8.0 and $80^{\circ}C$, respectively. The enzyme was stable in pH $8.0{\sim}11.0$ at $60{\sim}80^{\circ}C$. The activity of purified enzyme was inhibited by $Pb^{2+},\;Hg^{2+}$ and $Zn^{2+}$. When CGTase was treated with each 20.5 unit, 41 unit, 205 unit and 410 unit to investigate the transglucosylation to stevioside by purified cyclodextrin glucanotransferase, transglucosylation rate to stevioside was 74.9%, 75.7%, 68.7% and 57.9%. Brown effect was observed above the concentration amounting to 205 unit of our CGTase.
Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) of Bacillus sp. isolated from soil was purified and its enzymological characteristics were investigated. It was found that the production of CGTase reached to the maximum when the strain was cultured in the broth containing 0.1 % albumin, 2% $NH_4Cl$, 2% soluble starch and 0.2% $NH_2PO_4$ for 72 hrs at $37^{\circ}C$. The purity of CGTase was increased by 9.7 folds through purification procedures by the following column chromatography DEAE-cellulose ion exchange chromatography and Sephadex G-100, G-150 gel filtration and its specific activity was 528.0 unit/mg. The optimum pH and temperature for the CGTase activity were 8.0 and $80^{\circ}C$, respectively. The enzyme was stable in pH $8.0{\sim}11.0$ at $60{\sim}80^{\circ}C$. The activity of purified enzyme was inhibited by $Pb^{2+},\;Hg^{2+}$ and $Zn^{2+}$. When CGTase was treated with each 20.5 unit, 41 unit, 205 unit and 410 unit to investigate the transglucosylation to stevioside by purified cyclodextrin glucanotransferase, transglucosylation rate to stevioside was 74.9%, 75.7%, 68.7% and 57.9%. Brown effect was observed above the concentration amounting to 205 unit of our CGTase.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 당전이 기능을 가지는 CGTase 개발의 일환으로 토양에서 CGTase를 생산하는 균주를 분리하여 효소생산 최적조건을 규명하고 생산된 CGTase의 당전이 반응을 살펴보았다.
효소생산을 위한 최적배양조건의 검토. 효소생산을 위한 최적 조건은 유기질소원, 무기질소원, 무기염, 탄소원을 효소생산 배지에 첨가하여 37℃에서 배양시간별로 효소활성을 측정하여 최적 조건을 조사하였다.
가설 설정
Punneation of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus sp.D: Temperature stability.
제안 방법
CGTase 생성 균주의 선발 및 동정. CGTase 생성균주 선발 배지에서 투명화이 형성되는 균주를 1차 선발하였고, 이들을 효소생산 배지에 배양하여 조효소애을 제조한 후 CGTase활성을 측정하여, 활성이 가장 높은 균주를 최종 균주로 선발하였다. 선발된 균의 생리 생화학적특성은 Table 2에서 보는 바와 같이 형태적 특성은 간균이고, 편모는 관찰되지 않았다.
열 안정성. CGThse의 열안정성을 조사하기 위하여 효소액 1ml를 30~90℃의 범위에서 60분간 방치한 후 최적 반응온도로 조절하고 잔존활성을 검사하였다.
pH의 영향. pH가 효소의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 효소용액 (106unit/200|ig protein) 을 0.2 M HC1-potassium chloride buffer(pH 2.0), 0.1 M citrate buflfer(pH 3.0~5.0), 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.0~8.0), 0.2 M boric acid-borax buffer (pH 9.0), 0.2 M borax-NaOH buffer (pH 10.0~12.0)까지 pH를 변화시키면서 효소활성을 측정하였다.
금속이온의 영향. 금속이온이 효소활성에 미치는 영향을 검사하기 위하여 각종 금속염을 2mM이 되게 용해시키고 금속이온 용액 0.1 ml와 효소액 0.1 ml를 혼합하고, 30^(2에서 60분간 안정화시킨 후 기질 1 ml를 혼합하고 301에서 60분간 방치한 다음 8UC에서 30분 동안 반응시키고 효소활성을 조사하였다.
0)로 용해시킨 다음 동일 완충액으로 투석시키고 농축시켰다. 농축한 효소액은 10mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 미리 평형화시켜둔 Sephadex G-100 column(5X45 cm)에 주입하여 0.55 ml/min의 유속으로 3.5 ml/tube씩 분획 하였으며 , 효소활성을 나타내는 분획을 모아서 농축하였다. 농축된 효소액은 다시 DEAE-cellulose column(3 X 60 cm)에 주입한 다음 흡착된 단백질을 0~1 M NaCl의 linear salt gradient의 방식으로 0.
0)로 투석시킨 후 동일 buffers. 미리 평형화시켜둔 Sephadex G-100 column(5 X 45 cm) 과 Sephadex G-150 column(3 X 70 cm)을 이용한 gel UltraHon과 DEAE-cellulose colunm(3X60 cm)을 이용한 anion exchange chromatography로 정제하였다.
03% Congo red로 조성된 분리용 배지에 도말하고 3WC에서 3일간 배양하였다. 이때 분리용 배지에서 균 주위에 투명한 환을 형성하는 균을 1차 선발하고, 24) 선발 된 균주는 분러용 배지에 agar와 Congo red를 뺀 broth(효소생산배지)에 접종하여 37℃에서 3일간 배양하여 얻은 조효소액의 활성을 측정하여 CGTase활성이 가장 높은 균을 최종 선발하여 1개월에 1회씩 계대 배양하고 보관하면서 본 실험에 사용하였다.
효소 활성은 효소액 1 ml가 1분간에 1 μmol의 |3-cyclodextrin을 생성하는 것을 1 unit로 정하였다. 이때 표준품으로는 |J-cyclodextrin을 사용하여 표준곡선을 작성하여 사용하였으며, 모든 실험은 3회 3반복으로 실시하였다.
transglucosylation. 정제된 10% stevioside용액 (pH 8.0) 5 m/와 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 녹인 10% dextrin 5 ml를 혼합한 후 정제된 효소액 1 ml를 첨가하여 80℃에서 24시간 반응시킨 후 효소처리하지 않은 stevioside를 대조구로 하여 CGTase에 의한 당전이성을 HPLC로 분석, 조사하였다. HPLC의 조건은 Table 1과 같다.
CGTase 의 정제. 효소생산배지에 0.1% albumin, 2% NH4C1, 2% soluble starch 및 0.2% KH2PO4< 첨가하여 37℃에서 3일간 균을 배양하여 조제한 조효소액에 황산암모늄을 70% 포화시켜 4℃에서 12시간 정치한 후, 효소단백질을 응집, 침전시킨 다음 8000rpm으로 15분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 분리된 침전물은 모아 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.
효소생산을 위한 최적배양조건의 검토. 효소생산을 위한 최적 조건은 유기질소원, 무기질소원, 무기염, 탄소원을 효소생산 배지에 첨가하여 37℃에서 배양시간별로 효소활성을 측정하여 최적 조건을 조사하였다.
안정성. 효소의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여 효소(106 unit/200 |xg protein)를 효소활성에 미치는 pH 영향 실험에 사용한 동일 완충용액에서 30℃에서 1시간동안 방치한 뒤 최적 pH로 조절하고 잔존활성을 측정하였다.
온도에 의한 영향. 효소활성에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위하여 효소액 0.1m/와 기질 1ml를 혼합한 후 효소 반응온도를 30~90℃까지 변화시키면서 효소활성을 측정하였다. 열 안정성.
효소생산배지에 접종한 균주를 37℃에서 3일간 배양한.후 5T 표준: probe를 장착한 Braun-Sonic 2000 U ultrasonic generator(Braun Biotech, Allentown, FA, USA)를 이용하여 초음파 처리하였으며, 이때 ultrasonicator의 작동조건은 power setting +250, repeating duty cycle 0.3초, operation time 120초이었다. 초음파 처리 후 배양액은 4℃에서 2시간 150rpm으로 shaking한 후 8000rpm으로 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 다음, Whatman No 1으로 여과한 여액을 조효소액으로 사용하였다.
대상 데이터
CGTase 생산균주의 선별 및 동정. 경북 북부지역의 토양과 부식토를 균원시료로 하여 생리식염수 10 m/에 약 1g의 토양 시료를 첨가하여 얻은 현탁액을 0.5% soluble starch, 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.1% J&HPQ), 0.02% MgSO4, 1.0% N&CO3, 2.0% agar, 0.03% Congo red로 조성된 분리용 배지에 도말하고 3WC에서 3일간 배양하였다. 이때 분리용 배지에서 균 주위에 투명한 환을 형성하는 균을 1차 선발하고, 24) 선발 된 균주는 분러용 배지에 agar와 Congo red를 뺀 broth(효소생산배지)에 접종하여 37℃에서 3일간 배양하여 얻은 조효소액의 활성을 측정하여 CGTase활성이 가장 높은 균을 최종 선발하여 1개월에 1회씩 계대 배양하고 보관하면서 본 실험에 사용하였다.
시약 및 기기. 본 연구에 사용된 시약은 soluble starch, trihydroxymethylamino methane, phenolphthalein, /J-cyclo-dextrin, stevioside, dextrin, Congo red(이상 Sigma Co. USA), polypeptone, yeast extract(이상 Difco, USA) 등이며 기타 시약은 분석용 등급의 시약을 사용하였으며, 기기는 spectrophotometer(Helios alpha, England), ultrasonicator(Braun Biotech, USA), HPLC(Water Co., USA) 등을 사용하였다.
이론/모형
activity 측정. CGTase activity의 측정은 Kaneko25* 등에 의해 제안된 phenolphthalein법을 사용하였다. 즉, 2% soluble starch를 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.
Protein 정량. 단백질 정량은 Lowry 등26)의 방법에 의하여 측정하였으며, bovine serum albumin을' 사용한 표준곡선에 의하여 환산하였다.
성능/효과
CGTase 생산균주 대부분이 단당류 및 이당류에 비해 starch와 같은 다당류에서 높은 효소생산성을 보이는 것으로 알려져 있다.%)본 실험에서도 각종 탄소원의 영향을 조사하기 위해 각 성분을 배지에 2.0%씩 첨가하여 37℃에서 3일간 배양하여 효소생산을 검토한 결과 Table 3과 같이 soluble starch와 lactose, maltose 등의 이당류 이상을 첨가했을 때 효소생산성이 높았다. 이러한 결과는 Bacillus속의 경우17,29,31) soluble starch에서 최대의 효소활성이 검출되었다는 보고와 유사하였고, B.
당전이 반응에 미치는 효소농도의 영향. Stevioside 당 전이 반응에 미치는 효소농도의 영향을 살펴보기 위하여 첨가 효소량을 20.5~410unit까지 변화시키며 당전이시켜 본 결과 Table 7에서와 같이 20.5 unit 및 41.0 unit 처리 시 당전이율이 74.9% 와 75.7%로 높게 나타났으며 205 unit 처리 시에는 당전이율이 68.7%로 다소 낮아졌으며, 처리당액의 갈변화가 진행되어 제품의 물성을 나쁘게 하였고, 410unit를 처리한 경우 당전이율은 57.9%로 더욱 떨어졌으며 역시 갈변화가 진행되었다. 또한 410 unit처 리시에는 당전 이 산물 중 stevioside + pentaglyceride, stevioside + hexaglyceride가 검출이 되지 않아 과도한 양의 효소사용은 오히려 당전이 반응에서 역효과가 나는 것으로 판단되었다.
0)로 24시간 투석한 후 농축하였다. 농축시킨 활성 분획은 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 평형화시킨 Sephadex G-150 column(3X 70 cm)에 주입한 후 0.25 ml/ min의 유속으로 6ml/tube씩 분획하였으며, 그 결과 Table 4와 같이 정제도 9.7배, 수율은 37.7%, 비활성도 528.02 unit/mg인 효소를 얻을 수 있었다.
정제된 stevioside 에 dextrin 을 가하고 CGTase를 첨가하여 stevioside로의 당전이성을 HPLC로 조사한 결과 Table 6과 같이 효소반응에 의해 생성된 총 product 의 양을 각 생성물질별 area백분율(%)로 표시하였다. 대조구의 경우 retention time(RT) 5.928에서 stevioside의 fraction이 검출되었다또한 본 균주가 생산하는 CGTase를 작용시킨 후 당전이성을 분석한 결과 대조구에서는 발견되지 않은 많은 종류의 배당체가 검출되어 CGTase에 의해 dextrin에서 떨어져 나온 여러 종류의 당들이 stevioside에 결합하여 stevioside + monoglyceride, stevioside + diglyceride, stevioside + triglyceride, stevioside + tetraglyceride, stevioside + pentaglyceride, stevioside + hexa흥lycoride 등%)다양한 종류의 당전이 stevioside glyceridR fraction0] 검출되었다.
2D와 같이 60 ~80℃에서 잔존 효소활성이 90% 이상으로 열에 안정하였다. 따라서 본 CGTase는 높은 열 안정성으로 효소 공정 시 잡균오염을 방지할 수 있어 산업적으로 유용하게 쓰일 가능성이 높은 것으로 판단되었다.
또한 410 unit처 리시에는 당전 이 산물 중 stevioside + pentaglyceride, stevioside + hexaglyceride가 검출이 되지 않아 과도한 양의 효소사용은 오히려 당전이 반응에서 역효과가 나는 것으로 판단되었다. 본 CGTase는 높은 열안정성으로 효소 반응 시 잡균 오염을 방지할 수 있고, 소량의 효소처리로 높은 당전이율을 얻을 수 있어 산업적으로 이용 가치가 높은 것으로 판단되었다.
편성 호기성으로, Gram 양성이었으며, 단당류, 이당류는 물론 당알코올과 전분 등을 잘 자화하여 광범위한 탄수화물의 이용특성을 나타내었다. 생리적 성질을 검토한 결과 15~45℃ 및 pH 5~11에서 생육이 가능하며, 9% NaCl 첨가배지에서도 생육할 수 있었으며, V-P반응 및 catalase 반응에서 양성반응을 보였다. Cowan과 SteeF>의 검색표와 Smith 등&의 보고에 따라, 본 균주는 gram 양성의 간균이며, catalase 양성이고 대부분 호기적 특성을 나타내고, 포자형성, 전분의 자화 및 V-P반응의 양성반응 등을 나타내므로, Bacillus속의 균주로 동정하였다.
최적 pH. 본 효소의 pH에 의한 영향을 알아보기 위해서 pH를 2~12로 조절한 기질 1ml와 효소액 0.1 ml를 혼합한 후 80P에서 30분간 반응시키고 효소활성을 측정한 결과 Fig. 2A 와 같이 pH 8.0에서 최적 pH를 나타내었다. 손 등, 33 김 등34) 이 Bacillus sp.
선발된 균의 생리 생화학적특성은 Table 2에서 보는 바와 같이 형태적 특성은 간균이고, 편모는 관찰되지 않았다. 편성 호기성으로, Gram 양성이었으며, 단당류, 이당류는 물론 당알코올과 전분 등을 잘 자화하여 광범위한 탄수화물의 이용특성을 나타내었다. 생리적 성질을 검토한 결과 15~45℃ 및 pH 5~11에서 생육이 가능하며, 9% NaCl 첨가배지에서도 생육할 수 있었으며, V-P반응 및 catalase 반응에서 양성반응을 보였다.
7%의 효소생산 증대가 관찰되어 가장 좋은 질소원으로 판단되었다. 효소생산에 미치는 각종 무기질소원의 영향을 조사하기 위해서 각 성분을 배지에 2.0%씩 첨가하여 37℃에서 3일간 배양하여 효소생산을 검토한 결과 Table 3과 같이 N%C1 에 의해 18.1 unit/m& 효소 생산성이 가장 우수하였다. 전 등29>은 Bacillus속 균주가 NH4C1에 의해 효소생산이 높게 나타났다고 보고하였으며 본 실험 결과와 일치하였다.
효소생산의 최적 조건. 효소생산에 미치는 각종 유기질 소원을 조사하기 위하여 각 성분을 효소생산배지에 0.1%씩 첨가하여 371에서 5일간 배양하여 효소생산을 검토한 결과 Table 3과 같이 대조구의 13.5 unit/m/에 비해 albumin과 pepton이 각각 19.6과 17.2unit/ml로 145.6과 127.7%의 효소생산 증대가 관찰되어 가장 좋은 질소원으로 판단되었다. 효소생산에 미치는 각종 무기질소원의 영향을 조사하기 위해서 각 성분을 배지에 2.
85 unit/ml로 최대의 효소생산량을 나타내었으며, 전 등29)의 KH2PO4에서 최대의 효소생산량을 나타낸 것과 유사하였다. 효소생산에 미치는 배양 시간을 알아보기 위하여 효소생산 배지에 0.1% albumin, 2% NH4C1, 2% soluble starch 및 0.2% KH2PO4> 첨가하여 37℃에서 0~120시간까지 배양 시간별로 검토한 결과 Fig. 1과 같이 배양 시작 후 72시간째 효소생산이 최대였다. 박 등21)은 세균의 CGTase가 68시간 배양 후 최대 생산량을 나타내었다고 보고하였으며, 본 실험 결과와 유사하였다.
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