효소에 의한 단백질 분해로 우리 밀의 저 알레르겐화를 시도하기 위한 기초 연구로서 금강밀에서 gluten fraction을 추출하여 동물 실험을 통하여 경구 섭취된 gluten에 대한 항체 생성을 유도하였다. Gluten fraction은 UTH buffer로 추출하여 10-50kDa 사이의 분자량에서 여러 밴드가 확인된 분획을 얻었으며 약 25 kDa, 34 kDa 그리고 45 kDa 부근의 밴드가 주요하게 나타났다. 그리고, 경구 투여로 유도된 gluten에 대한 항체는 ELISA와 western blot의 항원-항체 반응을 실시하여 anti-gluten lgG, IgE를 확인하였다. 또한 경구 투여의 투여 시간 경과에 따라 항체가는 상승하였다. 추출된 gluten fraction은 bromelain, papain, ficin 그리고 b.p. protease 각 효소의 최적 pH와 온도에서 가수 분해하여 gluten fraction의 알레르겐 저감화를 시도하였다. 효소 분해 후 gluten fraction의 저분자화 정도는 anti-gluten 하체에 대한 ELISA를 실시하여 검토하였다. 그 결과 bromelain, papain, ficin의 경우보다 b.p. protease을 처리한 경우가 ELISA value를 크게 저하시켰다. 이것은 gluten fraction이 b.p protease 효소 가수분해에 의해 생성된 항체가 인식하는 amino acid 서열 (epitope)이 분해되었음을 나타낸 것이다. 마지막으로 b.p. protease의 분해능력을 1mg, 2mg, 3mg/10mL로 첨가량을 달리하여 검토한 결과 첨가량에 따른 변화는 거의 나타나지 않았다. 따라서 금강밀의 gluten fraction 10mL에 b.p protease 1mg으로 4시간 처리하여 단백질을 분해하여 우리밀의 항원성 저하 가능성이 탐색되었다.
효소에 의한 단백질 분해로 우리 밀의 저 알레르겐화를 시도하기 위한 기초 연구로서 금강밀에서 gluten fraction을 추출하여 동물 실험을 통하여 경구 섭취된 gluten에 대한 항체 생성을 유도하였다. Gluten fraction은 UTH buffer로 추출하여 10-50kDa 사이의 분자량에서 여러 밴드가 확인된 분획을 얻었으며 약 25 kDa, 34 kDa 그리고 45 kDa 부근의 밴드가 주요하게 나타났다. 그리고, 경구 투여로 유도된 gluten에 대한 항체는 ELISA와 western blot의 항원-항체 반응을 실시하여 anti-gluten lgG, IgE를 확인하였다. 또한 경구 투여의 투여 시간 경과에 따라 항체가는 상승하였다. 추출된 gluten fraction은 bromelain, papain, ficin 그리고 b.p. protease 각 효소의 최적 pH와 온도에서 가수 분해하여 gluten fraction의 알레르겐 저감화를 시도하였다. 효소 분해 후 gluten fraction의 저분자화 정도는 anti-gluten 하체에 대한 ELISA를 실시하여 검토하였다. 그 결과 bromelain, papain, ficin의 경우보다 b.p. protease을 처리한 경우가 ELISA value를 크게 저하시켰다. 이것은 gluten fraction이 b.p protease 효소 가수분해에 의해 생성된 항체가 인식하는 amino acid 서열 (epitope)이 분해되었음을 나타낸 것이다. 마지막으로 b.p. protease의 분해능력을 1mg, 2mg, 3mg/10mL로 첨가량을 달리하여 검토한 결과 첨가량에 따른 변화는 거의 나타나지 않았다. 따라서 금강밀의 gluten fraction 10mL에 b.p protease 1mg으로 4시간 처리하여 단백질을 분해하여 우리밀의 항원성 저하 가능성이 탐색되었다.
Gluten was extracted from domestic wheat flour using UTH buffer (4 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.6) and validated by SDS-PAGE analysis for production of wheat flour products with reduced gluten content.. Anti-gluten polyclonal antibody was made by administering extracted gluten fraction on animal m...
Gluten was extracted from domestic wheat flour using UTH buffer (4 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.6) and validated by SDS-PAGE analysis for production of wheat flour products with reduced gluten content.. Anti-gluten polyclonal antibody was made by administering extracted gluten fraction on animal model. Anti-gluten serum titer of extracted gluten fraction was evaluated by ELISA, and that of antibody titer according to administration period. Anti-gluten sera were used for ELISA and immunoblot analysis before and after hydrolysis of gluten fraction at optimal pH and temperature condition for each protease. Gluten fraction separated by SDS-PAGE showed several bands covering 75 to 10 kDa, in which anti-gluten sera were 25, 34, and 45 kDa. Enzyme hydrolysis of gluten fraction revealed protein band sizes to be lower than 15 kDa. Content of pretense from bovine pancreas (b.p. protease) for gluten hydrolysis was estimated as 1 mg in 10 mL gluten fraction extracted for 4 hr.
Gluten was extracted from domestic wheat flour using UTH buffer (4 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.6) and validated by SDS-PAGE analysis for production of wheat flour products with reduced gluten content.. Anti-gluten polyclonal antibody was made by administering extracted gluten fraction on animal model. Anti-gluten serum titer of extracted gluten fraction was evaluated by ELISA, and that of antibody titer according to administration period. Anti-gluten sera were used for ELISA and immunoblot analysis before and after hydrolysis of gluten fraction at optimal pH and temperature condition for each protease. Gluten fraction separated by SDS-PAGE showed several bands covering 75 to 10 kDa, in which anti-gluten sera were 25, 34, and 45 kDa. Enzyme hydrolysis of gluten fraction revealed protein band sizes to be lower than 15 kDa. Content of pretense from bovine pancreas (b.p. protease) for gluten hydrolysis was estimated as 1 mg in 10 mL gluten fraction extracted for 4 hr.
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제안 방법
모든 효소 분해는 8시간 이후 거의 변화를 보이지 않았으며. 24시간 반응하였을 경우 이취가 발생하여 식용으로 사용할 경우 저 알레르겐 밀가루 제조에 적합하지 않은 조건으로 판단하고 8시간 반응까지실험 결과를 제시하였다.
4가지 효소 중 gluten fraction의 분해력이 우수하머 anti-gluten 항체와의 반웅에서도 항원성 저감화 정도를 크게 나타낸 b.p. protease에 대하여 효소 첨가량에 따른 분해 능력을 검토하였다(Fig. 6).
4주령된 ddY mouse(SLC, Japan)를 실험동물(9, 10)로 사용하여 gluten fraction을 경구 투여하였다. 경구 투여에는 마우스 3마리를 사용하였으며 각 마우스에게 1회 200μL(1mg/mL)씩 1 일 3회 투여하였다(Fig.
Mouse를 이용하여 분리된 gluten fraction을 경구 투여하여 항혈청을 제작하였으며 gluten fraction^ 4가지 효소로 처리하여 제작된 항체를 이용하여 gluten fraction의 항원성 저감화에 대한 생화학적 검토를 실시하였다.
cthiinoKlane B). UTH buffer(lane C and D)를 사용하였으며 SDS-PAGE를 통하여 gluten fraction 정제 정도를 비교하여 제시하였다. 각각의 주출 용매에 옹슬된 단백질은 다른 pattern을 나타내었으며 이 중 UTH buffer에 주출된 gluten fraction은 45 kDa 부근이 강하고 37, 35 kDa.
각 효소 처리에 의해 얻어진 단백질 항원을 coaling하여 gluten fraction에 의해 생성된 anti-gluten 혈청과 ELISA를 실시하였다. 각 효소의 처리 시간 경과에 따른 ELISA value는 bromelain과ficin은 4시간보다 8시간 처리에서 감소하였으며 b.
gluten fraction을 경구 투여하였다. 경구 투여에는 마우스 3마리를 사용하였으며 각 마우스에게 1회 200μL(1mg/mL)씩 1 일 3회 투여하였다(Fig. 1).
34 kDa 그리고 45 kDa 부근의 밴드가 주요하게 나타났다. 그리고, 경구 투여로 유도된 gluten에 대한 항체는 ELISA와 western blot의 항원-항체 반응을 실시하여 anti-gluten IgG, IgE를 확인하였다. 또한 경구 투여의 투여 시간 경과에 따라 항체가는 상승하였다.
대부분 항원에 대해 체내의 IgG 생성이 이루어지며 항원에 대한 IgE 항체가는 제 4형 지인형 알레르기(식품 알레르기)를 판단히는 신단요인으로 사용되고 있으므로 본 연구 결과는 경구 투여에 의해 항원 감작이 유발되어 항체가 생성되었음을 시사하는 것으로 이 항체를 다음 실험에 사용하였다.
3과 4의 ELISA와 western blot의 실험 결과를 종합하여 보면 gluten fraction의 경구 투여로 밀 gluten 분획 구성 단백질을 항원으로 하는 항체가 생성되었음을 확인할 수 있었다. 따라서 gluten에 의해 생성된 항혈청은 항원-항체 반응-을 실시하여 효소 처리에 의한 항원성 저감화를 관찰하는데 사용하였다.
반면 PBS를 사용하여 추출한 경우(lane A) 25 kDa 이하에서 band가 나타나지 않았으며 ethanol 추출한 경우(lane B)는 25 kDa 이상의 band가 나타나지 않아 gluten fraciion에 포하되는 단백질이 용출 분리되지 않은 조건으로 판단된다. 따라서 본 실험에서는 염기성인 gluten fraciion의 단백질의 분리가 UTH buffer에 의해 이루어졌음을 확인하고 이후 모든 실험에 UTH buffer에 의해 직접 조제한 gluten 분획을 사용하였다.
본 연구에서는 단배 항원에 대한 항체 생성의 면역반응 유도를 위하여 gluten fraction을 1 mg/mL의 농노로 200μL씩 하루에 3회 경구 투여하여 항 gluten 혈청을 언었다. 헐청의 anti- glutcn IgE 측정을 위하이 ELISA를 실시하였으며 그 결과를 Fig.
본 연구에서는 선행된 국내산 밀 품종의 제빵 적성에 대한 연구(7)에서 제빵성이 우수한 밀을 선정하여 밀의 대표적인 항원으로 보고되고 있는 gluten 을 분리하였다. Mouse를 이용하여 분리된 gluten fraction을 경구 투여하여 항혈청을 제작하였으며 gluten fraction^ 4가지 효소로 처리하여 제작된 항체를 이용하여 gluten fraction의 항원성 저감화에 대한 생화학적 검토를 실시하였다.
상등액을 일정량 취하여 각 효소의 적정 조건에서 1 mg/mL 농도의 gluten fraction lOmL에 1 mg의 효소를 첨가하여 최적 온도에서 0, 4, 8, 24시간 동안 반응시킨 후 PBS에서 투석하였다.
위 문헌들에서 언급된 밀가루의 항원으로써 반응하는 단백질은 gluten fraction을 구싱하는 문자들로써 본 연구에서도 항원성 저감화를 위해 먼저 gluten fmetion의 추출을 위해 여러 용매를 시도하여 gluten fraction 분리에 적합한 buffers를 선정하였다. 그 결과를 Fig.
주출된 gluten fraction은 bromelain, papain, ficin 그리고 b.p. protease 각 효소의 최적 pH와 온도에서 가수 분해하여 gluten fraction의 알레르겐 저감화를 시도하였다. 효소 분해 후 gluten fraction의 저분자화 정도는 anti-gluten 항체에 대한 ELISA를 실시하여 검토하였다.
채혈은 매주 1회 5주간 정기적으로 시행하였고, 4주간의 휴식기를 두고 다시 동일한 농도의 gluten ftaction을 투여하여 매주 1회 5주간 규칙적으로 채혈하였다. 채혈 schedule은 Fig.
단백질 정량은 시료 20μL에 1:4의 비율로 희석한 dye reagent 1 mL를 넣은 후 잘 혼합하여 실온에서 최소 5분간 방치한 후 590nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값은 BSA 표준 곡선을 이용하여 단백질 함량을 정량하였다.
3회 경구 투여하여 항 gluten 혈청을 언었다. 헐청의 anti- glutcn IgE 측정을 위하이 ELISA를 실시하였으며 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다.
protease 각 효소의 최적 pH와 온도에서 가수 분해하여 gluten fraction의 알레르겐 저감화를 시도하였다. 효소 분해 후 gluten fraction의 저분자화 정도는 anti-gluten 항체에 대한 ELISA를 실시하여 검토하였다. 그 결과 bromelain, papain, ficin의 경우보다 b.
효소에 의한 단백질 분해로 우리 밀의 저 알레르겐화를 시도하기 위한 기초 연구로서 금강밀에서 gluten faction을 추출하여 동물 실험을 통하여 경구 섭취된 gluten에 대한 항체 생성을 유도하였다. Gluten fraction은 UTH buffer로 추출하여 10- 50kDa 사이의 분자량에서 여러 밴드가 확인된 분획을 얻었으며 약 25 kDa.
대상 데이터
Gluten, 단백질 분해효소 및 기타 시약은 Sigma 제품을 시용하였으며 분자량 marker, membrane 및 전기영동 관련 시약은 Bio-rad 제품을 사용하였다.
또한 본 실험에 사용한 동물은 SLC(Japan)사의 식품 알레르기의 평가법과 그 응용연구(9, 10)에 적합하다고 등재되어 있는 ddY mouse(국립예방위생연구소, Japan, 1963) 4주령을 사용하였다.
본 실험에 사용된 밀가루는 농촌진흥청 작물시험장에서 분양 받은 6품종의 국내산 밀(탑동, 은파, 고분, 우리, 올그루, 금강 밀) 중 선행연구(7)에서 제빵적성 등이 우수하다고 판명된 금강밀을 사용하였으며 Buhler Test Mill(Buhler Bros., Inc., Uzwill, Switzerland)로 AACC(8)법에 의하여 60% 제분율로 제분하여 -70℃에 저장한 후 시료로 사용하였다.
본 연구에서는 식용이 가능한 천연 식물에서 추출한 단백 분해 효소 3가지, papain(EC 3.4.22.2). ficin(EC 3.
분자량 marker로는 Precision Protein Standard(Prestained broad range, Bio-rad, CA)를 사용하였다.
데이터처리
그러나 첨가량에 따른 분해 능력은 거의 차이가 나지 않았다. 이 결과로부터 최소 1mg/l0mL의 농도에서 충분한 gluten fraction 분해 효과를 나타낸 것으로 평가하였다. 이 결과는 밀가루 10 g당 1 g의 bromelain。030 units/mg)을 첨가하여 37℃에서 4시간 가수 분해로 밀의 항원성 저감화를 보고한 Tanabe의 연구(11)와 비교된다.
이론/모형
Meuse를 이용한 gluten Iraction의 경구투여에 의해 생성된 항체가 gluten fraction을 인식하는 정도를 관찰하기 위하여 western blot을 실시하였다(Fig. 4).
추출된 단백질은 Bradford method(12)에 근거한 Bio-Rad의 Protein Assay(13)로 정량하였고, 표준물질로 BSA(bovine serum albuminX 사용하였다. 단백질 정량은 시료 20μL에 1:4의 비율로 희석한 dye reagent 1 mL를 넣은 후 잘 혼합하여 실온에서 최소 5분간 방치한 후 590nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
ELISA value의 지하를 통하여 gluten fraction의 항원성이 분해되었다는 것이 확인되었다. 각각의 효소 bromelaindance B).
Fig. 3과 4의 ELISA와 western blot의 실험 결과를 종합하여 보면 gluten fraction의 경구 투여로 밀 gluten 분획 구성 단백질을 항원으로 하는 항체가 생성되었음을 확인할 수 있었다. 따라서 gluten에 의해 생성된 항혈청은 항원-항체 반응-을 실시하여 효소 처리에 의한 항원성 저감화를 관찰하는데 사용하였다.
그 결과 경구 투여의 경우, 휴식기 전 1st-stage의 5주 동안 gluten에 대한 항체가는 경구 투여 전에 비하이 증가를 나타내었으며. 4주의 휴식기를 눈 후 실시한 2nd-stage에서는 ELISA value:사 1st-stage 보다 계속적인 증가를 나타내었다.
p protease 효소 가수분해에 의해 생성된 항체가 인식하는 amino acid 서열(epitope)이 분해되었음을 나타낸 것이다. 마지막으로 b.p. protease의 분해능력을 1mg, 2mg, 3mg/10mL로 첨가량을 달리하여 검토한 결과 첨가량에 따른 변화는 거의 나타나지 않았다.
이 결과는 밀가루 10 g당 1 g의 bromelain。030 units/mg)을 첨가하여 37℃에서 4시간 가수 분해로 밀의 항원성 저감화를 보고한 Tanabe의 연구(11)와 비교된다. 본 연구에 사용된 b.p. protease 는 mg당 7.3 unit로 Tanabe의 연구에서 사용한 bromelain보다 낮은 unit 농도에도 불구하고 높은 활성을 나타내었다. 또한 산업적으로 scale-up할 시 특정 지역에서 재배되는 파인애플에서 추출된 bromelain보다 소의 췌장에서 추출된 b.
후속연구
protease가 분해력이 가장 우수하다고 나타난 본 연구의 결과와 비교된다. 또한 본 연구는 동물에서 얻어진 항체로 항원성 저감화를 관찰하였으므로 효소 처리된 gluten을 항원으로 사용하여 밀 알레르기 환자의 항 gluten 혈청에 대한 검토를 필요로 하겠다.
3 unit로 Tanabe의 연구에서 사용한 bromelain보다 낮은 unit 농도에도 불구하고 높은 활성을 나타내었다. 또한 산업적으로 scale-up할 시 특정 지역에서 재배되는 파인애플에서 추출된 bromelain보다 소의 췌장에서 추출된 b.p. protease가 사용에 편의를 제공할 것이라고 생각된다.
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