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문제 정의
- 위에서 기술한 각 쌀 추출물이 세포의 산화적 손상에서 가장 중요한 지질과산화를 억제할 수 있는가 여부를 조사하였다. 시료의 지질과산화 억제활성을 정확하게 평가하기 위해서 in vitro에서 linoleic acid의 자동산화에 대한 억제능을 측정하였고, 세포 내에서 일어나는 지질과산화에 대한 억제활성을 보다 정확히 측정하기 위한 수단으로서 토끼 적혈구(ghost cell) 막지질분획을 사용하여 ex vivo의 조건에서 지질과산화에 대한 억제활성을 측정하였으며, 각 시료의 지질과산화 억제활성을 평가하는 지표로서 항산화제인 BHT와 vitamin E를 대조구로 사용하였다.
- 이상의 실험을 통하여 in vitro의 실험계서 조사된 특수미의 항산화 활성이 살아있는 세포 내에서도 작용할 수 있는지 여부를 검토하기 위해서 이들 쌀 추출물이 세포 내에서 발생된 ROS를 소거할 수 있는지를 측정하였다. 이를 위하여 premyelo blastoma cell line인 HL-60 세포를 지시세포로 한 배양세포계서의 활성 산소종 소거활성을 측정하였다.
- 쌀의 경우에도 발아와 더불어 특수성분인 아라비녹실산, 감마아미노낙산 등의 성분이 증가하는 것으로 알려져 있다(16, 17). 이에 본 연구에서는 전적으로 취반용으로만 소비되기에는 부적합한 특수미 품종인 유색미와 거대배아미를 대상으로 발아에 따른 생리활성 물질의 함량 및 생리활성의 변화를 조사하고자 하였다. 이와 같은 목적으로 현재 시판 중인 유색 미와 거대배아미를 3일 간 발아시켰을 때 나타나는 총체적인 항산화활성의 변화를 환원력과 지질과산화 억제활성을 측정하고 in 의 실험계와 배양세포계에서 활성산소종(ROS; reactive oxygen species)에 대한 소거활성의 변화를 평가하였다.
- 실험에 사용된 superoxide radical은 in vitro에서 xanthine oxidase의 작용에 의하여 만들어진 것이므로, 관찰된 라디칼 소거활성이 시료가 직접적으로 라디칼을 소거한 것이 아니라, xanthine oxidase의 활성을 blocking 함으로써 radical 생성이 불가능하게 된 결과일 가능성도 있다. 이와 같은 가능성을 배제하기 위하여 시료가 xanthine oxidase의 활성에 미치는 영향을 조사하였다(Table 3). 결과에 나타난 바와 같이, 시료가 직접적으로 효소활성의 억제에 미치는 영향은 크지 않았다.
- 따라서 항산화 기능이 우수한 식품소재의 개발 및 일상적 섭취법의 개발은 중요한 의미를 갖게 될 것으로 본다. 이와 같은 의미에서 본 실험에서는 이미 육성된 쌀 품종 가운데 취반 목적으로 소비하기에는 부적합한 특수미를 건강 기능성 식품소재로 이용하기 위한 시도의 일환으로서 발아 처리한 특수미의 항산화 활성의 변화를 조사하였다. 그 결과, 발아 처리에 의하여 일반현미와 특수미인 거대배아미와 유색미 모두에서 활성산소종에 대한 소거활성이 in vitro 및 배양세포계서 크게 증가되는 것이 관찰되었다.
- 이와 같은 결과는 이미 보고된 바와 같이 유색미에는 cyanidine 3-O-β-D-glucoside 및 peonidine 3-O-β-D-glu-coside와 같은 일반미에는 없는 항산화 활성이 증명된 색소체가 다량 함유되어 있기 때문에 색소체가 없는 거대배아미보다도 환원력이 높게 관찰된 것으로 보인다(31, 32). 특히 발아처리에 의하여 거대배아미의 Fe 이온에 대한 환원 능력이 크게 증대되었다는 것은 발아 거대배아미의 항산화능이 무발아 대조군에 비하여 증가되었다는 의미하므로, 발아 거대배아미를 건강 기능성 식품소재로 이용할 수 있는 가능성을 제시하였다.
제안 방법
- 4)으로 전체 용량을 200μL로 조절하였다. ESR spectroscopy에 의 한 hydroxyl radical의 정량은 superoxide radi cal 측정 시와 동일한 기기 작동조건에서 수행하였다.
- 배양하였다. HL-60를 호중구 계열의 세포로 분화시키기 위하여 mL당 5×105의 세포에 최종농도가 1.4%가 되도록 DMSO를 첨가한 다음, 6일간 배양하여 분화를 유도하였다(28). 현미경으로 분화된 세포의 특징인 세포의 위축상태를 확인한 다음, 세포를 회수하여 PBS(phosphate-buffered saline)로 잘 세척하고, 1 mL의 PBS에 현탁된 5X10, 의 세포에 적당한 양의 시료와 DCFH-DA(2',7' -dichlorofluorescin diacetate)를 첨가하여 37℃에서 15분간 배양하며, 배양 후, TPA를 160 nM이 되도록 첨가하여 세포의 호흡폭발을 유도하였다.
- Linoleic acid peroxidation model system을 이용한 지질과산화 억 제활성은 0.13% linoleic acid 5 mL, 탈이온수 2.4 mL, 50 mM 인산완충액(pH 7.0) 5mL 및 시료 2mg(100μL)을 cap tube에 넣고 40℃ incubator에 10일간 보관 후 지질과산화 정도를 thiocyanate법(19)에 의하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, 반응액 100 μL에 4.
- 현미경으로 분화된 세포의 특징인 세포의 위축상태를 확인한 다음, 세포를 회수하여 PBS(phosphate-buffered saline)로 잘 세척하고, 1 mL의 PBS에 현탁된 5X10, 의 세포에 적당한 양의 시료와 DCFH-DA(2',7' -dichlorofluorescin diacetate)를 첨가하여 37℃에서 15분간 배양하며, 배양 후, TPA를 160 nM이 되도록 첨가하여 세포의 호흡폭발을 유도하였다. 다시 37℃에서 30분간 배양 후, FACS-vantage(Benton Dikison, NJ, USA)를 이용하여 세포 내 ROS의 생성 수준을 측정하였다(29).
- 따라서 이들 쌀 추출물의 품종 별 ROS 소거활성의 차이 및 발아처리에 의한 ROS 소거활성의 변화를 체계적으로 조사할 필요가 있기 때문에 ROS 중에서도 세포 내에서 가장 널리 작용하는 superoxide radical과 hydroxyl radical에 초점을 두고 실험을 수행하였다. 우선 superoxide radical에 대한 소거활성을 조사하기 위하여, 본 실험에서는 기질과 효소로서 hypoxanthine 및 xanthine oxidase를 사용하는 HPX/XOD system으로 생성된 superoxide radical을 실험에 이용하였다.
- 배양이 끝난 다음, 상징액을 제거하고 5mg/mL의 MTT 시약을 96 well당 100μL씩 분주하여 3시간 동안 배양기에 보관하였다. 반응 후, 잔여 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 100μL씩 분주하여 침전물을 충분히 용해시킨 다음, ELISA reader(Model 550, BioRad, USA)에서 570 nm의 측정파장 및 650 nm의 reference 파장을 기준으로 흡광도를 측정하였다.
- 7 mL의 75% EtOH, 100μL의 30% NH4SCN 용액을 넣고 20mM의 FeCl2 용액으로 발색시켰다. 반응의 결과 나타난 발색정도는 UV/VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)를 사용하여 517nm의 흡광도에서 측정하였다.
- 발아처리 유무에 따른 품종 별 쌀겨 70% 에탄올 추출물이 보유한 항산화 활성도를 비교하는 가장 간편한 지표로서 환원력을 측정하였다. 각 에탄올 추출물을 0.
- 발아처리에 의한 시료의 활성 증가율은 일반현미가 가장 높았으나, 발아 처리된 쌀의 전체적인 소거활성은 5mg/mL에서 유색미 > 거대배아미 > 일반현미의 순서로 나타났다. 본 실험에서는 Fenton 반응을 이용하여 hydroxyl radical을 생성하였기 때문에, 실험에서 측정된 hydroxyl radical 소거효과활성이 직접적인 radical에 대한 소거작용의 결과인지, 또는 Fenton반응에서 핵심적인 역할을 하는 Fe2+를 시료가 포족한 결과인지에 대한 답을 얻기 위하여 시료의 Fe2+ 포족능을 측정하였다(Table 4). 실험 결과가 나타내듯이, 쌀 추출물에서 적극적으로 Fe 이온을 포족하는 능력을 검출할 수 없었다.
- 우선 superoxide radical에 대한 소거활성을 조사하기 위하여, 본 실험에서는 기질과 효소로서 hypoxanthine 및 xanthine oxidase를 사용하는 HPX/XOD system으로 생성된 superoxide radical을 실험에 이용하였다. 생성된 radical은 반감기가 매우 짧고 불안정하기 때문에 spin trapping agent인 DMPO와 반응시켜서 생성된 DMPO-O2 adduct를 ESR specrometry로 측정하는 가장 직접적이고 신뢰성 있는 라디칼 측정법을 이용하여 시료가 가지는 superoxide radical 소거활성을 측정하였다. Table 3에 나타나 있듯이, 무발아 일반현미의 경우만 제외하고는 전반적으로 발아처리의 유무에 관계없이 시료의 농도가 증가하면 superoxide radical 소거활성은 증가하였다.
- 11 %가 되도록 순차적으로 첨가한 후, 100℃에서 5분간 열처리하였다. 생성된 침전을 원심분리로 제거한 상징액의 흡광도를 UV/VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)를 사용하여 535nm에서 측정하였다.
- 생체에서 발생하는 활성산소종 중에서 산화적 손상에 관여된 가장 유해한 라디칼이 hydroxyl radical이기 때문에, 시료의 hydroxyl radical에 대한 소거활성을 평가하였다. 본 실험에서는 hydrogen peroxide와 Fe2+의 존재 하에서 hydroxyl radical이 발생하는 Fenton반응을 이용하여 실험을 수행하였다.
- 그러나 특수미인 거대배아미와 유색미는 모든 시료 농도에서 발아에 의하여 ROS 소거활성이 유의하게 증가한다는 사실을 발견하였다. 시료 간 ROS 소거활성의 차이가 시료 처리로 인한 HL-60 세포의 사멸 때문일 가능성을 배제하기 위하여 MTT법에 의거, 시료의 독성을 조사하였다. Table 6의 실험 결과와 같이, 거대배아미와 유색미는 발아 처리에 의하여 세포의 생존율이 증가하는데 비하여, 일반미는 발아에 의하여 세포의 생존율이 현저하게 감소하였다(80μg/mL에서 일반현미는 74.
- 조사하였다. 시료의 지질과산화 억제활성을 정확하게 평가하기 위해서 in vitro에서 linoleic acid의 자동산화에 대한 억제능을 측정하였고, 세포 내에서 일어나는 지질과산화에 대한 억제활성을 보다 정확히 측정하기 위한 수단으로서 토끼 적혈구(ghost cell) 막지질분획을 사용하여 ex vivo의 조건에서 지질과산화에 대한 억제활성을 측정하였으며, 각 시료의 지질과산화 억제활성을 평가하는 지표로서 항산화제인 BHT와 vitamin E를 대조구로 사용하였다. 우선 linoleic acid peroxidation 실험계의 결과를 보면, 무발아 조건에서도 거대배아미와 유색미의 억제활성은 대조구인 무발아 현미에 비하여 유의하게 높았으며 (Table 2), 일반현미의 경우 발아에 의하여 그 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 94 mL와 24 mN의 tert-butylhy-droperoxide 50μL, 시료 2 mg가 포함된 반응액 1 mL를 37℃에서 30분간 교반하면서 반응하였다. 여기에 TCA와 thiobarbituric acid(TBA)를 최종농도가 각각 4% 및 0.11 %가 되도록 순차적으로 첨가한 후, 100℃에서 5분간 열처리하였다. 생성된 침전을 원심분리로 제거한 상징액의 흡광도를 UV/VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)를 사용하여 535nm에서 측정하였다.
- 본 실험에서는 hydrogen peroxide와 Fe2+의 존재 하에서 hydroxyl radical이 발생하는 Fenton반응을 이용하여 실험을 수행하였다. 위에서 기술한 것과 같은 과정으로 반감기가 짧은 hydroxyl radical을 DMPO와 반응시켜 생성된 DMPO-OH adduct를 ESR spectrom-etry로 측정함으로써 가장 직접적인 실험방법에 의거히여 hydroxyl radical의 상대적인 수준을 정량하였다. Table 4에 나타난 실험결과와 같이, hydroxyl radical 소거활성도 역시 시료 농도의 증가와 더불어 증가하였다.
- 소거할 수 있는지를 측정하였다. 이를 위하여 premyelo blastoma cell line인 HL-60 세포를 지시세포로 한 배양세포계서의 활성 산소종 소거활성을 측정하였다. HL-60은 DMSO 자극으로 호중구로 분화하며, 분화된 호중구계의 세포는 TPA의 자극으로 호흡폭발(respiratory burst)를 일으켜, superoxide radical이나 hydroxyl radical과 같은 다량의 ROS가 세포 내에 축적되는 것으로 알려져 있다.
- 이상의 실험을 통하여 우리는 일반적인 취반용 쌀로서 적합하지 않은 특수미인 거대배아미와 유색미의 생리활성을 항산화 활성을 중심으로 발아 및 무발아 조건에서 조사하였다. 현대 의학이 직면하고 있는 난치병 가운데 만성관절 류머티즘, 동맥경화증과 같은 질병이 사회 전반적인 산업화와 고령화 추세와 더불어 증가하기 때문에 최근 만성염증성 증식성 질환(CIPD; chronic inflammatoiy proliferative disease)이라는 독립된 카테고리로 분류하여 다루고 있는 실정이다(35).
- 이에 본 연구에서는 전적으로 취반용으로만 소비되기에는 부적합한 특수미 품종인 유색미와 거대배아미를 대상으로 발아에 따른 생리활성 물질의 함량 및 생리활성의 변화를 조사하고자 하였다. 이와 같은 목적으로 현재 시판 중인 유색 미와 거대배아미를 3일 간 발아시켰을 때 나타나는 총체적인 항산화활성의 변화를 환원력과 지질과산화 억제활성을 측정하고 in 의 실험계와 배양세포계에서 활성산소종(ROS; reactive oxygen species)에 대한 소거활성의 변화를 평가하였다.
- JEOL, Japan)로 정량하였다(23). 즉, 적당량의 시료를 35μL의 5.5 mM diethylenediamine-pentaacetic acid(DETAPAC), 15μL의 9.2 M DMPO와 0.02 unit의 xanthine oxidase와 혼합하여 0.1M 인산 완충액(pH 7.4)로 반응용량을 1 mL로 조절하였다. ESR spectroscopy를 위한 기기 설정조건은 다음과 같다.
- . 즉, 적당량의 시료를 50μL의 0.3 M DMPO와 50μL] 10 mM FeSO4, 50μL의 10mM의 H2O2와 혼합하여 0.1M 인산 완충액(pH 7.4)으로 전체 용량을 200μL로 조절하였다. ESR spectroscopy에 의 한 hydroxyl radical의 정량은 superoxide radi cal 측정 시와 동일한 기기 작동조건에서 수행하였다.
- 4%가 되도록 DMSO를 첨가한 다음, 6일간 배양하여 분화를 유도하였다(28). 현미경으로 분화된 세포의 특징인 세포의 위축상태를 확인한 다음, 세포를 회수하여 PBS(phosphate-buffered saline)로 잘 세척하고, 1 mL의 PBS에 현탁된 5X10, 의 세포에 적당한 양의 시료와 DCFH-DA(2',7' -dichlorofluorescin diacetate)를 첨가하여 37℃에서 15분간 배양하며, 배양 후, TPA를 160 nM이 되도록 첨가하여 세포의 호흡폭발을 유도하였다. 다시 37℃에서 30분간 배양 후, FACS-vantage(Benton Dikison, NJ, USA)를 이용하여 세포 내 ROS의 생성 수준을 측정하였다(29).
대상 데이터
- 실험에 사용한 벼 종자는 모두 (주)신지에서 제공받았다. 종자를 벤레이트 수화제로 소독한 후, 15℃ 증류수에 48시간 침지 후, 27℃에서 3일간 발아시켜, 왕겨 껍질을 제거하고, 분쇄 후, 5배량의 70% EtOH로 80℃에서 3시간 동안 reflux하면서 추출하여 감압건조 후 DMSO에 용해시켜 200mg/mL의 농도로 만들어 -20℃에 냉동 보관하면서 사용하였다.
- 종자를 벤레이트 수화제로 소독한 후, 15℃ 증류수에 48시간 침지 후, 27℃에서 3일간 발아시켜, 왕겨 껍질을 제거하고, 분쇄 후, 5배량의 70% EtOH로 80℃에서 3시간 동안 reflux하면서 추출하여 감압건조 후 DMSO에 용해시켜 200mg/mL의 농도로 만들어 -20℃에 냉동 보관하면서 사용하였다. 실험에 사용한 화학시약은 모두 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 ACS의 시약을 구입하여 추가적인 정제과정 없이 실험에 사용하였다.
- 따라서 이들 쌀 추출물의 품종 별 ROS 소거활성의 차이 및 발아처리에 의한 ROS 소거활성의 변화를 체계적으로 조사할 필요가 있기 때문에 ROS 중에서도 세포 내에서 가장 널리 작용하는 superoxide radical과 hydroxyl radical에 초점을 두고 실험을 수행하였다. 우선 superoxide radical에 대한 소거활성을 조사하기 위하여, 본 실험에서는 기질과 효소로서 hypoxanthine 및 xanthine oxidase를 사용하는 HPX/XOD system으로 생성된 superoxide radical을 실험에 이용하였다. 생성된 radical은 반감기가 매우 짧고 불안정하기 때문에 spin trapping agent인 DMPO와 반응시켜서 생성된 DMPO-O2 adduct를 ESR specrometry로 측정하는 가장 직접적이고 신뢰성 있는 라디칼 측정법을 이용하여 시료가 가지는 superoxide radical 소거활성을 측정하였다.
- 인간의 premyeloblastoma cell line인 HL-60는 ATCC(Manas- sas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10% fetal bovine serum(Hyclone, Logan, UT, USA)를 첨가시킨 phenol red가 없는 RPMI 1640 배지(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 5% CO, 조건의 포화습도의 공기에서 배양하였다. HL-60를 호중구 계열의 세포로 분화시키기 위하여 mL당 5×105의 세포에 최종농도가 1.
데이터처리
- 3회 실험의 평균치는 mean±SD로 표시하였으며, 반복실험 평균값 간의 유의성은 SAS software를 이용하여 Duncan's multiple range test에 의해서 검증하였고 p<0.05에서 평균값 간의 유의적 차이를 구하였다.
이론/모형
- Oyaizu 등의 방법(18)에 의거하여 특수미의 환원력을 측정하였다. 즉, 농도별로 조제한 시료 20μL를 50mM 인산 완충액(pH 6.
- Xanthine oxidase의 억제활성은 Noro의 방법에 따라 수행하였다(24). 200 mM 인산완충액 (pH 7.
- 발아거대배아미 추출물이 Fenton 반응에 필요한 Fe2+의 포족여부를 Carter의 방법(27)에 따라 측정하였다. 10mM 인산완충액(pH 7.
- radical에 대한 소거활성을 평가하였다. 본 실험에서는 hydrogen peroxide와 Fe2+의 존재 하에서 hydroxyl radical이 발생하는 Fenton반응을 이용하여 실험을 수행하였다. 위에서 기술한 것과 같은 과정으로 반감기가 짧은 hydroxyl radical을 DMPO와 반응시켜 생성된 DMPO-OH adduct를 ESR spectrom-etry로 측정함으로써 가장 직접적인 실험방법에 의거히여 hydroxyl radical의 상대적인 수준을 정량하였다.
- 쌀 추출물이 세포의 생존에 미치는 효과는 Mosmann이 보고한 MTT colorimetric reduction assay에 의하여 수행하였으며 (30). 이미 기술한 세포 내 ROS 소거활성의 측정방법과 동일한 조건으로 세포를 배양하였다.
- 토끼 적혈구막 지질분획의 조제 및 이를 이용한 지질과산화억제 활성의 측정은 주로 Ames 등(20) 및 Tsuda 등(21)이 확립한 방법에 따라 시행하였다. 토끼의 혈액은 cardiac punching으로 얻었고, 저장액 조건(10mM 인산 완충액, pH 7.
성능/효과
- 반면, 유색미에서는 현저한 활성증가는 관찰되지 않았다(Table 2). In vitro의 결과에서 발아 일반현미의 억제활성이 72%로 나타났지만, ex vivo의 실험계서는 57% 정도로 나타났다. 세포 내에서 발생하는 지질과산화 반응은 막에 함유된 각종 항산화성 물질이나 효소들에 의하여 제어되고 있는 반면, in vitro의 실험계는 이와 같은 세포 내 제어기작을 반영하지 못하는 것을 감안한다면, 토끼 적혈구 막지질을 기질로 사용한 ex vivo의 실험계서 얻어진 결과가 in vitro의 결과보다 신뢰성이 있다고 생각된다.
- 시료 간 ROS 소거활성의 차이가 시료 처리로 인한 HL-60 세포의 사멸 때문일 가능성을 배제하기 위하여 MTT법에 의거, 시료의 독성을 조사하였다. Table 6의 실험 결과와 같이, 거대배아미와 유색미는 발아 처리에 의하여 세포의 생존율이 증가하는데 비하여, 일반미는 발아에 의하여 세포의 생존율이 현저하게 감소하였다(80μg/mL에서 일반현미는 74.2%에서 26.2%로 감소). 전반적으로 발아 처리 조건에서 세포독성은 일반현미 > 거대배아미 >유색미의 순서를 보였다.
- 이와 같은 의미에서 본 실험에서는 이미 육성된 쌀 품종 가운데 취반 목적으로 소비하기에는 부적합한 특수미를 건강 기능성 식품소재로 이용하기 위한 시도의 일환으로서 발아 처리한 특수미의 항산화 활성의 변화를 조사하였다. 그 결과, 발아 처리에 의하여 일반현미와 특수미인 거대배아미와 유색미 모두에서 활성산소종에 대한 소거활성이 in vitro 및 배양세포계서 크게 증가되는 것이 관찰되었다. 본 실험의 결과, 특수미 중에서 거대배아미와 유색미는 발아 처리에 의하여 세포 내 ROS 소거활성이 증진될 뿐 아니라, 세포 독성도 낮아지기 때문에 기능성이나 독성의 측면에서 건강기능성 식품소재로 이용가치가 높다고 하겠다.
- 일반미를 포함한 모든 쌀이 발아 처리에 의하여 ROS 소거활성이 증가한다는 사실을 알았으며, 발아 처리와 관계없이 ROS 소거활성은 유색미 > 거대배아미 > 일반현미의 순서를 보였다. 그러나 특수미인 거대배아미와 유색미는 모든 시료 농도에서 발아에 의하여 ROS 소거활성이 유의하게 증가한다는 사실을 발견하였다. 시료 간 ROS 소거활성의 차이가 시료 처리로 인한 HL-60 세포의 사멸 때문일 가능성을 배제하기 위하여 MTT법에 의거, 시료의 독성을 조사하였다.
- Table 4에 나타난 실험결과와 같이, hydroxyl radical 소거활성도 역시 시료 농도의 증가와 더불어 증가하였다. 그리고 지금까지 기술한 항산화 활성 및 라디칼 소거활성의 경우와 비슷하게 발아처리에 의하여 시료의 소거활성은 모든 경우에서 증가하는 경향을 보였다. 발아처리에 의한 시료의 활성 증가율은 일반현미가 가장 높았으나, 발아 처리된 쌀의 전체적인 소거활성은 5mg/mL에서 유색미 > 거대배아미 > 일반현미의 순서로 나타났다.
- 유색미를 제외하고는 발아처리에 의하여 환원력이 증가하였는데, 특히 발아처리된 거대배아미와 유색미에서 농도증가에 따라 환원력은 급격히 증가하는 현상을 볼 수 있었다. 기술한 바와 같이, 발아처리는 유색미의 환원력을 저하시키지만, 발아 유색미의 전체적인 환원력은 타 품종의 쌀보다 월등히 높았다. 이와 같은 결과는 이미 보고된 바와 같이 유색미에는 cyanidine 3-O-β-D-glucoside 및 peonidine 3-O-β-D-glu-coside와 같은 일반미에는 없는 항산화 활성이 증명된 색소체가 다량 함유되어 있기 때문에 색소체가 없는 거대배아미보다도 환원력이 높게 관찰된 것으로 보인다(31, 32).
- Table 3에 나타나 있듯이, 무발아 일반현미의 경우만 제외하고는 전반적으로 발아처리의 유무에 관계없이 시료의 농도가 증가하면 superoxide radical 소거활성은 증가하였다. 또한 발아처리는 거대배아미와 일반미의 라디칼 소거활성을 증가시키는 경향이 있었다. 반면, 유색미는 발아에 의하여 활성이 감소되었지만 반응에 사용된 농도나 발아처리 여부에 관계없이 측정한 쌀 시료 중에서 전체적인 superoxide radical 소거활성이 가장 높았다.
- 이상의 결과를 볼 때, 거대배아미와 유색미의 superoxide radical 소거활성이 부분적으로는 시료에 의한 xanthine oxidase 활성 억제 때문에 일어났음을 부인할 수 없지만, 직접적인 radical 소거가 더 중요한 요인임을 암시하였다. 또한, 발아, 또는 무발아 일반현미의 superoxide radical 소거활성과 xanthine oxidase 활성 억제능을 볼 때, 일반현미는 두 가지 특수미 품종과는 다른 작용을 통하여 superoxide radical을 소거할 가능성이 시사되었다.
- 토끼 적혈구 막지질 분획을 이용한 실험계의 결괴는 linoleic acid perox idation 실험계서 관찰된 결과와는 약간의 차이가 있었다. 발아처리는 거대배아미와 일반현미의 지질과산화 억제활성을 유의하게 증가시킨 것을 알 수 있었는데, 특히 거대배아미에서 활성이 가장 현저하게 증가하였고 거의 대조구로 사용한 vitamin E 수준의 지질과산화 억제활성을 보여주었다. 반면, 유색미에서는 현저한 활성증가는 관찰되지 않았다(Table 2).
- 결과에 나타난 바와 같이, 시료가 직접적으로 효소활성의 억제에 미치는 영향은 크지 않았다. 발아처리에 의하여 xanthine oxidase 활성에 대한시료의 억제도는 거대배아미와 유색미에서 감소하였으나, 일반현미에서는 오히려 증가함을 알 수 있었다. 이상의 결과를 볼 때, 거대배아미와 유색미의 superoxide radical 소거활성이 부분적으로는 시료에 의한 xanthine oxidase 활성 억제 때문에 일어났음을 부인할 수 없지만, 직접적인 radical 소거가 더 중요한 요인임을 암시하였다.
- 그리고 지금까지 기술한 항산화 활성 및 라디칼 소거활성의 경우와 비슷하게 발아처리에 의하여 시료의 소거활성은 모든 경우에서 증가하는 경향을 보였다. 발아처리에 의한 시료의 활성 증가율은 일반현미가 가장 높았으나, 발아 처리된 쌀의 전체적인 소거활성은 5mg/mL에서 유색미 > 거대배아미 > 일반현미의 순서로 나타났다. 본 실험에서는 Fenton 반응을 이용하여 hydroxyl radical을 생성하였기 때문에, 실험에서 측정된 hydroxyl radical 소거효과활성이 직접적인 radical에 대한 소거작용의 결과인지, 또는 Fenton반응에서 핵심적인 역할을 하는 Fe2+를 시료가 포족한 결과인지에 대한 답을 얻기 위하여 시료의 Fe2+ 포족능을 측정하였다(Table 4).
- 그 결과, 발아 처리에 의하여 일반현미와 특수미인 거대배아미와 유색미 모두에서 활성산소종에 대한 소거활성이 in vitro 및 배양세포계서 크게 증가되는 것이 관찰되었다. 본 실험의 결과, 특수미 중에서 거대배아미와 유색미는 발아 처리에 의하여 세포 내 ROS 소거활성이 증진될 뿐 아니라, 세포 독성도 낮아지기 때문에 기능성이나 독성의 측면에서 건강기능성 식품소재로 이용가치가 높다고 하겠다.
- 이 실험계를 사용하여 각 쌀 추출물의 ROS 소거활성을 측정한 결과가 Table 5이다. 쌀 추출물을 농도 별로 첨가하였을 때, 발아 처리한 일반현미를 제외하고는 ROS 소거활성은 농도 증가에 따라 증가하는 경향이 있었고 120μg/mL의 농도에서 활성은 포화상태에 도달하였다. 일반미를 포함한 모든 쌀이 발아 처리에 의하여 ROS 소거활성이 증가한다는 사실을 알았으며, 발아 처리와 관계없이 ROS 소거활성은 유색미 > 거대배아미 > 일반현미의 순서를 보였다.
- 시료의 지질과산화 억제활성을 정확하게 평가하기 위해서 in vitro에서 linoleic acid의 자동산화에 대한 억제능을 측정하였고, 세포 내에서 일어나는 지질과산화에 대한 억제활성을 보다 정확히 측정하기 위한 수단으로서 토끼 적혈구(ghost cell) 막지질분획을 사용하여 ex vivo의 조건에서 지질과산화에 대한 억제활성을 측정하였으며, 각 시료의 지질과산화 억제활성을 평가하는 지표로서 항산화제인 BHT와 vitamin E를 대조구로 사용하였다. 우선 linoleic acid peroxidation 실험계의 결과를 보면, 무발아 조건에서도 거대배아미와 유색미의 억제활성은 대조구인 무발아 현미에 비하여 유의하게 높았으며 (Table 2), 일반현미의 경우 발아에 의하여 그 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 그러나 유색미와 거대배아미의 지질과산화 억제활성은 발아 처리에 의하여 유의성있게 증가하지는 않았다.
- 전반적으로 발아, 무발아 조건에 관계없이 환원력은 유색미가 가장 높았고, 그 다음이 거대배아미 > 일반현미의 순서였다. 유색미를 제외하고는 발아처리에 의하여 환원력이 증가하였는데, 특히 발아처리된 거대배아미와 유색미에서 농도증가에 따라 환원력은 급격히 증가하는 현상을 볼 수 있었다. 기술한 바와 같이, 발아처리는 유색미의 환원력을 저하시키지만, 발아 유색미의 전체적인 환원력은 타 품종의 쌀보다 월등히 높았다.
- 실험 결과가 나타내듯이, 쌀 추출물에서 적극적으로 Fe 이온을 포족하는 능력을 검출할 수 없었다. 이 결과는 본 실험에 사용된 쌀 추출물의 hydroxyl radical 소거활성은 직접적인 radical quenching의 결과일 가능성을 강력하게 시사하였다.
- In vitro 실험계서 얻어진 결과가ex vivo에서의 결과보다 다소 높은 것은 아마도 추출물 내에 존재하는 물질들이 가지는 pro-oxidant로서의 활성이 in vitro계에서 길항적으로 조절되지 못한 상태에서 발현된 결과일 가능성이 있다(33). 이 실험을 통하여 특수미인 거대배아미와 유색미의 지질과산화 억제활성은 발아처리에 의하여 잘 알려진 항산화제인 BHT나 vitamin E 수준까지 증가한다는 사실을 알 수 있었다.
- 발아처리에 의하여 xanthine oxidase 활성에 대한시료의 억제도는 거대배아미와 유색미에서 감소하였으나, 일반현미에서는 오히려 증가함을 알 수 있었다. 이상의 결과를 볼 때, 거대배아미와 유색미의 superoxide radical 소거활성이 부분적으로는 시료에 의한 xanthine oxidase 활성 억제 때문에 일어났음을 부인할 수 없지만, 직접적인 radical 소거가 더 중요한 요인임을 암시하였다. 또한, 발아, 또는 무발아 일반현미의 superoxide radical 소거활성과 xanthine oxidase 활성 억제능을 볼 때, 일반현미는 두 가지 특수미 품종과는 다른 작용을 통하여 superoxide radical을 소거할 가능성이 시사되었다.
- 쌀 추출물을 농도 별로 첨가하였을 때, 발아 처리한 일반현미를 제외하고는 ROS 소거활성은 농도 증가에 따라 증가하는 경향이 있었고 120μg/mL의 농도에서 활성은 포화상태에 도달하였다. 일반미를 포함한 모든 쌀이 발아 처리에 의하여 ROS 소거활성이 증가한다는 사실을 알았으며, 발아 처리와 관계없이 ROS 소거활성은 유색미 > 거대배아미 > 일반현미의 순서를 보였다. 그러나 특수미인 거대배아미와 유색미는 모든 시료 농도에서 발아에 의하여 ROS 소거활성이 유의하게 증가한다는 사실을 발견하였다.
- 2%로 감소). 전반적으로 발아 처리 조건에서 세포독성은 일반현미 > 거대배아미 >유색미의 순서를 보였다. 본 실험에 사용된 DMSO로 자극한 HL-60 세포와 같이 일반적으로 분화된 세포는 사멸되기 쉬운 경향은 있으나, 발아 현미나 무발아 거대배아미 추출물에 사멸을 촉진시키는 인자가 있는지 여부를 구명하기 위해서는 보다 체계적인 연구가 요구되며, 특히 정상세포에 대한 세포독성의 유도여부를 판별하기 위해서는 primary cell이나 이와 유사한 세포주를 시용하여 검정할 필요가 있다.
- 3 mg/mL까지 농도별로 첨가하였을 때 측정된 품종별 환원력을 Table 1에나타내었다. 전반적으로 발아, 무발아 조건에 관계없이 환원력은 유색미가 가장 높았고, 그 다음이 거대배아미 > 일반현미의 순서였다. 유색미를 제외하고는 발아처리에 의하여 환원력이 증가하였는데, 특히 발아처리된 거대배아미와 유색미에서 농도증가에 따라 환원력은 급격히 증가하는 현상을 볼 수 있었다.
후속연구
- 전반적으로 발아 처리 조건에서 세포독성은 일반현미 > 거대배아미 >유색미의 순서를 보였다. 본 실험에 사용된 DMSO로 자극한 HL-60 세포와 같이 일반적으로 분화된 세포는 사멸되기 쉬운 경향은 있으나, 발아 현미나 무발아 거대배아미 추출물에 사멸을 촉진시키는 인자가 있는지 여부를 구명하기 위해서는 보다 체계적인 연구가 요구되며, 특히 정상세포에 대한 세포독성의 유도여부를 판별하기 위해서는 primary cell이나 이와 유사한 세포주를 시용하여 검정할 필요가 있다.
- 쌀의 과잉생산과 소비감소, 그리고 쌀시장 개방으로 인한 농촌의 경제 · 사회적 문제점을 해결하기 위해서는, 단순히 에너지 공급 또는 영양소 공급원으로서가 아니라 생리활성 기능성이 풍부한 건강보조식품으로 개발될 수 있는 가능성까지 구비하는 쌀 품종이 개발되어야 할 필요성이 대두되었다. 이와 같은 필요성에 부응하여 유색미, 거대배아미, 발효미 등 다양한 종류의 기능성 쌀들이 개발되고 있다.
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