본 연구에서는 유전자 재조합 되지 않은(non-GM) 대두와 유전자 재조합된(GM) 대두가 혼입되어 제조된 두부에서 효소 면역 측정법을 이용하여 non-GM 대두의 혼입량을 추정하고자 하였다. 두부의 SDS-PAGE 실행 결과 non-GM 두부에서만 나타나는 특이 단백질 non-GM 113kDa 밴드와 non-GM과 GM 두부에서 모두 나타나는 non-GM 24kDa 밴드를 선별하고 이들을 토끼에 면역하여 항체생성 여부를 ELISA한 결과 non-GM 113kDa과 non-GM 24kDa 단백질 모두 항체가 형성됨을 확인하였고 $10^{-1}-10^{-6}$의 단백질 희석배수에서 두부를 이들 항체에 대하여 ELISA함으로써 원료대두의 GM여부를 확인할 수 있었다. 이들 중, 보다 감도가 높았던 non-GM 113kDa 단백질을 $10^{-7}-10^{-6}$의 배수로 희석하여 ELISA 흡광도와 non-GM 단백질의 관계를 나타내는 표준곡선을 작성하였고, 임의로 non-GM 대두와 GM 대두를 혼합하여 제조한 두부의 ELISA 흡광도를 이 표준곡선과 비교하여 non-GM 원료와 GM 원료 작물의 혼입율을 측정한 결과, 높은 정확도를 보였다.
본 연구에서는 유전자 재조합 되지 않은(non-GM) 대두와 유전자 재조합된(GM) 대두가 혼입되어 제조된 두부에서 효소 면역 측정법을 이용하여 non-GM 대두의 혼입량을 추정하고자 하였다. 두부의 SDS-PAGE 실행 결과 non-GM 두부에서만 나타나는 특이 단백질 non-GM 113kDa 밴드와 non-GM과 GM 두부에서 모두 나타나는 non-GM 24kDa 밴드를 선별하고 이들을 토끼에 면역하여 항체생성 여부를 ELISA한 결과 non-GM 113kDa과 non-GM 24kDa 단백질 모두 항체가 형성됨을 확인하였고 $10^{-1}-10^{-6}$의 단백질 희석배수에서 두부를 이들 항체에 대하여 ELISA함으로써 원료대두의 GM여부를 확인할 수 있었다. 이들 중, 보다 감도가 높았던 non-GM 113kDa 단백질을 $10^{-7}-10^{-6}$의 배수로 희석하여 ELISA 흡광도와 non-GM 단백질의 관계를 나타내는 표준곡선을 작성하였고, 임의로 non-GM 대두와 GM 대두를 혼합하여 제조한 두부의 ELISA 흡광도를 이 표준곡선과 비교하여 non-GM 원료와 GM 원료 작물의 혼입율을 측정한 결과, 높은 정확도를 보였다.
Enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) was applied to quantify soy protein in fresh soybean curd (bean curd) produced by combination of genetically modified (GM) and genetically not modified (non-GM) soybeans. Antibodies against 113 and 24 kDa proteins, which appeared only in non-GM bean curd (s...
Enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) was applied to quantify soy protein in fresh soybean curd (bean curd) produced by combination of genetically modified (GM) and genetically not modified (non-GM) soybeans. Antibodies against 113 and 24 kDa proteins, which appeared only in non-GM bean curd (specific band), and in both non-GM and GM bean curds (non-specific band) based on SDS-PAGE results, were prepared by immunization to rabbit. Through ELISA using either antibody, GM bean curd protein content was determined at dilution rates of $10^{-1}-10^{-6}$. Standard curve showing relationship between ELISA optical density and non-GM protein content was produced using antibody against 113 kDa protein at protein dilution between $10^{-7}\;to\;10^{-6}$, highly antigen content-dependent dilution. Bean curd prepared by random combinations of GM and non-GM soybeans were analyzed by ELISA, and standard curve was produced. Results reveal non-GM protein content of bean curd could be quantified with higher than 93% accuracy.
Enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) was applied to quantify soy protein in fresh soybean curd (bean curd) produced by combination of genetically modified (GM) and genetically not modified (non-GM) soybeans. Antibodies against 113 and 24 kDa proteins, which appeared only in non-GM bean curd (specific band), and in both non-GM and GM bean curds (non-specific band) based on SDS-PAGE results, were prepared by immunization to rabbit. Through ELISA using either antibody, GM bean curd protein content was determined at dilution rates of $10^{-1}-10^{-6}$. Standard curve showing relationship between ELISA optical density and non-GM protein content was produced using antibody against 113 kDa protein at protein dilution between $10^{-7}\;to\;10^{-6}$, highly antigen content-dependent dilution. Bean curd prepared by random combinations of GM and non-GM soybeans were analyzed by ELISA, and standard curve was produced. Results reveal non-GM protein content of bean curd could be quantified with higher than 93% accuracy.
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문제 정의
전술한 바와 같이 Kwak 등(7)은 GM 대두의 CP4 EPSPS에 대한 특이항체를 이용하여 유전자 재조합 여부를 판단하였으나 CP4 EPSPS가 아닌 다른 재조합 유전자가 들어있을 때에는 이를 판단할 수 없는 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서는 GM 두부에서는 나타나지 않는 non-GM 두부의 113kDa 단백질과 선명하고 낮은 분자량을 지닌 24kDa 단백질을 재현성 있는 특이 단백질인 항원으로 선택하여 CP4 EPSPS가 아닌 다른 재조합 유전자가 혼입된 경우에도 두부 내의 non-GM 원료의 사용량을 판단할 수 있도록 하였다.
따라서 본 연구에서는 유전자 재조합 주요 농작물인 대두를 이용한 가공식품 중에 대표적인 제품이라고 할 수 있는 두부를 시료로 하여 ELISA를 통한 혈청검사로 유전자 재조합 여부를 검사하고자 하였으며, GM 대두와 non-GM 대두가 혼입된 경우에 그 혼입비율까지도 측정할 수 있는 가능성을 검토 하고자 하였다.
본 연구에서는 유전자 재조합 되지 않은(non-GM) 대두와 유전자 재조합된(GM) 대두가 혼입되어 제조된 두부에서 효소 면역 측정법을 이용하여 non-GM 대두의 혼입량을 추정하고자 하였다. 두부의 SDS-PAGE 실행 결과 non-GM 두부에서만 나타나는 특이 단백질 non-GM 113 kDa 밴드와 non-GM과 GM 두부에서 모두 나타나는 non-GM 24 kDa 밴드를 선별하고 이들을 토끼에 면역하여 항체생성 여부를 ELISA한 결과 non-GM 113kDa과 non-GM 24kDa 단백질 모두 항체가 형성됨을 확인하였고 10-1-10-6의 단백질 희석배수에서 두부를 이들 항체에 대하여 ELISA함으로써 원료대두의 GM여부를 확인할 수 있었다.
제안 방법
5에 ELISA에 의한 흡광도와 non-GM 단백질 함량의 관계를 나타내는 표준곡선으로 작성하였다. Non-GM 대두:GM 대두의 비율을 100:0-0:100 으로 조절한 시료로 non-GMO와 GMO가 혼입된 두부를 가공하여 10-6-10-7의 희석배수에서 ELISA에 의한 흡광도를 측정하고 이 값을 표준곡선(Fig. 5)에 적용하여 계산된 non-GMO의 양과 실제로 두부 내에 존재하는 non-GMO의 양을 Table 1에나타내었다.
가열온도와 가열시간이 항원에 미치는 영향을 관찰하기위하여 가열온도는 70-100oC, 가열시간은 10-40분으로 하였다. 항체제조를 위한 실험동물로는 토끼 (New Zealand White)를 Essence Medical Inc.
1 M KCl 용액에 5-15분간 침지하여 밴드에 흰색 침전이 생기면 항원밴드(specific band)만을 절취하여 PBS(phosphate-buffered saline) 완충액을 넣어 1 mL의 부피로 정량하여 균질화하였다. 균질화한 항원을 토끼의 등 3-5 부위에 2주 간격으로 3회 피하주사하였다. 마지막 주사 1주일 후, 토끼의 귀 정맥으로부터 200-300 μL 정도의 혈액을 채취하고, 이를 37℃ 배양기에서 1시간 동안 방치하여 혈액응고를 발생시킨 후, 원심분리(5,000 rpm, 10 min)하여 상층액을 취하고 sodium azide 를 0.
그러나 30분 이상의 가열 조건에서 113 kDa 단백질 밴드가 희박해지고 전체적인 밴드들이 붕괴되는 현상을 볼 수 있었다. 그러나 일반적인 두부제조 시의 열처리 시간은 20분 이내이므로 non-GM두부 판별을 위한 ELISA에는 큰 영향을 미치지 않을 것으로 판단되어 80oC에서 20분간 열처리된 non-GM 두부의 113 kDa과 24 kDa 단백질로 항체를 제조하였다.
선명하고 반복성이 확실하며 낮은 분자량을 나타내는 non-GM 두부의 24 kDa 밴드와 GM 두부에서는 전혀 나타나지 않아 non-GM 특이 단백질로 여겨지는 113 kDa 밴드를 항원으로 하여 토끼에 각각 2주 간격으로 3회 같은 양의 항원을 피하주사하여 면역시키고, 마지막 면역 1주일 후 113 kDa을 면역시킨 토끼와 24kDa을 면역시킨 토끼의 귀 정맥에서 각각 채혈한 혈액으로 항혈청을 분리하였다. 이 항혈청을 이용하여 non-GM 두부와 GM 두부를 405nm에서 ELISA에 의해 측정된 흡광도를 Fig.
대상 데이터
항체제조를 위한 실험동물로는 토끼 (New Zealand White)를 Essence Medical Inc.(Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
현재 두부가공용으로 가장 많이 사용되고 있는 non-GM 대두와 GM 대두를 작물시험장(수원)에서 기증받아 현재 생산 · 유통되는 두부와 같은 제조공정을 통하여 두부로 가공하고 동결건조시킨 후, 냉장 보관하면서 시료로 사용하였다. 가열온도와 가열시간이 항원에 미치는 영향을 관찰하기위하여 가열온도는 70-100oC, 가열시간은 10-40분으로 하였다.
이론/모형
각각 시료의 조단백질의 함량은 Micro-kjeldahl법(9)으로 3회반복 측정하여 평균값을 사용하였다. 각각의 시료에서 단백질의 분자량을 조사하고 특이 단백질 밴드를 찾기 위해 Weber 등(10)의 방법에 따라 전기영동하였다.
각각 시료의 조단백질의 함량은 Micro-kjeldahl법(9)으로 3회반복 측정하여 평균값을 사용하였다. 각각의 시료에서 단백질의 분자량을 조사하고 특이 단백질 밴드를 찾기 위해 Weber 등(10)의 방법에 따라 전기영동하였다. 이때 gele 12% poly-acrylamide를 사용하였다.
성능/효과
100% non-GM 대두로 제조한 두부의 경우에 실제로는 8.40 mg/ mL의 non-GM 대두단백질이 존재하는 흡광도를 나타내어야 하나 8.50mg/mL이 존재하는 흡광도를 나타내었고, 60% non-GM 대두와 40% GM 대두가 혼입된 원료로 제조한 두부의 경우에는 실제로는 5.0mg/mL의 non-GM 대두단백질이 존재하는 흡광도를 나타내어야 하나 5.1mg/mL이 존재하는 흡광도를 나타 내었다(Table 1). 7% 이내의 오차를 나타냄으로써, non-GM 대두와 GM 대두가 혼입되어 사용된 경우에도 ELISA를 이용하여 대략적인 혼입비율을 측정할 수 있음을 시사하고 있다.
그러나 non-GM 113 kDa 단백질이 non-GM 24 kDa 단백질보다 높은 흡광도를 보이며 항체 생성의 차이를 나타내었다. GM 두부와 분명하게 차이를 보이는non-GM 두부의 113 kDa 단백질이 낮은 분자량을 지닌 non-GM 두부의 24 kDa 단백질 보다 높은 흡광도를 보였고, non-GM 두부와 GM 두부 간의 차이 또한 113 kDa 단백질이 24 kDa 단백질보다 많은 차이를 보이며 항체 면역의 생성에 차이를 나타내었다.
먼저 solid phase에 결합시키는 항원 즉, non-GM 두부 추출물을 10-1-10-8배로 희석하여 항체와 결합시켰다. 그 결과 113 kDa과 24 kDa 단백질 모두에서 항체와 반응하는 것으로 나타났다. 그러나 non-GM 113 kDa 단백질이 non-GM 24 kDa 단백질보다 높은 흡광도를 보이며 항체 생성의 차이를 나타내었다.
본 연구에서는 유전자 재조합 되지 않은(non-GM) 대두와 유전자 재조합된(GM) 대두가 혼입되어 제조된 두부에서 효소 면역 측정법을 이용하여 non-GM 대두의 혼입량을 추정하고자 하였다. 두부의 SDS-PAGE 실행 결과 non-GM 두부에서만 나타나는 특이 단백질 non-GM 113 kDa 밴드와 non-GM과 GM 두부에서 모두 나타나는 non-GM 24 kDa 밴드를 선별하고 이들을 토끼에 면역하여 항체생성 여부를 ELISA한 결과 non-GM 113kDa과 non-GM 24kDa 단백질 모두 항체가 형성됨을 확인하였고 10-1-10-6의 단백질 희석배수에서 두부를 이들 항체에 대하여 ELISA함으로써 원료대두의 GM여부를 확인할 수 있었다. 이들 중, 보다 감도가 높았던 non-GM 113 kDa 단백질을 10-7-10-6의 배수로 희석하여 ELISA 흡광도와 non-GM 단백질의 관계를 나타내는 표준곡선을 작성하였고, 임의로 non-GM 대두와 GM 대두를 혼합하여 제조한 두부의 ELISA 흡광도를 이 표준곡선과 비교하여 non-GM 원료와 GM 원료 작물의 혼입율을 측정한 결과, 높은 정확도를 보였다.
113 kDa 단백질이 non-GM 두부의 24 kDa 단백질보다 항체와의 결합력이 우수하기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 항체생성 시에 선택할 항원으로서 GM 두부와 분명하게 차이를 보이는 non-GM 두부의 113kDa 밴드를 선택하는 것이 항체의특이성과 친화력을 높여, 항체생성의 성공률을 높이는데 용이하다고 생각된다. 또한 24 kDa 단백질도 113 kDa 단백질보다 낮은 흡광도를 보이기는 하나 GM 두부의 24 kDa 단백질보다는 높은 결합력을 보여주어 non-GM 두부의 24 kDa 단백질에대해서도 항체가 형성되었음을 알 수 있게 하였다.
따라서 항체생성 시에 선택할 항원으로서 GM 두부와 분명하게 차이를 보이는 non-GM 두부의 113kDa 밴드를 선택하는 것이 항체의특이성과 친화력을 높여, 항체생성의 성공률을 높이는데 용이하다고 생각된다. 또한 24 kDa 단백질도 113 kDa 단백질보다 낮은 흡광도를 보이기는 하나 GM 두부의 24 kDa 단백질보다는 높은 결합력을 보여주어 non-GM 두부의 24 kDa 단백질에대해서도 항체가 형성되었음을 알 수 있게 하였다. 이와 같이, GM 단백질에서도 나타났으므로 특이 단백질이 아닌 것으로 판단되었던 non-GM 두부의 24 kDa 단백질도 면역된 것은 선명한 non-GM 두부의 24 kDa 밴드가 laige peptide 면역원이 되어항체와의 친화력을 높인 것으로 생각된다.
본 실험의 non-GM 두부와 GM 두부에서 조단백질 함량은 각각 10.0% 및 8.8%인 것으로 분석되어 GM 두부보다 non-GM두부에서 조단백질 함량이 다소 높은 것으로 나타났다.원료 대두와 가공된 두부의 전기영동 패턴 변화는 Fig.
위의 결과를 토대로 하여 현재 판매되고 있는 시판 두부의 유전자 재조합 여부를 측정해본 결과, 일반 재래시장에서 판매되는 판두부의 경우 non-GM 대두단백질을 28% 정도 함유한 것으로 측정되었고, 100% 국산대두만을 사용하고 있다고 선전하고 있는 기업체 두부의 경우에는 80% 정도 non-GM 대두단백질을 함유하고 있는 것으로 나타나 non-GM 대두단백질의 함량이 비교적 높았다. 그러나 같은 기업체의 두부라 할지라도 non-GM 대두의 함량에 차이를 보여 농장에서 원료대두를 수집하는 단계에서부터 철저한 관리가 필요하며 두부판매 시에는 유전자재조합 여부를 분명하게 표시해야 할 필요가 있는 것으로 생각된다.
두부의 SDS-PAGE 실행 결과 non-GM 두부에서만 나타나는 특이 단백질 non-GM 113 kDa 밴드와 non-GM과 GM 두부에서 모두 나타나는 non-GM 24 kDa 밴드를 선별하고 이들을 토끼에 면역하여 항체생성 여부를 ELISA한 결과 non-GM 113kDa과 non-GM 24kDa 단백질 모두 항체가 형성됨을 확인하였고 10-1-10-6의 단백질 희석배수에서 두부를 이들 항체에 대하여 ELISA함으로써 원료대두의 GM여부를 확인할 수 있었다. 이들 중, 보다 감도가 높았던 non-GM 113 kDa 단백질을 10-7-10-6의 배수로 희석하여 ELISA 흡광도와 non-GM 단백질의 관계를 나타내는 표준곡선을 작성하였고, 임의로 non-GM 대두와 GM 대두를 혼합하여 제조한 두부의 ELISA 흡광도를 이 표준곡선과 비교하여 non-GM 원료와 GM 원료 작물의 혼입율을 측정한 결과, 높은 정확도를 보였다.
1과 같다. 전반적으로 대두에서 나타나는 단백질 밴드가 두부보다 선명하고 더 많았으며, 이에 비해 두부의 밴드 수가 적은 경향을 보였다. 이는 두유가공 시 열처리에 의해 생성된 불용성 단백질이 비지와 함께 제거되고, 간수를 첨가하여 두부를 응고시킬 때 수용성 단백질들이 일부 제거되었기 때문인 것으로 생각된다.
후속연구
7% 이내의 오차를 나타냄으로써, non-GM 대두와 GM 대두가 혼입되어 사용된 경우에도 ELISA를 이용하여 대략적인 혼입비율을 측정할 수 있음을 시사하고 있다. 그러므로 ELISA법과 표준곡선을 이용하여 실제 유통되는 두부의 GMO 및 non-GMO 혼입비율을 측정하는 것도 가능하리라 생각한다.
본 연구에서 GM 가공식품과 non-GM 가공식품의 단백질 함량은 큰 차이를 보이지는 않았으나, SDS-PAGE를 이용한 분석 에서는 분명한 특이 밴드를 보였으므로 SDS-PAGE의 실행만으 로 GMO와 non-GMO를 판별할 수도 있을 것이다. 그러나 이러한 SDS-PAGE의 실행만으로는 가공식품에 있어서 GMO와 non-GMO 혼입비율의 판정이 불가능하여 GMO분석을 명확히 하기엔 제한이 있다고 여겨진다.
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