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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라에서 허용된 9종과 외국에서는 사용이 허용되어 있으나 우리나라에서는 허용되지 있지 않은 색소 및 수입식품중 검출사례가 있는 불허용색소 10종 등 총 19종의 타르색소를 대상으로 하여 식품 중의 시료전처리방법을 검토하여 확립하고 이온 쌍 시약을 이용한 고속액체크로마토그래피 방법(13, 14)을 이용하여 다양한 식품의 색소에 대한 재현성과 회수율 등을 확인함으로써 식품 중 타르색소의 함량을 효율적이고 신속하게 분석하고자 하였다. 또한 이를 토대로 우리나라에서 유통되고 있는 식용타르색소 표시사항과의 일치 여부도 조사하였다.
- 본 연구는 식품공전에 수록된 식품 중 타르색소의 분석방법을 개선, 보완하여 식품 검사기관에서 정확하고 원활한 검사를수행할 수 있도록 기여하며 동시에 식이를 통한 식용 타르색소의 섭취량 조사, 위해도 평가 및 사용량 규제시 공정시험법의활용, 통상문제를 대비한 과학적 근거를 확보하는데 활용하고자 수행되었다. 우리나라에서 식품에 사용이 허용된 타르색소 9종과 불허용 타르색소 10종 등 총 19종에 대한 이온쌍 고속액체 크로마토그라피를 적용하여 분석하였다.
- 관한 연구를 수행한 바 있다. 본 연구에서는 우리나라에서 허용된 9종과 외국에서는 사용이 허용되어 있으나 우리나라에서는 허용되지 있지 않은 색소 및 수입식품중 검출사례가 있는 불허용색소 10종 등 총 19종의 타르색소를 대상으로 하여 식품 중의 시료전처리방법을 검토하여 확립하고 이온 쌍 시약을 이용한 고속액체크로마토그래피 방법(13, 14)을 이용하여 다양한 식품의 색소에 대한 재현성과 회수율 등을 확인함으로써 식품 중 타르색소의 함량을 효율적이고 신속하게 분석하고자 하였다. 또한 이를 토대로 우리나라에서 유통되고 있는 식용타르색소 표시사항과의 일치 여부도 조사하였다.
가설 설정
- 2)PBV and QY are the products of Warner Jenkinson in Great Britain.
제안 방법
- 회수율을 조사하였다. 각 시료에 혼합색소 표준용액을 첨가하여 시료 중 함량이 10 μg이 되도록 한 후 시료별 전처리 방법을 이용하여 각 모델식품으로부터 색소를 추출한 다음Sep-Pak C18 카트리지를 통과시켜 정제하였다. 용출액은 물 2 mL를 가한 다음 증발 농축하고 0.
- 건과류는 지방 함량이 높아서 물로 색소를 추출하기가 어렵고 시료에 재흡착이 일어날 수 있으므로(16) 추출용매를 달리하고 pH를 변화시켜서 추출조건을 검토하였다. 암모니아수와 수산화나트륨을 사용하여 pH를 알칼리성으로 조정하였고, 관련 문헌을 참고로 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 등을 물과 혼합하여 추출용매로 사용하였다(16-23).
- 청량음료와 사탕, 젤리류는 물에 희석하거나 용해시킨 후 pH를 5-6으로 조정하여 사용하였고 츄잉껌과 아이스크림류는 물과 혼합한 후 고형물을 제거하고 pH 를 5-6으로 조정하였으나 아이스크림과 건과류의 경우 키산틴계 색소가 함유된 시료는 pH를 11-12로 조정하였을 때 효율적으로 추출할 수 있었다. 건과류는 헥산 또는 석유에테르로 지방질 성분을 용해하여 제거한 다음 추출하였다. 식품 종류별로모델 식품에 첨가한 19종 타르색소의 회수율은 청량음료 90.
- 우리나라에서 식품에 사용이 허용된 타르색소 9종과 불허용 타르색소 10종 등 총 19종에 대한 이온쌍 고속액체 크로마토그라피를 적용하여 분석하였다. 시중에서 유통 중인 청량음료, 사탕, 젤리, 츄잉껌, 아이스크림 및 건과류 등 6 종 120품목을 대상으로 각 식품별 식용타르색소의 추출조건과 회수율의 최적조건을 확립하였으며, 이를 토대로 식품 중 타르색소의 함량을 조사하였다. 청량음료와 사탕, 젤리류는 물에 희석하거나 용해시킨 후 pH를 5-6으로 조정하여 사용하였고 츄잉껌과 아이스크림류는 물과 혼합한 후 고형물을 제거하고 pH 를 5-6으로 조정하였으나 아이스크림과 건과류의 경우 키산틴계 색소가 함유된 시료는 pH를 11-12로 조정하였을 때 효율적으로 추출할 수 있었다.
- 시판되고 있는 청량음료, 사탕, 츄잉껌, 건과류, 아이스크림, 젤리 중 색소를 함유하지 않는 것을 모델식품으로 선택하여 각색소의 회수율을 조사하였다. 각 시료에 혼합색소 표준용액을 첨가하여 시료 중 함량이 10 μg이 되도록 한 후 시료별 전처리 방법을 이용하여 각 모델식품으로부터 색소를 추출한 다음Sep-Pak C18 카트리지를 통과시켜 정제하였다.
- 식용타르색소를 함유하지 않은 청량음료, 캔디, 츄잉껌, 건과류, 아이스크림, 젤리 등 6종의 분석대상시료에 대해 각각 10 μg/g이 되도록 색소혼합액을 첨가한 후 회수율을 3회 반복 측정하였다. Table 3과 같이 회수율은 청량음료 90.
- 추출 후 원심분리하여 고형물을 제거하고 pH를 5-6으로 조정하여 Sep-Pak C18으로 정제하였다 (15). 식품으로부터 색소를 추출할때에 추출효율을 높이기 위하여 추출온도나 추출용매, 균질화 처리, 초음파 처리 등 여러 가지 방법들 중 가장 추출율이 높은 방법을 선택하였다.
- 각 시료에 혼합색소 표준용액을 첨가하여 시료 중 함량이 10 μg이 되도록 한 후 시료별 전처리 방법을 이용하여 각 모델식품으로부터 색소를 추출한 다음Sep-Pak C18 카트리지를 통과시켜 정제하였다. 용출액은 물 2 mL를 가한 다음 증발 농축하고 0.5% 암모니아수 1 mL로 수기를 세척하고 물을 가하여 정확히 10mL로 한 후 HPLC를 사용하여 정량분석을 실시하고 회수율을 3회 반복 측정하였다.
- 수행되었다. 우리나라에서 식품에 사용이 허용된 타르색소 9종과 불허용 타르색소 10종 등 총 19종에 대한 이온쌍 고속액체 크로마토그라피를 적용하여 분석하였다. 시중에서 유통 중인 청량음료, 사탕, 젤리, 츄잉껌, 아이스크림 및 건과류 등 6 종 120품목을 대상으로 각 식품별 식용타르색소의 추출조건과 회수율의 최적조건을 확립하였으며, 이를 토대로 식품 중 타르색소의 함량을 조사하였다.
- , USA)을 사용하였다. 이동상으로는 0.01 M TBA-Br을 함유한 0.025 M ammonium acetate와 acetonitrile, methan이을 65 : 25 : 10과 40 : 50 : 10으로 혼합한 두 가지 조성의 용매를 사용하여 gradient mode로 분석하였다. 이동상의 유속을 1.
- 적색계통(R2, R3, R40, R102, R104, R105, R106, Azo, R2G)과 황색계통(Y4, Y5, ORII, QY), 청색 녹색계통(B1, B2, G3, GS, PBV, BBN) 색소들 및 혼합색소 표준용액의 100 ppm용액을 만든 후 이를 희석하여 0-50 μg/mL의 농도 범위에서 검량선을 구하였다.
- 청량음료와 사탕, 젤리, 츄잉껌의 색소는 증류수로 추출하였고, 아이스크림과 건과류는 헥산 또는 석유에테르를 사용하여지방을 제거한 다음 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 암모니아수, NaOH 용액 등을 사용하여 추출효율을 비교하였다. 추출 후 원심분리하여 고형물을 제거하고 pH를 5-6으로 조정하여 Sep-Pak C18으로 정제하였다 (15).
- 청량음료와 사탕, 젤리류는 시료 약 5-10 μg을 취하여 물로 색소를 추출하였으며 이 때 물에 잘 녹는 시료의 경우에는 실온에서, 물에 잘 녹지 않는 시료는 50-60℃ 수욕상에서 10-30분간 가온하며 교반, 용해시키거나 균질화 또는 초음파 처리하였다. 사탕과 젤리류는 잘게 부수어서 평량하였고 시료가 알코올을 함유한 경우에는 증발농축하여 알코올을 제거하였다.
- 원심분리(3,500 rpm, 15 min)하여 상징액을 취하고 물에 불완전하게 용해되는 경우는 침전물에 50-80% 에탄올을 가하고 교반하며 2-3시간 동안 실온에서 추출하였으며, 에탄올로도추출이 불완전한 경우는 1 N 염산 10mL를 사용하여 추출하였다. 츄잉껌은 시료를 약 5-10g 취하여 청량음료나 사탕, 젤리류와 동일하게 추출하되 물 또는 1% 암모니아수로 추출하였다. 아이스크림류는 시료 약 5-10g을 취하여 균질화한 후 물로색소를 추출하였다.
대상 데이터
- Methanol 과 acetonitrile 은 Merck 사 (Darmstadt, Germany) 의 HPLC 급을, tetrabutylammonium bromide(TBA-Br)는 JunseiChemical사(Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였고, 그 외 시약은 Wakog(Osaka, Japan)의 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용한 색소들은 TCI사(Tokyo, Japan)의 제품으로 Table 1에 정리하였다.
- 또한 시료의 지방제거를 위해 클로로포름, 디에틸에테르, 석유에테르 및 헥산을 사용한 결과 클로로포름은 비중이 높아 시료가 상층의 물층에 존재하여 용매의 제거가 곤란하였으며, HPLC에 주입시 분리현상을 일으키기 때문에(25) 완전 건조 후 시료를 메탄올에 재용해시켜야 하는 등의 과정이 추가적으로 발생하였다. 디에틸에테르는 R3가 용매층으로 소량 이행되는 문제가 있어서, 지방제거가 양호하고 색소의 이행이 없는 석유에테르와 헥산 중에서 이용편리성면을 고려해 헥산을 선택하여 본 실험에 사용하였다. 따라서 시료 5-10 g을 취하고 균질화한 후 지방을 함유한 시료는 50 mL 헥산으로 2-3회 추출하여 지방을 제거한 다음 물과 메탄올의 30 : 70 혼합액을 가하여 실온에서 2-3시간 또는 수욕상에서 10-30분간 가온하며 추출하였다.
- 우리나라에서는 식품첨가물공전 중 식용타르색소의 사용기준에서 사용량 규제를 하고 있지는 않으나 EU(유럽연합)의 사용량기준에 따르면 Y4와 Y5는 비알콜착향료음료와 과자류, 빙과류에 각각 100, 300, 150mg/kg으로 최대허용량을 설정하였고 Codex(국제식품규격위원회)에서는 젤리에 200 mg/kg, 빙과류 및 아이스믹스에 100mg/kg으로 최대허용량을 설정하고 있다(28). 본 실험에서 분석한 시료 중 젤리 시료의 한품목이 Y4가 270.21 μg/g으로 Codex의 기준과 비교할 때 최대허용량을 조금 초과하여 사용하였다. 적색계통의 색소들 중에서는 R2, R40 및 R3가 검출되었고 특히 R2와 R40은 6종류의 식품 모두에서 검출되었다.
- 분석에 사용한 HPLC는 Waters사(Milford, MA., USA)의 M510 solvent delivery system 과 717 autosampler, 486 UVdetected 구성된 것으로서 분리용 컬럼은 Symmetry C18(3.9 mm i.d.×150 mm, 5 ㎛, Waters, Milford, MA., USA)을 사용하였다. 이동상으로는 0.
- 시중에서 유통되고 있는 제품 중 청량음료, 사탕, 젤리, 츄잉껌, 아이스크림, 건과류 등 총 6종 120품목을 선정하여 분석대상으로 하였다.
- 시중에서 유통되고 있는 제품 중 청량음료, 사탕, 젤리, 츄잉껌, 아이스크림, 건과류의 총 6종 120품목을 분석 대상식품으로 본 실험에서 최적화되어 설정된 전처리 및 분석방법을 적용하여 계통별 또는 동시분석에 의해 색소의 함유량을 구한 결과는 Table 4-6과 같다. 우리나라에서 허용되지 않는 색소는 검출되지 않았고 대상제품의 표시사항과는 모두 일치하는 것으로 나타났다.
- Japan)의 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용한 색소들은 TCI사(Tokyo, Japan)의 제품으로 Table 1에 정리하였다. 정제용 카트리지는 Sep-Pak C18(Wters, Milford, MA.
- 암모니아수와 수산화나트륨을 사용하여 pH를 알칼리성으로 조정하였고, 관련 문헌을 참고로 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 등을 물과 혼합하여 추출용매로 사용하였다(16-23). 수산화나트륨으로 pH를 조정했을 시 정제 후 일부색소가 변색되고 덩어리가 생기는 현상이 발생하여 알칼리 시약으로는 암모니아수를 선택하였다.
- 실험에 사용한 색소들은 TCI사(Tokyo, Japan)의 제품으로 Table 1에 정리하였다. 정제용 카트리지는 Sep-Pak C18(Wters, Milford, MA., USA)을 메탄올 10mL 및 0.1% TBA-Br 수용액 10mL를 사용하여 차례로 세정시킨 것을 사용하였다.
성능/효과
- 적색계통 색소들에 대한 Codex의 사용량 기준에 따르면 R2와 R3는 젤리에는 200 mg/kg, 빙과류 및 아이스믹스에는 R2가 50, R3가 100mg/kg으로 최대허용량을 규정하고 있다 또한 EU에서는 R40의 경우 비알콜성착향음류에 100, 과자류에 300, 빙과류에 150, 스낵에 200 mg/kg으로 최대허용량을 설정해 놓고 있다(28). 6종류의 식품들 중 이들 EU 또는 CODEX의 기준을 초과하여 사용한 경우를 살펴보면 R40은 사탕에서 두개의 시료가 각각 143.92, 301.16 mg/kg으로 초과하였고 건과류에서도 한개의 시료가 357.85 mgkg으로 EU의 최대 허용량보다 조금 높았다. 또한 R2는 젤리시료 중 한개와 아이스크림 시료 중 한개가 Codex의 최대허용량에 근접한 사용량을 보였다.
- 1). 동일 농도에서의 검출기에 대한 반응은 적색 색소의 경우 R3와 R106이 다른 색소적색계통 색소들에 비하여 높았고, 황색색소의 경우는 Y4, QY, ORII, Y5의 순서로, 청색 및 녹색 색소의 경우는 G3가 가장 높았고, BBN이 가장 낮았다. 또한 계통별 식용색소의 검출한계는 적색계통의 0.
- 특히 키산틴계 색소인 R3는 단백질에 흡착되어 완전히 용출되지 않고, 산성조건하에서는 광선의 영향이 크다고 보고되었다 (24, 26). 또한 B2의 경우는 실온에서 암모니아 수용액에 30분간 방치했을 때 85%가 남아있고 100℃에서 5분 만에 거의 분해되는 등 (27) 다른 색소에 비해 안정성이 떨어지므로 분석과정 중 온도나 pH 조절에 유의해서 본 실험에서는 전처리하여 바로 분석한 경우 높은 회수율을 얻을 수 있었다.
- 색소표준용액을 0, 2, 5, 10, 20 및 50 μg/mL의 농도로 조제하고 그 20 μL를 HPLC에 주입하여 얻은 크로마토그램에서 검량선을 작성했을 때 모두 양호한 직선성(r = 0.9999)을 나타내었다(Fig. 1). 동일 농도에서의 검출기에 대한 반응은 적색 색소의 경우 R3와 R106이 다른 색소적색계통 색소들에 비하여 높았고, 황색색소의 경우는 Y4, QY, ORII, Y5의 순서로, 청색 및 녹색 색소의 경우는 G3가 가장 높았고, BBN이 가장 낮았다.
- 9%로 가장 높았고, 그 외 식품에서는 모두 80%이상이었다. 시중에서 유통되고 있는 국내 및 수입식품 중 색소의 함량을 정량 한 결과, 식품별 색소의 평균 농도범위는 각각 청량음료0.78-27.94 mg/kg, 사탕 0.94-53.94 mg/kg, 젤리 0.86-42.44 mg/ kg, 츄잉껌 0.15-22.15 mg/kg, 아이스크림 0.12-39.17 mg/kg, 건과류 7.22-135.04mg/kg의 범위이었고 검출된 색소는 표시사항과일치하였다.
- Table 4-6과 같다. 우리나라에서 허용되지 않는 색소는 검출되지 않았고 대상제품의 표시사항과는 모두 일치하는 것으로 나타났다. 황색계통의 색소들 중 검출된 것은 Y5와 Y4 두 종류이었고 Y4는 젤리와 건과류, 그리고 사탕에서 많이 검출되었으며, Y5는 사탕과 건과류에서 많이 검출되었다(Table 4).
- 시중에서 유통 중인 청량음료, 사탕, 젤리, 츄잉껌, 아이스크림 및 건과류 등 6 종 120품목을 대상으로 각 식품별 식용타르색소의 추출조건과 회수율의 최적조건을 확립하였으며, 이를 토대로 식품 중 타르색소의 함량을 조사하였다. 청량음료와 사탕, 젤리류는 물에 희석하거나 용해시킨 후 pH를 5-6으로 조정하여 사용하였고 츄잉껌과 아이스크림류는 물과 혼합한 후 고형물을 제거하고 pH 를 5-6으로 조정하였으나 아이스크림과 건과류의 경우 키산틴계 색소가 함유된 시료는 pH를 11-12로 조정하였을 때 효율적으로 추출할 수 있었다. 건과류는 헥산 또는 석유에테르로 지방질 성분을 용해하여 제거한 다음 추출하였다.
- R3는 이들 기준을 초과한 시료는 하나도 없었고 검출된 세가지 적색계통색소들 중 R40이 6가지 식품 종류 전체에서 가장 사용빈도와 사용량이 많았다. 청색 및 녹색 계통의 색소들 중에서 B1 은 모두 검출되었고 B2는 건과류를 제외한 모든 식품에서, G3는 청량음료와 사탕, 아이스크림에서만 검출되었다 (Table 6). B1 의 경우 특히 과자와 사탕에 많이 사용되었다.
- 우리나라에서 허용되지 않는 색소는 검출되지 않았고 대상제품의 표시사항과는 모두 일치하는 것으로 나타났다. 황색계통의 색소들 중 검출된 것은 Y5와 Y4 두 종류이었고 Y4는 젤리와 건과류, 그리고 사탕에서 많이 검출되었으며, Y5는 사탕과 건과류에서 많이 검출되었다(Table 4).우리나라에서는 식품첨가물공전 중 식용타르색소의 사용기준에서 사용량 규제를 하고 있지는 않으나 EU(유럽연합)의 사용량기준에 따르면 Y4와 Y5는 비알콜착향료음료와 과자류, 빙과류에 각각 100, 300, 150mg/kg으로 최대허용량을 설정하였고 Codex(국제식품규격위원회)에서는 젤리에 200 mg/kg, 빙과류 및 아이스믹스에 100mg/kg으로 최대허용량을 설정하고 있다(28).
후속연구
- 현재 우리나라 식품첨가물공전 중 식용색소의 사용기준은 대상식품만 정해져 있고 허용량은 규제하고 있지는 않으나 일일허용섭취량(ADI: acceptable daily intake)이 설정되어 있고,Codex, EU 등에서는 대상식품과 함께 최대허용량을 규제하고 있으므로 차후 식품첨가물공전도 국제화 추세를 반영할 것으로 생각되며 이에 본 연구 결과가 적절히 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
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