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문제 정의
- 따라서 이 연구에서는 국내 양돈장에서 PMWS 임상증상을 보이는 돼지로부터 PCV2를 분리동정하여 국내 분리주를 확보함과 동시에 PMWS 발병에 관여하는 것으로 알려져 있는 PPV 및 PRRSV의 복합감염실태를 조사하여 PMWS의 발병요인을 구명하고자 하였다.
제안 방법
- 3%) grid에 점적한 다음 30초간 정치하였다. Grid에서 과도한 용액을 제거하고 공기건조시킨 후 PBS(pH 7.4)로 희석한 0.5% phosphotungstic acid 용액으로 염색한 다음, 투과전자현미경 (H-7100FA, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다.
- Multiplex PCR로 PCV1 및 PCV2를 감별진단하기 위하여 두 바이러스 간 유전자염기서열의 상동성이 낮은 ORF2 유전자 부위로부터 각 바이러스 유전자를 특이적으로 증폭할 수 primer pair 2종을 선발, 제작하였다 (Table 1) . 제작된 primer의 특이성을 확인하기 위하여 PCV1의 오염 이 확인된 PK-15 cell과 PCVfee nPK-15 cell 및 PMWS 감염자돈의 장기시료를 대상으로 multiplex PCR을 실시한 결과, 의도한 바와 같이 각각의 primer에 의해 PCV1(403bp) 및 PCV2(501bp)의 유전자가 특이적으로 증폭됨이 확인되었다 (Fig.
- PCR 검사결과, PCV2의 단독감염이 확인된 시료를 바이러스 분리에 공시하였다. 시료의 전처리 및 분리과정은 이전 연구자들의 방법을 준용하였다 [4, 29, 40].
- PCR 반응이 완료된 후, 각 반응액 10 μ1를 취하여 1.5% agarose gel 전기영동을 실시한 다음, ethidium bromide 용액 (0.5 ㎍/ml in DW)으로 염색하여 자외선 하에서 특이 band 유무를 관찰하였다 [34].
- PCR을 위한 DNA 또는 RNA 추출은 glass fiber filtered column(AccuPrep genomic DNA Extraction kit 및 Tissue RNA premate reagent(Bioneer, Korea)을 이용하여 조직유제액에서 DNA 및 RNA를 추출하였다.
- PCV2 를 분리하기 위한 배양세포는 PCR로 PCV가 오염되지 않은 것으로 확인된 돼지 신장세포주(nPK-15 cell)를 선발하여 사용하였으며, 세포배양배지는 a- minimum essential medium(α-MEM, Gibco BRL, USA)에 배지 1mℓ 당 penicillin 100IU, streptomycin 100 μg 및 lactalbumin hydrolysate를 0.25% 되게 첨가한 다음, 56℃ 에서 30분간 비동화한 우태아혈청(fetal calf serum, FCS, Moregate, USA)을 10% 첨가하여 사용하였다. 간접형광항체 법 (indirect immunofluorescence assay, IFA)를 위한 양성혈청은 PCR로 PCV1 음성 및 PCV2 양성으로 확인된 PMWS 이환돈의 혈청을 대상으로, PRRSV 및 PPV에 대한 항체가 없는 것을 확인한 다음, -20℃ 에 보관하며 실험에 사용하였다.
- PCV1 및 2가 검출되지 않은 나머지 3점의 시료에 대한 병성감정결과, 각각 부종병, 호홉기복합감염증 및 살모넬라감염증으로 확인되었다. PCV2가 확인된 시료에 대한 PPV 및 PRRSV의 복합감염 여부를 조사하기 위하여 PPV 및 PRRSV 특이 primer(Table 1)를 이용하여 PCR 및 RT-PCR을 실시한 후 그 결과를 확인하였다 (Fig. 2). PCV2 양성인 57점의 시료 중 PPV 1점 및 PRRSV 27점 (47.
- PCV를 검출하기 위한 primer는 기존 연구자들[13, 28]이 발표한 PCV1과 PCV2의 유전자염기서열(GenBank accession number AF027217 및 U49186을 참조하여 두 바이러스간에 일치율이 낮은 ORF2 부위로부터 각각의 바이러스에 특이적으로 반응하는 primer pair 2종을 제작하였고, 이를 이용하여 multiplex PCR을 실시하였다. PPV의 경우, PPV의 VP2 유전자 염기서열로부터 제작되어 그 특이성이 확인된 PPVP2F2/R1 primer pair를 PCR 에 이용하였고 [33], PRRSV는 ORF6 부위에서 제작되어 그 특이성이 확인된 PORF6F1/R1 primer pair를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다 [24].
- PMWS 증상을 보이는 돼지의 병변조직에서 PCY PRRSV 및 PPV의 유전자를 검출하기 위하여 각각의 특이 primer를 제작하여 (Table 1) PCR 및 RT-PCR을 실시하였다. PCV를 검출하기 위한 primer는 기존 연구자들[13, 28]이 발표한 PCV1과 PCV2의 유전자염기서열(GenBank accession number AF027217 및 U49186을 참조하여 두 바이러스간에 일치율이 낮은 ORF2 부위로부터 각각의 바이러스에 특이적으로 반응하는 primer pair 2종을 제작하였고, 이를 이용하여 multiplex PCR을 실시하였다.
- 72℃ 에서 10분 반응시켰다. PPV는 PCV와 동일한 방법으로 추출한 DNA시료와 primer를 PCR premix에 첨가하여 94℃에서 5분 반응시켰고, 94℃에 30초, 53℃에 30초 및 72℃에 50초씩 30회 반복 반응시킨 다음, 최종 72℃에서 10분 반응시켰다. PRRSV의 경우, 추출한 RNA 시료와 primer를 RT-PCR mixture(OneStep RT-PCR kit, Qiagen, USA)에 첨가하여 57℃에서 10분 처리시킨 다음, cDNA의 합성을 위하여 42℃에서 60분 반응시켰다.
- 각 바이러스별 PCR 반응은 PCV의 경우 병변조직으로부터 추출한 DNA 10㎕와 각 primer 1 ㎕(100 pmol)를 PCR premix(AccuPower PCR Premix, Bioneer, Korea)에 첨가하고 94℃ 에서 5 분 반응시켰고, 94℃ 에 1분, 55℃에 1분 및 72℃에 2분씩 30회 반복 반응시킨 다음, 최종 72℃ 에서 10분 반응시켰다. PPV는 PCV와 동일한 방법으로 추출한 DNA시료와 primer를 PCR premix에 첨가하여 94℃에서 5분 반응시켰고, 94℃에 30초, 53℃에 30초 및 72℃에 50초씩 30회 반복 반응시킨 다음, 최종 72℃에서 10분 반응시켰다.
- 4)으로 2회 세척한 다음, 300 mM D-glucosamine 이 함유된 α-MEM을 세포단층이 적셔지도록 첨가하여 37℃에서 30분간 처리하였고, 처리 즉시 PBS로 세척한 다음, 10% FCS 함유 α- MEM 배지를 첨가한 후 2일 간 배양하였다. 동일한 방법으로 5대 맹목계대한 다음, IFA로 감염세포를 확인하고 PCR과 전자현미경으로 바이러스를 최종 확인하였다.
- 고정 세포에 PBS로 10배 희석한 양성혈청을 첨가하여 37℃ 의 습상에서 1시간 동안 반응시킨 다음, PBS로 200 배 희석한 형광표지 2차항체 (FITC-corjugated goat antiswine IgG, Cappel, USA)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBS로 3회 세척하고 용액을 완전히 제거한 다음, 형광현미경하에서 특이 형광세포의 존재를 확인하였다.
- 세포단층이 50% 정도 형성된 nPK-15 cell에 위의 접종액 2 ml를 접종하고 37℃에서 90분간 흡착시킨 다음, 10% FCS 함유 α-MEM 20 ml를 첨가하여 37℃에서 18시간 배양하였다. 인산완충액 (phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4)으로 2회 세척한 다음, 300 mM D-glucosamine 이 함유된 α-MEM을 세포단층이 적셔지도록 첨가하여 37℃에서 30분간 처리하였고, 처리 즉시 PBS로 세척한 다음, 10% FCS 함유 α- MEM 배지를 첨가한 후 2일 간 배양하였다. 동일한 방법으로 5대 맹목계대한 다음, IFA로 감염세포를 확인하고 PCR과 전자현미경으로 바이러스를 최종 확인하였다.
- 시료의 전처리 및 분리과정은 이전 연구자들의 방법을 준용하였다 [4, 29, 40]. 폐 및 림프절 조직에 항생제 함유 α-MEM(Gibco BRL, USA)을 첨가하여 유제하고, 유제액을 초음파 파쇄기로 20 kHz에서 4초 처리한 다음, 저속원심분리(2,000×g, 10분)하여 얻어진 상층액을 다시 고속원심분리 (8, 000×g, 4℃, 20분)하여 상층액을 회수하였다. 이 상층액에 동량의 프레온을 첨가하여 1분 교반한 다음, 원심분리 (3, 000×g, 15분)하여 얻어진 상층액을 다시 원심분리(10, 000×g, 3분)한 후에 0.
- 배양 플라스크로부터 회수한 감염세포를 원심분리 (2,000×g, 10분)하여 수거한 다음, 최초용량 대비 1/5 용량의 증류수에 현탁하였다. 현탁액을 4초간 초음파 파쇄한 후 동량의 프레온을 첨가하여 추출하고, 원심분리(15, 000×g, 10분)하여 상층액 100㎕를 취해 50㎕의 10%(w/v) sucrose cushion에 올려 초원심분리(90, 700×g, 11분)하였다. 회수된 최종 펠렛을 1방울(약 50 ㎕)의 증류수에 현탁하여 carbon-coated formvar(0.
대상 데이터
- 1999년 10월부터 2002년 5월까지 국내 60개 양돈장으로부터 이유자돈의 전신소모성증후군 (PMWS) 증상을 나타내는 돼지의 장기시료 60점을 수집하였다. 이들 병변조직에 대하여 porcine circovirus 1(PCV1), PCV2, porcine parvovirus(PPV) 및 porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) 에 대한 PCR 검사 결과, 57점에서 PCV2가 확인되었으며, PCV1은 전혀 검출되지 않았다.
- PMWS 병인체 분리 및 검색을 위하여 국립수의과학검역원에서 1999년 10월부터 2002년 6월까지 국내 60개 양돈장에서 위축과 폐사 등 PMWS의 특이 임상증상을 보이는 이유자돈 60두의 림프절과 폐장을 채취하였고, -70℃에 보관하면서 PCV2 분리 및 PMWS에 관여하는 것으로 알려진 PCY PPV 및 PRRSV 진단을 위한 PCR 검사재료로 공시하였다.
이론/모형
- 감염세포에서 바이러스 항원을 확인하기 위한 IFA는 Morozov 등 [29]의 방법을 준용하였다. nPK-15 cell에 5대 맹목계대한 바이러스 감염세포를 12-well 조직배양 플레이트에 옮겨 24시간 배양한 다음, PBS로 세척하고 냉장 메탄올을 첨가하여 10분 동안 세포를 고정하였다.
- 배양세포에 감염된 바이러스를 확인하기 위한 전자현미경 관찰은 Onuki 등 [31]와 Ellis 등 [10]의 방법을 준용하였다. 배양 플라스크로부터 회수한 감염세포를 원심분리 (2,000×g, 10분)하여 수거한 다음, 최초용량 대비 1/5 용량의 증류수에 현탁하였다.
성능/효과
- 7개의 감염세포에서 PCV2의 감염을 확인하기 위하여 돼지 양성혈청을 이용하여 IFA를 실시한 결과, 주로 감염세포의 핵 및 세포질에서 특이 형광을 관찰할 수 있었으며(Fig. 3), 이는 Morozov 등 [29]이 감염세포에 대하여 검사한 결과와 일치하는 양상을 나타내었다 [27, 29]. 또한 감염세포로부터 정제한 PCV2 를 투과전자현미경으로 관찰한 결과, Mankertz 등 [26] 과 Stevenson 등 [36]이 보고한 바와 동일한 직경 17nm인 원형의 PCV 바이러스 입자가 확인되었으며(Fig.
- PCR 검사를 통하여 PCV2 단독감염이 확인된 시료 29점을 공시하여 PCV2 분리동정을 실시한 결과, 7개 시료 접종세포가 5대까지 양호하게 배양되었다(Table 3)최종 5대 계대배양 후 감염세포를 수거하여 PCR 검사를 실시한 결과, 7개 세포에서 모두 PCV2가 확인되었으며, 동 감염세포를 12-well 조직배양 plate에 배양, 고정하여 IFA를 실시한 결과에서도 7개 감염세포에서 모두 PCV2 특이항원을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 또한 감염세포에서 바이러스를 정제하여 전자현미경으로 관찰한 결과, 직경 17 nm 정도의 원형의 PCV 바이러스 입자가 확인되었다 (Fig.
- . PCV1 및 2가 검출되지 않은 나머지 3점의 시료에 대한 병성감정결과, 각각 부종병, 호홉기복합감염증 및 살모넬라감염증으로 확인되었다. PCV2가 확인된 시료에 대한 PPV 및 PRRSV의 복합감염 여부를 조사하기 위하여 PPV 및 PRRSV 특이 primer(Table 1)를 이용하여 PCR 및 RT-PCR을 실시한 후 그 결과를 확인하였다 (Fig.
- PCV2 단독감염이 확인된 29개 시료를 공시하여 바이러스 분리동정을 실시한 결과, 7개의 시료에서 PCV2가 분리되어 분리율은 매우 저조하였다. 이는 PCV 배양 시에 세포에 감염되는 바이러스의 양을 증가시키기 위해 처리하는 D-glucosamine-HCl 용액이 배양세포에 독성을 가지기 때문에 세심한 주의가 필요하다고 한 Tischer 등 [40] 의 보고로 보아 분리율의 저조는 배양세포에 대한 glucosamine 처리에 따른 세포독성의 영향 때문인 것으로 판단된다.
- PCV2 단독감염이 확인된 자돈 29두의 병변조직 유제액을 nPK-15 cell 배양 플라스크에 접종하여 분리동정을 시도한 결과, 7개의 접종세포 플라스크가 5대까지 성공적으로 계대되었다. 이들 7개 접종세포에 대하여 간접형광항체법, PCR 및 투과전자현미경으로 PCV2의 감염 및 증식 여부를 확인할 수 있었으며, 확보된 이 PCV2 국내 분리주는 향후 원인체 특성 구명, 진단법 개발 등의 연구에 유용할 것으로 생각된다.
- 2). PCV2 양성인 57점의 시료 중 PPV 1점 및 PRRSV 27점 (47.4%)이 양성으로 확인되었으며, PCV2와 PRRSV 의 복합감염율은 연도별로 1999년 20.0%(1/5), 2000년 50.0%(3/6), 2001년 45.5%(10/22)및 2002년 54.2%(13/24)로 증가하는 경향을 나타내었다 (Table 2).
- 이들 병변조직에 대하여 porcine circovirus 1(PCV1), PCV2, porcine parvovirus(PPV) 및 porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) 에 대한 PCR 검사 결과, 57점에서 PCV2가 확인되었으며, PCV1은 전혀 검출되지 않았다. PCV2가 확인된 57점의 시료 중에서 PPV 또는 PRRSV가 중복감염된 예가 각각 1점(1.8%) 및 27 점(47.4%) 검출되었고, 이로 미루어 국내 PMWS 발병에는 PCV2와 PRRSV의 중복감염이 주로 관여하고 있는 것으로 판단된다.
- 공시시료 60점을 대상으로 확립된 multiplex PCR을 실시한 결과, 57점의 시료에서 PCV2가 검출되었으나, PCV1 은 60점의 시료 모두에서 검출이 되지 않았다 (Table 2) . PCV1 및 2가 검출되지 않은 나머지 3점의 시료에 대한 병성감정결과, 각각 부종병, 호홉기복합감염증 및 살모넬라감염증으로 확인되었다.
- 공시한 60점의 시료중 PCV2가 검출되지 않은 3점의 시료는 병성감정 결과, 각각 대장균감염에 의한 부종병, 호흡기복합감염증 및 살모넬 라감염증으로 진단되 어 PMWS 의 진단 시에 이들 질병과의 감별진단이 필요한 것으로 생각된다.
- 따라서 본 논문에서는 PCV2 이외에 타 병원체가 PMWS 발병에 어느 정도 관여하는지를 알아보기 위하여 PCV2 감염이 확인된 PMWS 발병돈의 시료를 대상으로 PPV와 PRRSV의 중복감염상황을 PCR로 조사한 결과, PCV2 양성으로 확인된 57점의 시료 중 PPV가 1점, PRRSV 가 27점 양성으로 확인되어 각각 1.8% 및 47.4%의 중복감염율을 나타내었다. 이는 미국에서 PMWS로 진단된 예의 60% 이상이 PCV2와 PRRSV 의 중복감염이었다는 보고 [35]와 캐나다에서 PMWS예의 약 20%에서 부검소견상 PCV2와 PRRSV가 중복감염되었으며, 또한 PCV2 감염돈의 약 20%가 PPV와 중복감염되었다는 보고 [12] 와 중복감염율에서는 차이가 있으나 중복감염 원인체에 있어서는 동일하였다.
- 3), 이는 Morozov 등 [29]이 감염세포에 대하여 검사한 결과와 일치하는 양상을 나타내었다 [27, 29]. 또한 감염세포로부터 정제한 PCV2 를 투과전자현미경으로 관찰한 결과, Mankertz 등 [26] 과 Stevenson 등 [36]이 보고한 바와 동일한 직경 17nm인 원형의 PCV 바이러스 입자가 확인되었으며(Fig. 4), 이 연구에서 개발한 multiplex PCR 방법으로 PCV2를 최종 확인하였다.
- 3). 또한 감염세포에서 바이러스를 정제하여 전자현미경으로 관찰한 결과, 직경 17 nm 정도의 원형의 PCV 바이러스 입자가 확인되었다 (Fig. 4).
- 발병돈의 병변조직에서 PCV1과 PCV2를 감별진단하기 위하여 multiplex PCR 진단법을 확립하였으며, 이 진단법을 이용하여 PCV1 오염 PK15-cell 및 PCV2 감염 시료를 대상으로 multiplex PCR을 실시한 결과, 단독 및 복합시료에서 PCV1(401 bp) 및 PCV2(503 bp)의 특이적인 PCR 증폭산물이 확인되어(Fig. 1), 감별진단이 가능함이 확인되었다.
- 본 연구에서 PCV2와 PPV의 중복감염 예가 57건 중 1건으로써 Choi와 Chae [기가 보고한 40%(4/1(0두)나 Ellis 등 [12] 이 보고한 20%의 중복감염율에 비해서는 매우 낮은 수준이었다. 그러나 본 연구에서 조사한 결과와 Lyoo 등 [22]이 조사한 PCV2와 PPV의 중복감염이 3.
- 돼지의 장기시료 60점을 수집하였다. 이들 병변조직에 대하여 porcine circovirus 1(PCV1), PCV2, porcine parvovirus(PPV) 및 porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) 에 대한 PCR 검사 결과, 57점에서 PCV2가 확인되었으며, PCV1은 전혀 검출되지 않았다. PCV2가 확인된 57점의 시료 중에서 PPV 또는 PRRSV가 중복감염된 예가 각각 1점(1.
- 이렇게 확립된 multiplex PCR을 이용하여 PWMS 발병돈으로부터 채취한 60점의 시료에 대하여 PCV1 및 PCV2 의 유전자를 검출한 결과, PCV1은 검출되지 않았으나 PCV2는 3두를 제외한 57두에서 검출되어 PCV2가 PMWS의 1차적인 원인체임을 재확인할 수 있었다 (Table 2).
- . 제작된 primer의 특이성을 확인하기 위하여 PCV1의 오염 이 확인된 PK-15 cell과 PCVfee nPK-15 cell 및 PMWS 감염자돈의 장기시료를 대상으로 multiplex PCR을 실시한 결과, 의도한 바와 같이 각각의 primer에 의해 PCV1(403bp) 및 PCV2(501bp)의 유전자가 특이적으로 증폭됨이 확인되었다 (Fig. 1).
- 한편, 본 연구에서는 PCV2와 주된 중복감염 병원체인 PRRSV와의 연도별 중복감염추이를 조사한 결과, PCV2 와 PRRSV의 중복감염은 2000년 45%(10/22), 2001년 54%(13/24)로 증가하는 경향을 나타내었다. 이는 Lyoo 등 [22] 이 1998년과 2000년 사이에 수집된 호흡기 증상을 나타내는 돼지 86두의 장기 유제액을 대상으로 PCV2, PRRSV 및 PPV의 감염상황을 조사한 결과, PCV2와 PRRSV의 중복감염이 98년에는 12%(3/25), 2000년에는 37%(10/27)이었다는 보고와 같이 최근 들어 이들 두 바이러스의 중복감염이 증가하는 경향을 나타내었다
후속연구
- 이 연구에서 공시한 시료들은 PMWS로 의심되는 돼지로부터 채취한 것으로서 공시시료에서 PCV1 이 검출되지 않고 PCV2만 검출된 것은 Lar℃helle 등 [18]의 보고와 일치하였다. 그러나 Ouardani 등 [32]은 5.7%의 낮은 비율이지만 PMWS 발병돈에서 PCV1 이 검출된다고 보고하고 있어 국내에도 PCV1 이 PMWS 발병돈에서 검출될 가능성을 배제할 수 없으므로 향후 더 많은 시료에 대한 검사가 필요할 것으로 생각된다.
- 또한 본 연구에서 개발, 이용한 multiplex PCR 진단법은 PMWS 감염증의 진단에 있어 PCV1과 2의 감별진단에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구를 통하여 확보한 PCV2 국내 분리주는 향후 PCV2 에 진단법 및 예방약 개발 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이며, 분리주에 대한 특성조사 등을 통하여 PMWS 의 병원성 규명에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구에서 개발, 이용한 multiplex PCR 진단법은 PMWS 감염증의 진단에 있어 PCV1과 2의 감별진단에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 계대되었다. 이들 7개 접종세포에 대하여 간접형광항체법, PCR 및 투과전자현미경으로 PCV2의 감염 및 증식 여부를 확인할 수 있었으며, 확보된 이 PCV2 국내 분리주는 향후 원인체 특성 구명, 진단법 개발 등의 연구에 유용할 것으로 생각된다.
- [6, 7, 23]. 이러한 PMWS 증례를 대상으로 복합감염 양상을 구명하고 원인체인 PCV2를 분리하여 그 특성을 구명한다면 질병의 진단, 예방 등의 연구 추진에 도움이 될 수 있다.
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