[논문]Helicobacter pylori의 병원성 비교를 위한 gerbil의 수침구속스트레스 모델

이진욱; 김옥진

문제 정의

pylori 감염 후 WIRS 적용하는 모델이 h. pylori 의한 in vivo 병변들을 증폭 시켜 줄 수 있는지를 평가하고자 실험을 수행하였다. 이를 위하여 가장 적절한 Mongolian gerbil에서의 WIRS 노출 시간을 정하기 위한 시험이 선행되었고, 그 결과 4시간의 WIRS 노출시간이 결정되었다.
pylori 감염 후 WIRS 적용하는 모델이 h. pylori 의한 in vivo 병변들을 증폭 시켜 줄 수 있는지를 평가하고자 실험을 수행하였다. 이를 위하여 가장 적절한 Mongolian gerbil에서의 WIRS 노출 시간을 정하기 위한 시험이 선행되었고, 그 결과 4시간의 WIRS 노출시간이 결정되었다.
본 연구는 H. pylori 균주들의 병원성 차이를 구분할 수 있는 in vivo 시스템을 개발하고자 수행되었다. 이를 위하여 Mongolian gerbil에서의 수침 구속 스트레스(water-immersion-restraint stress, WIRS) 노출 시간을 정하기 위한 시험을 수행하고, Mongolian gerbil에 H.
각 군 별로 정해진 WIRS 시간을 적용한 후, 각각의 동물들을 ether 마취 하에 치사시킨 후 위와 십이지장을 적출하여 Ulcer Index(UI)를 측정하여 각 군별 차이를 평가한 후, 적정 WIRS 시간을 결정하였고, 암.수의 성별 차이에 따른 시험의 영향을 알아보았다.
pylori 균주들의 병원성 차이를 구분할 수 있는 in vivo 시스템을 개발하고자 수행되었다. 이를 위하여 Mongolian gerbil에서의 수침 구속 스트레스(water-immersion-restraint stress, WIRS) 노출 시간을 정하기 위한 시험을 수행하고, Mongolian gerbil에 H. pylori 균주들의 감염 후 WIRS의 병행으로 H. pylori 균주들의 병원성 차이를 단기간에 유발된 병변의 정도 차이로 알아볼 수 있는지 평가하고자 하였다.

가설 설정

There were several gastric erosions and ulcers on the glandular stomach. C. Duodenum of Group I (H. pylori+WIRS) gerbil. There were severe hemorrhagic erosions and ulcers.

제안 방법

절식 동안에 음수는 자유 급이할 수 있도록 하였다. H. pylori 또는 PBS 투여된 각 군의 동물들은 1 주일 후 1"간 절식시킨 후, I 군과 IV 군의 개체들은 4시간의 WIRS를 적용시키고, II 군과 Ⅲ 군의 동물들은 WIRS 에 노출시키지 않고, ether 마취 하에 치사시킨 후위와 십이지장을 적출하여 UI를 측정하여, WIRS가 H. pylori] 감염된 gerbil에서 유의한 차이를 유발하는지를 평가하였다.
H. pylori(ATCC 43504, American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) 균주를 10% calf serum 이 첨가된 브루셀라 한천배지에 접종 후, 10% CO₂, 100% 습도가 유지되는 37oC 항온기에서 3일간 배양하였다. 배양된 H.
pylori 감염 후 WIRS 비적용군(II 군), PBS 투여 후 WIRS 적용군(Ⅲ 군), PBS 투여 후 WIRS 비적용 군(IV 군)의 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다. I 군과 II 군의 5주령 Mongolian gerbil을 18시간 절식시킨 후, 1 ml 당 2.0X109 colony-forming unit(CFU) 의균수가 포함되게 준비된 배양액을 두당 0.5 ml 씩 마우스용 존대를 이용하여 경구(p.o.)로 투여하여 H. pylori 감염을 유발하였다. Ⅲ 군과 IV 군의 동물들은 18시간 절식 후 멸균 PBS(pH 7.
pylori 감염을 유발하였다. Ⅲ 군과 IV 군의 동물들은 18시간 절식 후 멸균 PBS(pH 7.2)를 0.5 ml씩 경구 투여하였다. 투여 후 각 군의 동물들은 12시간의 절식 후 사료를 급여하였다.
UI는 각 병변의 가로길이 X 세로길이(mm²)의 총합으로 계산하였다. 각 개체의 UI를 구한 후 각 군별로 암.수의 평균 UI 를 구하였다.
분류된 Mongolian gerbil을 18시간 절식시킨 후, WIRS 전용의 stress cage에 넣어 21±1oC로 유지되는 수조에 검상돌기가 물에 잠기도록 유지하였다. 각 군 별로 정해진 WIRS 시간을 적용한 후, 각각의 동물들을 ether 마취 하에 치사시킨 후 위와 십이지장을 적출하여 Ulcer Index(UI)를 측정하여 각 군별 차이를 평가한 후, 적정 WIRS 시간을 결정하였고, 암.수의 성별 차이에 따른 시험의 영향을 알아보았다.
gerbil 20두를 시험에 사용하였다. 각 군당 5 두의 동물들을 사용하여 H. pylori 감염 후 WIRS 적용 군(I 군), H. pylori 감염 후 WIRS 비적용군(II 군), PBS 투여 후 WIRS 적용군(Ⅲ 군), PBS 투여 후 WIRS 비적용 군(IV 군)의 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다. I 군과 II 군의 5주령 Mongolian gerbil을 18시간 절식시킨 후, 1 ml 당 2.
각 시험 군별로 WIRS 수행 후 적출된 위는 위의 대만 부를 따라 절개하여 펼친 후에 실체현미경(X 10)을사용하여 병변을 관찰하고, UI를 측정하였다. UI는 각 병변의 가로길이 X 세로길이(mm²)의 총합으로 계산하였다.
사용하였다. 사육기간 중 온도는 23±1oC, 습도 50±5%, 소음 60 phone 이하, 조명시간 08:00-20:00(1 일 12시간), 환기 시간당 10-12회의 SPF 환경에서 사육되었으며, 사료는 실험동물전용사료(퓨리나)를 2.0M rad 의 방사선으로 멸균시켜 자유급식 시켰고, 음수는 자외선 멸균수를 자유 급수하였다. 본 연구에 사용된 실험동물에 관련된 모든 실험과정과 절차는 서울대학교 의과대학 실험동물 운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 규정을 준수하며 수행되었다.
수 간에 차이는 인정되지 않았다. 이러한 결과들을 토대로 2시간 이하의 WIRS 노출은 미약한 병변의 유도 때문에, 그리고 6시간의 노출은 매우 심한 병변의 유발로 인해 H. pylori 균주간 병원성 차이를 증폭시켜주는 역할로는 부적절하다고 판단되어 Mongolian gerbil의 WIRS 적정 시간은 4시간으로 정하였다.
pylori 의한 in vivo 병변들을 증폭 시켜 줄 수 있는지를 평가하고자 실험을 수행하였다. 이를 위하여 가장 적절한 Mongolian gerbil에서의 WIRS 노출 시간을 정하기 위한 시험이 선행되었고, 그 결과 4시간의 WIRS 노출시간이 결정되었다. 개체당 1X109 CFU의 H.
pylori 의한 in vivo 병변들을 증폭 시켜 줄 수 있는지를 평가하고자 실험을 수행하였다. 이를 위하여 가장 적절한 Mongolian gerbil에서의 WIRS 노출 시간을 정하기 위한 시험이 선행되었고, 그 결과 4시간의 WIRS 노출시간이 결정되었다. 개체당 1X109 CFU의 H.
수 Mongolian gerbil을 각각 18두씩, 총 36두를 시험에 사용하였다. 적정 WIRS 시간을 알아보기 위하여 WIRS 0 시간, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 位]간 노출 군으로 분류한 후, 각 군당 암.수 각각 3두, 종 6두를 사용하여 군 구성을 하였다.

대상 데이터

1주일간의 순화사육 후 5주령의 건강한 수컷 Mongolian gerbil 20두를 시험에 사용하였다. 각 군당 5 두의 동물들을 사용하여 H.
pylori(ATCC 43504, American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) 균주를 10% calf serum 이 첨가된 브루셀라 한천배지에 접종 후, 10% CO₂, 100% 습도가 유지되는 37oC 항온기에서 3일간 배양하였다. 배양된 H. pylori를 멸균된 PBS(pH 7.2)가 들어있는 튜브에 모은 후, 1 ml 당 2.0X109 colony-forming unit(CFU) 의 균 수를 포함하게 준비하여 실험에 사용하였다.
서울대 학교 의과대 학 실험동물실에서 특정 병원체부재 (specific-pathogen free, SPF)의 상태로 계통이 유지되고 있는 Mongolian gerbil(Meriones unguiculatus)을 4주령 에공급받아 1주일 동안 SPF 사육실에서 순화사육한 후 실험에 사용하였다. 사육기간 중 온도는 23±1oC, 습도 50±5%, 소음 60 phone 이하, 조명시간 08:00-20:00(1 일 12시간), 환기 시간당 10-12회의 SPF 환경에서 사육되었으며, 사료는 실험동물전용사료(퓨리나)를 2.
암.수 Mongolian gerbil을 각각 18두씩, 총 36두를 시험에 사용하였다. 적정 WIRS 시간을 알아보기 위하여 WIRS 0 시간, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 位]간 노출 군으로 분류한 후, 각 군당 암.
적정 WIRS 시간을 알아보기 위하여 WIRS 0 시간, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 位]간 노출 군으로 분류한 후, 각 군당 암.수 각각 3두, 종 6두를 사용하여 군 구성을 하였다. 분류된 Mongolian gerbil을 18시간 절식시킨 후, WIRS 전용의 stress cage에 넣어 21±1oC로 유지되는 수조에 검상돌기가 물에 잠기도록 유지하였다.

데이터처리

각 개체의 UI를 구한 후 각 군별로 암.수의 평균 UI 를 구하였다. 적출된 십이지장은 길이방향으로 절개하여 펼친 후에 실체현미경(X 10)을 사용하여 병변을 관찰하고, 동일한 방법으로 각 군의 암.

성능/효과

6시간의 WIRS 노출에 의하여 매우 심한 위궤양 병변들이 유발되었으며, 위 내강 내에 암적색 혈액응고괴를 포함한 삼출물들이 차 있는 소견이 관찰되었다. 2시간 이하의 WIRS 적용에 의하여 유도된 병변들은 그 정도가 약하고, 4시간 이상의 WIRS 적용 동물들에 비교하여 UI 또한 현격하게 감소되었다(Fig. 1). 십이지장의 병변은 위 병변과 유사한 궤양 병소들이 주된 병변이었으며, 위 병변에 비교하여 UI는 감소된 것을 알 수 있었다(Fig.
WIRS 노출 시간에 따른 Mongolian gerbil의 위 및 십이지장의 병변 유발에 차이가 있는지를 평가하기 위하여 0분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간의 각각 다른 노출 시간을 적용한 결과, 노출시간의 증가에 따라 위 및 십이지장의 UI도 증가됨을 알 수 있었다(Fig. 1). WIRS 에 의하여 유발된 위 병변은 선위 부위에 암적색 출혈 병변을 동반한 궤양 병소의 산재가 특징적이었으며, WIRS 노출시간의 증가와 상관적으로 궤양병소들의 면적들도 증가되는 것을 알 수 있었다.
1). WIRS 에 의하여 유발된 위 병변은 선위 부위에 암적색 출혈 병변을 동반한 궤양 병소의 산재가 특징적이었으며, WIRS 노출시간의 증가와 상관적으로 궤양병소들의 면적들도 증가되는 것을 알 수 있었다. 6시간의 WIRS 노출에 의하여 매우 심한 위궤양 병변들이 유발되었으며, 위 내강 내에 암적색 혈액응고괴를 포함한 삼출물들이 차 있는 소견이 관찰되었다.
이를 위하여 가장 적절한 Mongolian gerbil에서의 WIRS 노출 시간을 정하기 위한 시험이 선행되었고, 그 결과 4시간의 WIRS 노출시간이 결정되었다. 개체당 1X109 CFU의 H. pylori를 감염시 킨 후 1주일 만에 4시 간의 WIRS 를 적용하였을 때, 대조군에 비교하여 위 및 십이지장의 UI가 유의한 차이를 보여주었다(Fig. 2). H.
이를 위하여 가장 적절한 Mongolian gerbil에서의 WIRS 노출 시간을 정하기 위한 시험이 선행되었고, 그 결과 4 시간의 WIRS 노출시간이 결정되었다. 개체당 1X109 CFU의 H. pylori를 감염시 킨 후 1주일 만에 4시 간의 WIRS 를 적용하였을 때, 대조군에 비교하여 위 및 십이지장의 UI와 등급에 유의한 차이가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 WIRS는 H.
단계적으로 적용한 WIRS 노출 시간 실험을 바탕으로 4시간의 WIRS 적용 시간을 결정할 수 있었다. 또한, WIRS 에 의한 H. pylori에 감염된 개체의 병리학적 변화를 증폭시킬 수 있는지를 알아보고자 실시한 실험의 결과, H. pylori에 감염된 Mongolian gerbil을 4시간의 WIRS에 적용시켰을 때, 위 및 십이지장의 UI에서 대조군의 동물들과 유의성 있는 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 바탕으로 Mongolian gerbil에 H.
pylori ATCC 43504 균주에 감염된 상태에서 WIRS에 노출시 위장관 병변이 증폭되는 것을 확인하는 것에 그친 점이 제한점이지만, 향후 본 연구에서 개발된 모델을 사용하여 다른 임상 분리 주들의 병원성 차이를 비교하고 고병원성 균주들을 선별해 낼 수 있을 것으로 생각한다. 또한, 본 연구의 결과는 H. pylori 감염 환자들에서 스트레스에 노출될 경우에 위십이지장의 염증과 궤양이 발현될 수 있다는 것을 보여주는 결과라고 할 수 있다. 비록 H.
본 연구의 결과 5주령의 Mongolian gerbile 6시간의 WIRS 에 노출되었을 경우에 성별 차이에 관계없이 매우 심한 위 및 십이지장의 변화를 보임을 알 수 있었다. 단계적으로 적용한 WIRS 노출 시간 실험을 바탕으로 4시간의 WIRS 적용 시간을 결정할 수 있었다.
본 연구에서 gerbile 암 .수의 성별 차이 없이 WIRS에 노출되었을 때, 노출 시간에 상관적으로 위 및 십이지장 궤양 병소의 정도가증가되는 것을 알 수 있었다. 랫드와 마우스를 이용한 WIRS 의 다른 연구 보고들은 위궤양의 유무平에 주안점을 두고 있으나, 본 연구에 따르면 gerbil의 경우에 십이지장의 병변 또한, WIRS 에 노출되었을 때 위 점막과 유사한 병변이 유발되었다.
3D). 이러한 결과로부터 WIRS는 H. pylori 감염된 Mongolian gerbil 에서 그 병원성을 효과적으로 증폭시킬 수 있음을 알 수 있었다. 본 연구를 통하여 개발된 Mongolian gerbil을 이용한 수침구속 모델은 H.
pylori를 감염시 킨 후 1주일 만에 4시 간의 WIRS 를 적용하였을 때, 대조군에 비교하여 위 및 십이지장의 UI와 등급에 유의한 차이가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 WIRS는 H. pylori에 감염된 Mongolian gerbil 에서 그 병원성을 효과적으로 증폭시킬 수 있음을 알 수 있었다. 본 연구를 통하여 개발된 Mongolian gerbil을 이용한 수침구속 모델은 H.

후속연구

향후, 본 연구를 통하여 개발된 Mongolian gerbil 을 이용한 수침구속 모델을 이용하여 여러 h. pylori 임상 분리 균주들의 병원성 차이를 비교하고, 그 결과 분류된 저병원성 균주와 고병원성 균주와의 분자생물학적 차이를 분석할 예정이다.
[13]. 따라서 H. pylori의 병원성 차이를 알아낼 수 있는 시스템의 개발은 H. pylori의 연구에 매우 중요한 의미를 가지고 있으며, 개발된 시스템들을 이용하여 병원성이 높은 균주들의 선별과 연구를 통하여 H. pylori 병원성에 관련되는 인자들의 발견과 고병원성 H. pylori 균주의 확보를 통한 H. pylori 백신 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대되어진다.
pylori 감염된 Mongolian gerbil 에서 그 병원성을 효과적으로 증폭시킬 수 있음을 알 수 있었다. 본 연구를 통하여 개발된 Mongolian gerbil을 이용한 수침구속 모델은 H. pylori 균주들의 병원성 차이를 구분할 수 있는 in vivo 시스템으로 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.
이러한 연구 결과들은 gerbil을 사용한 WIRS 실험에 기초 자료를 제공할 수 있을 것으로 생각되었다. 본 연구의 결과가 H. pylori ATCC 43504 균주에 감염된 상태에서 WIRS에 노출시 위장관 병변이 증폭되는 것을 확인하는 것에 그친 점이 제한점이지만, 향후 본 연구에서 개발된 모델을 사용하여 다른 임상 분리 주들의 병원성 차이를 비교하고 고병원성 균주들을 선별해 낼 수 있을 것으로 생각한다. 또한, 본 연구의 결과는 H.
pylori 감염 환자들에서 스트레스에 노출될 경우에 위십이지장의 염증과 궤양이 발현될 수 있다는 것을 보여주는 결과라고 할 수 있다. 비록 H. pylori 감염환자들에서 위장관 병변의 발현에 차이를 설명하는 것으로 균주의 병원성 차이가 가장 설득력 있게 받아들여지고 있지만 [9], 본 연구의 결과로부터 향후 스트레스와 H. pylori 감염과의 연관성에 대한 연구가 보다 진행되어야 할 것으로 생각되었다.
pylori에 감염된 Mongolian gerbil을 4시간의 WIRS에 적용시켰을 때, 위 및 십이지장의 UI에서 대조군의 동물들과 유의성 있는 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 바탕으로 Mongolian gerbil에 H. pylori 균주들을 감염시킨 후, WIRS의 적용으로 증폭된 변화들을 평가하여 H. pylori 균주들의 병원성 비교를 할 수 있는 in vivo 시스템으로 사용될 수 있을 것으로 판단되었다. 향후, 본 연구를 통하여 개발된 Mongolian gerbil 을 이용한 수침구속 모델을 이용하여 여러 h.
랫드와 마우스를 이용한 WIRS 의 다른 연구 보고들은 위궤양의 유무平에 주안점을 두고 있으나, 본 연구에 따르면 gerbil의 경우에 십이지장의 병변 또한, WIRS 에 노출되었을 때 위 점막과 유사한 병변이 유발되었다. 이러한 연구 결과들은 gerbil을 사용한 WIRS 실험에 기초 자료를 제공할 수 있을 것으로 생각되었다. 본 연구의 결과가 H.

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Helicobacter pylori의 병원성 비교를 위한 gerbil의 수침구속스트레스 모델
Water-Immersion-Restraint Stress model in Mongolian gerbil forcomparison of pathoaenicity of Helicobacter pylori strains 원문보기

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