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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 랫드 간세포 균질액을 일정 산소압하에서 막지질 과산화를 유도시킨 후 마이크로솜을 분리하여 막지질 과산화 수준을 MDA 측정법과 형광분석법으로 평가하였으며, 이에 수반되는 마이크로솜 기능의 평가를 위하여 MFO 시스템의 핵심 물질인 cytochrome P450 양과 cytochrome P450 reductase 활성을 평가하였다. 아울러 실제로 화합물의 대사능력을 평가하기 위하여 cytochrome P450 의존 aminopyrine demethylase 활성과 benzpyrene hydroxylse 활성을 측정하였으며, 막지질 과산화에 의한 형광물질의 생성과 retinyl palmitate 농도 변화와의 관계도 규명하고자 하였다.
- 같은 형광성 물질인 retinyl palmitate 실질적으로 파괴되는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 시험관내 산소처리에 의한 간 균질액의 형광강도와 retinyl palmitate 농도 그리고 마이크로솜 기능 사이의 상관관계를 알아보고자 하였다.
- 아울러 실제로 화합물의 대사능력을 평가하기 위하여 cytochrome P450 의존 aminopyrine demethylase 활성과 benzpyrene hydroxylse 활성을 측정하였으며, 막지질 과산화에 의한 형광물질의 생성과 retinyl palmitate 농도 변화와의 관계도 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 5 mM NADPH 10 μl, 마이크로솜 부유액 (5 mg protein /ml) 10µl를 1 m/ 비색관에서 혼합하여 1분 후 파장 550 nm 에서 1분간 흡광도 변화를 측정하였다. 1분간의 흡광도 변화로부터 환원 cytochrome c 의 extinction coefficient, 21X103 μmol min-1mgT protein을 이용하여 환원되는 cytochrome c의 nm/min/mg protein로 활성을 표시하였다.
- 342 nm와 Em. 455 nm에서 상대적 형광강도를 측정하여 비교하였다.
- 330 nm와 Em. 471 nm에서 상대적 형광강도를 측정하고 표준 retinyl palmitate 처리하여 작성한 표준 형광곡선으로부터 균질액 1 m/ (1 mg protein 함유) 당 retinyl palmitate 양을 산출하였다.
- 396 nm, Em. 522 nm에서 산화된 benzpyrene의 형광강도를 측정하였다. 활성도는 산화된 benzpyrene의 nmol/ min/mg proteii&로 표시하였다.
- 간 균질액을 산소압하에 30oC 수조에서 진탕하면서 3 시간 간격으로 12시간까지 5회에 걸쳐 채취하여 마이크로 솜을 분리한 후 단백질 2 mg/m/을 함유하도록 희석한 간 균질액과 마이크로솜 부유액의 상대적 형광강도를 측정한 바, Fig. 2와 같았다. 간 균질액과 마이크로 솜 부유액 모두에서 12시간까지 형광 강도가 증가하였음을 알 수 있었다.
- 랫드를 치사시킨 후 즉시 간장을 제거하여 세절하고 냉장 Tris 완충액 (0.25 M sucrose, 20 mM nicotinamide, 27 mM KCl, pH 7.4)으로 3회 이상 세척하여 결체조직과 응고된 혈액을 제거하였다. 세척한 조직에 다시 같은 Tris 완충액 30 ml를 가하여 SMT process homogenizer 로 1분간 조직을 파쇄 시킨 후 다시 teflon-pestle homogenizer를 사용하여 0-4oC를 유지 하면서 4회 stroke 를 실시하여 균질 부유액을 실험에 사용하였다.
- 마이크로솜의 cytochrome P450과 NADPH-cytochrome c reductase 활성 측정을 위한 1, 2, 4-aminonaphtol sulfonic acid, cytochrome c 및 NADPH와 마이크로솜의 약물 대사 측정을 위한 aminopyrine과 benzpyrenee Sigma (U.S.A.) 제품을 사용하였고, malondialdehyde 측정을 위한 thiobarbituric acid (TBA)와 trichloroacetic acid (TCA) 는 Lancaster (Engand)제 품, 기타 일반 시 약은 Junsei (Japan) 제품의 1급 시 약을 사용하였다.
- 분석기기로 균질마쇄기는 SMT process homogenizer (SMT Co., Japan teflonpestle homogenizer (Wheaton, U.S.A.)를 사용하였고, 마이크로솜의 분리를 위해서는 super speed centrifuge (Vision, Korea) 를 사용하였으며, 흡광도 측정은 UV-2100 spectrophotometer (Shimadzu, Japan:를 사용하였고, 형광 스펙트럼과 형광강도의 측정은 spectrofluorometer (SFM25, Italy)를 사용하였다.
- 전 과정을 요약하면 균질 부유액을 460Xg 에서 5분간 원심분리하여 세포 파쇄물과 핵 침전물을 분리하여 제거하고 상청액을 다시 4, 300×g에서 10분간 원심분리하여 미세한 파쇄물 침전을 제거하였다. 얻어진 상청액을 12, 500Xg에서 30분간 원심분리하여 미토콘드리아 침전물을 분리하여 제거한 후 얻어진 상청액을 100, 500Xg에서 90분간 원심분리하여 마이크로 솜 침전물을 분리하였다. 마이크로솜 침전물을 Tris 완충액 에 부유시 켜 다시 한번 teflon-pestle homogenizer 를 사용하여 마이크로솜 균질 부유액을 얻었다.
- Wills [20]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 0.05 M Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 3 m/, 마이크로솜 부유액 (5 mg protein/m/) 1 m/, 9.5 mM NADPH 20µl 그리고 0.1 M aminopyrine 1 ml를 혼합하여 37oC의 수조에서 반응시키면서 5분 간격으로 4회에 걸쳐 반응액 1m/ 씩 취하여 10% TCA 1 m/와 혼합하였다. 혼합액을 실온에서 15분간 방치 한 후, Nash 시 약 [14] 2 m/와 혼합하여 60℃ 항온수조에서 15분간 반응시킨 후 2, 500 r.
- , Emission wavelength) 553 nm에서 측정하였다. 표준품으로 tetramethoxy propan을 상기와 같은 방법으로 처리하여 얻은 MDA 표준 형광곡선으로부터 MDA 양을 산출하였다.
대상 데이터
- 25 N HCl) 2 ml와 균질액 또는 마이크로솜 부유액 (1 mg protein/ml) 1 m/, 그리고 10µl의 10% BHT를 가하여 혼합하고 자비 수조에서 15분간 가열한 후 냉각시킨 반응액을 3, 000×g 에서 10분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액의 형광 강도를 여기파장 (Ex., Excitation wavelength) 515 nm와 방사파장 (Em., Emission wavelength) 553 nm에서 측정하였다. 표준품으로 tetramethoxy propan을 상기와 같은 방법으로 처리하여 얻은 MDA 표준 형광곡선으로부터 MDA 양을 산출하였다.
- 마이크로솜 침전물을 Tris 완충액 에 부유시 켜 다시 한번 teflon-pestle homogenizer 를 사용하여 마이크로솜 균질 부유액을 얻었다. 위와 같이 얻어진 간 균질액과 마이크로솜 부유액은 단백질 농도를 측정하여 필요에 따라 즉시 적절한 농도로 희석하여 실험에 사용하였으며, 부득이 보관할 필요가 있을 때는 냉동 보관하여 3일 이내에 실험에 사용하였다.
- 이유 직후의 Sprague-Dawley계 수컷 랫드 30마리를 전북대학교 생체 안정성연구소에서 분양받아 삼양사료 (주)에서 제조한 마우스 사료를 물과 함께 제한없이 급여하면서 실험동물실에서 사육하였다. 약 4개월 사육 후 체중 약 250 g 전후에 도달하였을 때 두부를 타격하여 치사시킨 후 간을 채취하여 실험에 사용한다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 실험 관측치는 5회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 유의성 검정은 Student t-검정에 의하였으며, 상관분석법에 의하여 회귀방정식과 상관계수 (r를 구하였다.
- 나타내었다. 유의성 검정은 Student t-검정에 의하였으며, 상관분석법에 의하여 회귀방정식과 상관계수 (r를 구하였다.
이론/모형
- Keller 등 [10]의 방법에 준하여 다음과 같이 측정하였다TBA 시약 (15% TCA, 0.375% TBA, 0.25 N HCl) 2 ml와 균질액 또는 마이크로솜 부유액 (1 mg protein/ml) 1 m/, 그리고 10µl의 10% BHT를 가하여 혼합하고 자비 수조에서 15분간 가열한 후 냉각시킨 반응액을 3, 000×g 에서 10분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액의 형광 강도를 여기파장 (Ex.
- Watanabe 등 [19]의 방법에 준하여 측정하였다. 요약하면, 마이크로솜 부유액 (2, 5 mg protein/m/) 0.
- Wills [20]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 0.
- 균질액중의 retinyl palmitate 농도는 Szweda [18]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 간 균질 희석액 (6 mg protein/m/ 용액 50 µl)에 methanol 1 ml를 가하여 잘 혼합한 후 1000Xg 에서 5분간 원심 분리하였다.
- 세척한 조직에 다시 같은 Tris 완충액 30 ml를 가하여 SMT process homogenizer 로 1분간 조직을 파쇄 시킨 후 다시 teflon-pestle homogenizer를 사용하여 0-4oC를 유지 하면서 4회 stroke 를 실시하여 균질 부유액을 실험에 사용하였다. 마이크로 솜의 분리는 균질 부유액으로부터 미토콘드리아를 분리하여 제거하고 Omura와 Sato [15] 의 방법에 준하여 마이크로 솜을 분리하였다. 전 과정을 요약하면 균질 부유액을 460Xg 에서 5분간 원심분리하여 세포 파쇄물과 핵 침전물을 분리하여 제거하고 상청액을 다시 4, 300×g에서 10분간 원심분리하여 미세한 파쇄물 침전을 제거하였다.
- 마이크로솜 부유액 중 cytochrome P450 양은 Omura 와 Sato [15] 의 방법으로 측정하였다. 즉, 마이크로솜 부유액 (2 mg protein/m/, 0.
성능/효과
- 7C와 같았다. Aminopyrine N-demethylase 활성 및 benzpyrene hydroxylase 활성은 마이크로솜의 형광강도의 증가에 반하여 감소하였으며 각각 r=-0.97과 r=-0.91의 높은 역상관을 나타내었다.
- 2와 같았다. 간 균질액과 마이크로 솜 부유액 모두에서 12시간까지 형광 강도가 증가하였음을 알 수 있었다.
- 3과 같았다. 간 균질액의 MDA 함량은 3시간 이내에 증가하였으며 이후 변함없이 동일한 수준을 유지하였다. 마이크로솜 부유액에서는 12시간 후에 다소 상승한 것을 제외하고는 유의성 있는 변화를 보이지 않았다.
- 간 균질액의 산소처리는 마이크로솜 부유액의 형광강도를 증가시켰으나, 균질액 중 retinyl palmitate 농도를 감소시켜 지질 과산화에 따른 형광성물질의 생성과 달리 같은 형광성 물질인 retinyl palmitate 실질적으로 파괴되는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 시험관내 산소처리에 의한 간 균질액의 형광강도와 retinyl palmitate 농도 그리고 마이크로솜 기능 사이의 상관관계를 알아보고자 하였다.
- 결론적으로 시험관내 실험에서 간 균질액의 산소처리에 의한 retinyl palmitate 농도의 감소는 MFO 시스템의 cytochrome P450 양과 NADPH-cytochrome P450 reductase 의 활성감소를 수반하였다. 또한 cytochrome P450-의존 aminopyrine N-demethylase와 benzpyrene hydroxylase의 활성 역시 감소되는 경향을 나타내었다.
- 7A와 같다. 두 효소 모두 산소처리 시간이 길어짐에 따라 활성이 저 하하였으며 benzpyrene hydroxylase의 활성이 보다 더 뚜렷한 저하를 보였다. 간 균질액에 산소를 처리하여 마이크로솜의 형광강도가 증가하였으므로 형광강도의 증가와 cytochrome P450의존 효소 활성 감소 간의 상관성을 조사한 바 Fig.
- 따라서 본 연구에서 산소처리에 의한 형광강도의 변화와 cytochrome P450 양 및 NADPH-cytochrome P450 reductase 활성간의 상관성을 조사한 결과 cytochrome P450 양과 NADPH-cytochrome P450 reductase 활성 모두 형광강도의 증가에 수반하여 감소하는 역상관의 관계를 나타내었다. 이러한 결과는 Gut 등 [5]의 보고에서 막지질 과산화의 유도는 cytochrome P450 양을 감소시켰다는 결과와 일치하는 것이었다.
- 6C와 같았다. 마이크로솜 부유액의 형광강도가 증가함에 따라 cytochrome P450 양과 NADPH- cytochrome P450 reductase 활성 모두 감소하여 cytochrome P450 양과의 상관계수는 r=-0.97, NADPH-cytochrome P450 reductase 활성과의 상관계수는 r=-0.93의 매우 높은 역상관성을 나타내었다.
- 7E와 같았다. 산소에 의한 간 균질 액 중 retinyl palmitate 농도의 감소는 마이크로솜 부유액의 aminopyrine N-demethylase 활성 과 benzpyrene hydroxylase 활성을 저 하시 켜 각각 r=0.90 및 r=0.85으로 매우 높은 정상관성을 나타내었다.
- 6E의 결과를 얻었다. 즉, retinyl palmitate 농도감소는 cytochrome P450 양의 동반 감소 경향을 보였으며, r=0.92의 높은 정상관성을 보였다. NADPH- cytochrome P450 reductase 활성도 r=0.
후속연구
- 또한 cytochrome P450-의존 aminopyrine N-demethylase와 benzpyrene hydroxylase의 활성 역시 감소되는 경향을 나타내었다. 그러나 retinyl palmitate 농도 감소에 따른 마이크로솜 기능의 쇠퇴가 직접 retinyl palmitate 농도 자체에 기인하는 것인지에 대하여는 확인된 보고가 없으며, 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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