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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 지황 부정근을 이용한 우량 영양계의 번식조건을 확립하고자 부정근의 액체배양 체계 확립과생물반응기를 이용한 대량 생산 및 증식된 부정근으로부터 직접 기관분화에 의한 식물체 증식체계를 확립하고자 한다.
제안 방법
- 신초들은 모두 정상적인 생육을 보이며, 식물체로 생장하였으며, 이들 식물체들은 토양으로 옮겨 순화되었다. 따라서 이러한 증식 체계를 이용하여 지황식물체의 대량증식 체계를 확립 하였다.
- 상기실험에서 확립된 부정근 증식조건을 이용하여 액체배양을 실시하였으며, 이를 액체 현탁 배양하여 액체조건에서의 증식조건을 확립하였다. 또한, 2mg/LIBA 가 첨가된 1/3 MS배지 조건에서 생물반응기에 10 g의 부정근을 접종하여 6주간 암배양하여 255 g의 부정근을 생산할 수 있었으며, 이렇게 생산된 부정근은 2 mg/L BA가 첨가된 MS 고체배지에서 신초를 유도하였다. 신초들은 모두 정상적인 생육을 보이며, 식물체로 생장하였으며, 이들 식물체들은 토양으로 옮겨 순화되었다.
- 또한, 유도된 부정근의 증식은 NAA 및 IBA를 농도별 (0.2, 2 mg/L) 로 첨가한 MS 고체배지에 약 2 cm 크기의 부정근을 한 페트리디쉬 당 20개씩 3개의 페트리디쉬에 치상하여 4주간 배양하였으며, 한 절편체당 유도된 부정근 수 및 길이를 조사하여 증식율을 비교하였다.
- 확립하였다. 먼저 지황의 잎절편을 2 mg/L IBA 혹은 2 mg/L NAA를 첨가한 MS 고체배지에 치상하여 부정근을 유도하였다. 고체 배지에서의 효율적인 증식조건을 확인하기 위해 다양한 옥신 농도에 따른 배지에 부정근을 치상하여 4주간 배양한 후 증식된 부정근의 수와 길이를 측정한 결과 2 mg/L IBA 조건에서 최적의 생장을 보였다.
- 배지는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본염에 30 g/L sucrose를 넣고 고체배지는 2.0 g/L gelrite을 첨가하였으며, pH 를 5.8로 조정한 후 121℃에서 20분간 고압멸균기를 이용하여 살균하여 플라스틱 petri-dish에 각각 30 mL 씩 분주하였다. 지황 부정근에서의 신초재분화를 위한 배양실 조건은 30 # m-2 sec-1, 백색 형광등으로 16시간 명조건, 8시간 암조건으로 온도는 25±2℃로 유지하였다.
- 부정근을 유도하기 위하여 상기 엽절편체를 MS 기본배지에 2 mg/L NAA 또는 IBA를 첨 가한 부정근 유도배지에 치상하여 4주간 배양한 후에 유도된 부정근 수를 조사하였다. 또한, 유도된 부정근의 증식은 NAA 및 IBA를 농도별 (0.
- 부정근의 액체 진탕배양시 최적조건의 액체배지 조성을 선발하고자 고체배지에서 유도된 부정근 1 g 을 취해 기본적으로 2 mg/L IBA와 3% sucrose를 넣고 염농도를 각각 1/3 MS, 1/2 MS, 1/3 MS으로 조절한 액체배지 100 mL에 접종하였다. 사용된 배 양용기는 300 mL 크기의 삼각 플라스크로써 배 양은 4주간 l00rpm으로 진탕배양하였으며, 배양 후 생체중을 측정하였다.
- 고체 배지에서의 효율적인 증식조건을 확인하기 위해 다양한 옥신 농도에 따른 배지에 부정근을 치상하여 4주간 배양한 후 증식된 부정근의 수와 길이를 측정한 결과 2 mg/L IBA 조건에서 최적의 생장을 보였다. 상기실험에서 확립된 부정근 증식조건을 이용하여 액체배양을 실시하였으며, 이를 액체 현탁 배양하여 액체조건에서의 증식조건을 확립하였다. 또한, 2mg/LIBA 가 첨가된 1/3 MS배지 조건에서 생물반응기에 10 g의 부정근을 접종하여 6주간 암배양하여 255 g의 부정근을 생산할 수 있었으며, 이렇게 생산된 부정근은 2 mg/L BA가 첨가된 MS 고체배지에서 신초를 유도하였다.
- 생물반응기에서 생산된 부정근은 Jeong 등 (2002)의 방법에 따라 2 mg/L BA를 첨가한 MS 고체배지에 치상하여 4주간 배양하면서 신초를 유도하였으며, 부정근에서 유도된 약 1 cm 크기의 신초들은 각각 부정근으로부터 분리한 뒤 1/2 MS 고체배지에 20 g/L의 sucrose, 2 g/L gelite가 첨가된 뿌리 유도 배지가 담긴 시험관에 치상하여 생장시켰으며, 기내에서 정상적으로 뿌리가 유도된 완전한 식물체는 vermiculite와 perlite를 각각 3:1로 혼합한 인공토를 담은 50×35×9 cm 크기의 플라스틱 용기로 옮긴 후 비닐로 덮어 수분의 손실을 막으며, 약 2주간 온실에서 순화시킨 후 비닐을 걷고 생육시켰다.
- 8)를 넣고 이를 접종하였다. 생물반응기의 공기 주입량은 0.1 vvm (air volume/culture volume/min)으로 조절하였으며, 배양은 암조건에서 6주간 실시하였으며, 주기적으로 시료를 채취해 생체 증식 량을 측정하여 상기 배양조건에서의 생장율을 조사하였다. 생물반응기에서 배양된 지황 부정근은 생체중을 조사한 후 배양조건에 따른 신초 재분화를 위한 재료로 이용되었다.
- 액체현탁배양에 사용된 배양용기가 제한적이며, 배지 및 영양원의 결핍은 부정근 생장에 저해요인이 되므로 보다 큰 생물반응기를 이용하여 부정근을 증식하였다. 부정근 증식 배지는 상기 액체 현탁배양에서 부정근 생장에 최적이였던 2mg/L IBA, 3% sucrose, 1/3 MS 배지조건을 이용하였으며, 10 g의 부정근을 접종하여 6주간의 암배양한 결과 배양 2주부터 급속히 생장하면서 대수 증식을 보였으며, 배양 4주 후 부터 증식율이 다소 감소하였으나 6주까지 빠른 생장을 보이며 전형적인 식물생장곡선양상을 보였다 (Figure 2).
- 지황의 부정근을 이용한 기내묘 생산 체계를 확립하였다. 먼저 지황의 잎절편을 2 mg/L IBA 혹은 2 mg/L NAA를 첨가한 MS 고체배지에 치상하여 부정근을 유도하였다.
대상 데이터
- 접종하였다. 사용된 배 양용기는 300 mL 크기의 삼각 플라스크로써 배 양은 4주간 l00rpm으로 진탕배양하였으며, 배양 후 생체중을 측정하였다.
- 지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz) 식물체는 작물시 험 장으로부터 분양받은 '지황 1호' 품종을 충북대학교 첨단원예기술센터 유리온실에서 식재하여 유지하였다. 기내배양을 위해 지황의 유엽조직을 채취하여 수세한 후 70% 에탄올로 30 초간 소독하였으며, 2-3 방울의 Tween 20을 넣은 1% sodium hypochlorite 용액에 10분 동안 침지하여 표면살균 하였다.
성능/효과
- 5 cm로 가장 양호하였다 (Figure 3A). 2 mg/L의 NAA 처리구에서도 절편체 당 15.2개의 부정근이 형성되어 IBA 처리구와 부정근 유도율은 비슷하였으나 절편체 및 형성된 부정근에서 다시 캘러스가 형성되는 것을 관찰할 수 있었으며(자료 미제시), 유도된 부정근의 길이 생장 또한 IBA 처리보다 좋지 않았다(Table 2). 따라서 지황의 부정근증식에는 2 mg/L IBA가 적절한 것으로 판단되었다.
- 잎절편체로부터 부정근은 배양 2주 후부터 생성되기 시작하였으며, NAA 와 IBA 처리구 모두 4주 배양 후 지황의 잎절편체에서 유도된 부정근의 형성율은 90% 이상으로 매우 높았다. 각 절편체당 형성된 부정근의 수는 IBA 처리에서 2.2개, NAA 처리에서 4.5개로 NAA 처리에서 절편체당 형성된 부정근의 수가 2배 높은 결과를 보였다 (Table 1). 한편, 부정근의 증식조건을 확립하기 위해 상기 조건에서 형성된 부정근의 정단을 제거하고 길이가 2 cm 정도의 절편체를 만든 후 NAA와 IBA 호르몬을 농도별 (0, 0.
- 먼저 지황의 잎절편을 2 mg/L IBA 혹은 2 mg/L NAA를 첨가한 MS 고체배지에 치상하여 부정근을 유도하였다. 고체 배지에서의 효율적인 증식조건을 확인하기 위해 다양한 옥신 농도에 따른 배지에 부정근을 치상하여 4주간 배양한 후 증식된 부정근의 수와 길이를 측정한 결과 2 mg/L IBA 조건에서 최적의 생장을 보였다. 상기실험에서 확립된 부정근 증식조건을 이용하여 액체배양을 실시하였으며, 이를 액체 현탁 배양하여 액체조건에서의 증식조건을 확립하였다.
- 또한, 바이러스 무병주를 획득한 후이를 대량 생산 할 수 있는 기간이 단축될 것임으로 빠른 산업화가 가능하리라고 판단되었다. 따라서 본 연구 결과에 따라 생물반응기를 이용하여 지황 부정근을 빠른 시간 안에 대량으로 생산할 수 있었으며, 생산된 부정근을 이용하여 지황의 대량 증식체계를 확립할 수 있었다.
- 또한 빠른 장점이 있다. 따라서 상기 조건에서 유도된지 황 부정근의 증식을 위해 액체 진탕배양을 시도하였으며, 최적조건의 액체배지 조성을 선발하고자 생체중 1 g의 부정근을 각각 MS, 1/2 MS, 1/3 MS 액체배지 100 mL에 접종하여 4 주간 100rpm으로 진탕배양한 결과 액체 배양 초기에는 생육의 차이를 보이지 않았으나 배양 3주가 되면서 급속한 생장을 보이기 시작하였으며, 배양 4주 후 수확하여 생체중을 비교한 결과 MS배지에서는 3.05 g, 1/2 MS에서는 5.52 g, 그리고 1/3 MS 에서는 7.35 g으로 1/3 MS배지에서 가장 양호한 생장을 보였다 (Figure 1). 이는 초기 접종량의 7배 이상의 생장을 보인 것이며, 2 mg/L IBA, 3% sucrose, 1/3 MS 조건에서 지황의 부정근이 활발히 생장 함을 보여주는 결과이다.
- 2개의 부정근이 형성되어 IBA 처리구와 부정근 유도율은 비슷하였으나 절편체 및 형성된 부정근에서 다시 캘러스가 형성되는 것을 관찰할 수 있었으며(자료 미제시), 유도된 부정근의 길이 생장 또한 IBA 처리보다 좋지 않았다(Table 2). 따라서 지황의 부정근증식에는 2 mg/L IBA가 적절한 것으로 판단되었다.
- 1995). 반면에 지황은 이들 식물체에서 부정근의 유도를 위해 소요되는 배양기간에 비해 배양 2주 만에 부정근을 유도할 수 있었으며, 2 mg/L IBA에서 캘러스의 형성 단계를 거치지 않고 직접 부정근이 유도되었으며 부정근의 증식 또한 매우 양호하였다.
- 본 결과에서는 10 g 의 부정근으로써 6주 만에 22.5배가 증식되어 225 g 의 증식이 가능하였으며, 이렇게 생산된 부정근 0.5 g으로 7개의 신초를 생산할 수 있었다. 생산된 신초들은 대부분 토양까지 옮겨져 정상적인 생육을 보였다.
- 따라서 이러한 뿌리기관을 이용하여 대량 증식체계를 갖춘후 이로부터 효율적인 재분화 체계를 확립한다면 적은 노동력과 시간 안에 대량 급속배양이 가능할 것이다. 본 연구에서는 지황의 부정근을 생물반응기에 접종하여 6주만에 급속히 증식시킬 수 있었으며, 이렇게 생산된 부정근을 이용하여 신초를 유도한 후 토양에 이식하여 정상적으로 생육함을 확인하였다.
- 이용하여 부정근을 증식하였다. 부정근 증식 배지는 상기 액체 현탁배양에서 부정근 생장에 최적이였던 2mg/L IBA, 3% sucrose, 1/3 MS 배지조건을 이용하였으며, 10 g의 부정근을 접종하여 6주간의 암배양한 결과 배양 2주부터 급속히 생장하면서 대수 증식을 보였으며, 배양 4주 후 부터 증식율이 다소 감소하였으나 6주까지 빠른 생장을 보이며 전형적인 식물생장곡선양상을 보였다 (Figure 2). 증식된 부정 근의 건물 중은 최종 수확 후 약 15.
- 생물반응기에서 생산된 부정근을 약 0.5 g씩 나누어 2mg/L BA를 첨가한 MS 고체배지에 치상하여 배양한 결과 배양 1 주부터 연노랑색의 지황 부정근의 표면에서 직접 형성되는 돌기들을 관찰할 수 있었으며, 이러한 돌기들은 배양 2주가 되면서 녹색을 띄는 신초로 발달되었다. 배양 3주가 지나면서 형성된 신초들은 핀셋으로 분리할 수 있었으며, 4주까지 배양한 후 형성된 신초들은 뿌리 재분화에 이용하였다 (Figure 3D).
- 잎절편체로부터 부정근은 배양 2주 후부터 생성되기 시작하였으며, NAA 와 IBA 처리구 모두 4주 배양 후 지황의 잎절편체에서 유도된 부정근의 형성율은 90% 이상으로 매우 높았다. 각 절편체당 형성된 부정근의 수는 IBA 처리에서 2.
- 부정근 증식 배지는 상기 액체 현탁배양에서 부정근 생장에 최적이였던 2mg/L IBA, 3% sucrose, 1/3 MS 배지조건을 이용하였으며, 10 g의 부정근을 접종하여 6주간의 암배양한 결과 배양 2주부터 급속히 생장하면서 대수 증식을 보였으며, 배양 4주 후 부터 증식율이 다소 감소하였으나 6주까지 빠른 생장을 보이며 전형적인 식물생장곡선양상을 보였다 (Figure 2). 증식된 부정 근의 건물 중은 최종 수확 후 약 15.85 g으로 생체중 225 g 의 7.04%였으며, 생장기간 동안 계속적인 증가를 보였다. 이러한 결과는 초기 접종량의 22.
- 5개로 NAA 처리에서 절편체당 형성된 부정근의 수가 2배 높은 결과를 보였다 (Table 1). 한편, 부정근의 증식조건을 확립하기 위해 상기 조건에서 형성된 부정근의 정단을 제거하고 길이가 2 cm 정도의 절편체를 만든 후 NAA와 IBA 호르몬을 농도별 (0, 0.2, 2 mg/L)로 처리한 배지에 치상하여 4주간 배양한 후 새로운 부정근의 유도 및 부정근의 증식을 조사하였을 때 호르몬을 첨가하지 않은 처리구에서는 부정근이 유도되지 않았으나 NAA, IBA 를 처리한 처리구에서는 84〜94% 의 높은 부정근 유도율을 보였으며, 호르몬에 관계 없이 NAA, IBA 모두 농도가 높을 때 부정근의 생장이 양호하였다. 절편체당 형성된 부정근의 수는 6〜16개로 조사되었는데, 2 mg/L IBA처리구에서 절편체당 16.
후속연구
- 2002). 따라서 이러한 뿌리기관을 이용하여 대량 증식체계를 갖춘후 이로부터 효율적인 재분화 체계를 확립한다면 적은 노동력과 시간 안에 대량 급속배양이 가능할 것이다. 본 연구에서는 지황의 부정근을 생물반응기에 접종하여 6주만에 급속히 증식시킬 수 있었으며, 이렇게 생산된 부정근을 이용하여 신초를 유도한 후 토양에 이식하여 정상적으로 생육함을 확인하였다.
- 이러한 증식체계는 대략 3-4개월 만에 소량의 부정근에서 최종 요구되는 생산 스케일의 묘로 증식시킬 수 있는 장점을 가지는데, 이는 종묘생산에 있어 주요 품종을 계대 및 유지에 소요되는 비용을 절감할 수 있다. 또한, 바이러스 무병주를 획득한 후이를 대량 생산 할 수 있는 기간이 단축될 것임으로 빠른 산업화가 가능하리라고 판단되었다. 따라서 본 연구 결과에 따라 생물반응기를 이용하여 지황 부정근을 빠른 시간 안에 대량으로 생산할 수 있었으며, 생산된 부정근을 이용하여 지황의 대량 증식체계를 확립할 수 있었다.
- 지황의 이러한 특정은 유전자원의 보존 및 증식방법으로써 부정근의 이용가능성을 생각할 수 있으며, 이는 매우 간편한 방법이 될 것이다. 또한, 부정근의 대량증식체계는 부정근을 직접 약용원료로 사용할 수 있을 뿐 아니라, 대량증식된 이들 부정근으로부터 식물체 대량증식체계가 확립된다면 우량 종묘생산의 새로운 방법으로써 부정근을 이용한 대 량 증식체계가 제시될 수 있을 것이다.
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