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문제 정의
- 본 연구는 한국산 칡의 에스트로겐성을 평가하고자 칡에서 에스트로겐성이 있다고 알려진 성분들의 함량을 HPLC로 즉정하였고, 그 성분들의 에스트로겐성을 estrogen receptor dependent transcriptional expression assay# 이용하여 분석하였으며, 칡의 부위별, 지역별 총 에스트로겐성을 조사하였다.
가설 설정
- a) Potency is the molar concentration which elicit the 50% of maximal activity.
제안 방법
- 0, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 2 mM DTT) 을 넣고 5~6회 resuspend하여 cell을 lyse시 켰匸}. Cell lysate(5 卩L)를 luciferase activity assay reagent(Promega) 25 卩L와 혼합한 다음 luciferase의 기질인 luminol 첨가한 후 생성되는 luminescence를 LuminometerfCytofluor 2300, Perspective Biosystems, Framingham, MA)로 즉정 하였다. Luciferase 활성은 !'이ative light unit(RLU)로 나타내 었으며 (18, 20), 배양액 에 의해 일어나는 background RLU 값을 측정 luciferase 값에서 제하였다.
- Cell lysate(5 卩L)를 luciferase activity assay reagent(Promega) 25 卩L와 혼합한 다음 luciferase의 기질인 luminol 첨가한 후 생성되는 luminescence를 LuminometerfCytofluor 2300, Perspective Biosystems, Framingham, MA)로 즉정 하였다. Luciferase 활성은 !'이ative light unit(RLU)로 나타내 었으며 (18, 20), 배양액 에 의해 일어나는 background RLU 값을 측정 luciferase 값에서 제하였다.
- Phytochemicals의 HPLC 정량분석 은 Varian 230(HPLC, Model varian 230, Varian, USA)을 사용하였고, 컬럼은 In tersil ODS- 2(4.6 mmx 150 mm, Chrompack, USA)을 사용하였다. 이동상은 0.
- 1에서 보는 바와 같이 본 연구에서 사용한 luciferase reporter gene을 transfect킨 stable cell line(MCF 7-ERE)이 176-estradiol에 용량-의존적으로 반응함을 보여주었다. 또한 9종의 phytochemicals에 대해서도 용량-의존적으로 반응하였다. 이는 MCF7-ERE 시스템이 에스트로겐성 평가에 적합하게 적용될 수 있음을 보여주고 있다.
- 17β-estradiol에 대한 1 uM에서의 상대 효율(relative efficiency)은 genistein>biochanin A>daidzein >genistin>formononetin>puerarin » glycitein = daidzin = glycitin 순이었다. 또한 칡의 부위별, 지역에 따른 칡의 에스트로겐성을 조사하였다. 칡의 부위별 에스트로겐 성은 뿌리 >줄기>잎>꽃>종자 순으로 나타났다.
- 본 연구에서는 한국산 칡에서 에스트로겐성이 알려진 다양한 phytochemicals 함량을 HPLC로 정량하였고, 각각의 에스트로겐성을 estrogen receptor dependent transcrip tional expression assay을 이용하여 검색하였다. Table 1 에서 보는 바와 같이 phytochemicals은 칡중에는 뿌리 에 가장 많이 함유되어 있었으며, 그 다음으로 줄기, 잎, 꽃, 씨 순으로 많이 함유되어 있었다.
- 2일간 nonselective media에서 배양 후, 항생제 G418 750 Ug/ m丄을 가하고 약 2주 배양하였다. 약 2주간 배양 후 각 클론을 96 well plate에 옮기고 각 클론을 1 nM 170-estradiol을 처리하고 이에 의해 luciferase 발현이 증가한 것을 지표로 하여 활성 이 나타나는 클론을 선발하였다(이하 MCF 7-ERE cell 이라 함). 선발된 클론은 170-estradiol에 매우 민감하게 반응하는데, 1 pM에서 유도되기 시작하여 1 nM에서 포화되는것으로 나타났다(EDm = 7.
- 3 pM). 에스트로겐의 양을 증가시켰을 때 측정되는 luminescence가 증가하는 조건을 확립하여 검량선을 그렸다.
- 용량-반응 곡선은 횡축에 대수용량, 종축에 RLU 활성을 도시하였고, 이들 데이터를 logistic dose-response function (Microcal Origin, Version 5.0, Microcal Software Inc., MA, USA)으로 적합화하였다. 효율(efficiency; % maximal value) 및 효능(potency; EG。)은 적합함수로부터 구하였다.
- 등이 있다. 이 중에 estrogen receptor dependent transcriptional expression assay는 세포에 직접 처리 함으로써 중요한 생물학적 효과를 반영해 주고, 수용체와 에스트로겐 복합체에 의한 reporter gene의 발현 정도를 쉽게 측정 할 수 있어(17, 18), 본 연구에서는 본 시스템을 구축하여 에스트로겐성 평가에 이용하였다.
- 한국산 칡(Pueraria thunbergiana)의 에스트로겐성을 평가하기 위하여 9종의 물질의 함량을 HPLC로 측정하였고, 그들의 에스트로겐성을 in vitro screening test인 estrogen receptor dependent transcriptional expression assay를 이용하여 평가하였다. Phytochemical 함량을 분석한 결과 칡의 대표적 에스트로겐성 물질인 daidzein의 경우, 뿌리>줄기 >잎>꽃>종자의 순서로 나타났고, 칡에서 가장 함량이 많은 puerarin의 경우도 뿌리>줄기>잎>꽃> 종자 순서로 함유되어 있었다.
- , MA, USA)으로 적합화하였다. 효율(efficiency; % maximal value) 및 효능(potency; EG。)은 적합함수로부터 구하였다.
대상 데이터
- Louis, MCB에서 구입하였다. Formononetiri은 IndofinetSomerville, NJ, US/U에서 구입하였다. Reporter gene을 가지고 있는 plasmid(TK Luciferase)^ Clontech(Palof Alto, CA)에서 구입하였고, neomycin 저항성 유전자를 가지고 있는 pcDNA3.
- Louis, MCB에서 구입하였다. Formononetiri은 IndofinetSomerville, NJ, US/U에서 구입하였다.
- Restriction endonuclease, DNA modifying enzymes, enhanced chemil- uminoscence(ECL) reagent^ Amersham( Arlington Island, NY)에서 구입하였고, luciferase는 Promega(Madison, WI)에서 구입하였다. Mammalian cell culture media와 항생제 G418은 Gibco BRL(Grand Island, NY)에서 구입하였다.
- Formononetiri은 IndofinetSomerville, NJ, US/U에서 구입하였다. Reporter gene을 가지고 있는 plasmid(TK Luciferase)^ Clontech(Palof Alto, CA)에서 구입하였고, neomycin 저항성 유전자를 가지고 있는 pcDNA3.1 (+)은 Invitrogene(Carlsbad, CA) 에서 구입하였다. Restriction endonuclease, DNA modifying enzymes, enhanced chemil- uminoscence(ECL) reagent^ Amersham( Arlington Island, NY)에서 구입하였고, luciferase는 Promega(Madison, WI)에서 구입하였다.
- 1 (+)은 Invitrogene(Carlsbad, CA) 에서 구입하였다. Restriction endonuclease, DNA modifying enzymes, enhanced chemil- uminoscence(ECL) reagent^ Amersham( Arlington Island, NY)에서 구입하였고, luciferase는 Promega(Madison, WI)에서 구입하였다. Mammalian cell culture media와 항생제 G418은 Gibco BRL(Grand Island, NY)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 칡은 울산, 경상북도 풍기, 충청북도 제천, 전라남도 목포, 경기도 포천, 강원도 태백 등 지역별로 직접 채취한 것을 사용하였다.
이론/모형
- 사람의 유방암 세포(MCF-7)를 배양(10X1(/) 하여 calcium phosphate coprecipitation method(Lee 등, 1995)로 pTK- ERE 30㎍과 pcDNA 3.1(+) 3 职을 세포 내로 transfection 중!"였다. Selection marker를 갖는 다른 벡터 (neomycin저 항성 유전자를 가지고 있는 pcDNA3.
- Phytocherrdcal들의 에스트로겐성은 estrogen receptor de pendent transcriptional expression assay 시스템을 이용하여 측정하였다. Fig.
성능/효과
- Fig. 1에서 보는 바와 같이 본 연구에서 사용한 luciferase reporter gene을 transfect킨 stable cell line(MCF 7-ERE)이 176-estradiol에 용량-의존적으로 반응함을 보여주었다. 또한 9종의 phytochemicals에 대해서도 용량-의존적으로 반응하였다.
- 평가하였다. Phytochemical 함량을 분석한 결과 칡의 대표적 에스트로겐성 물질인 daidzein의 경우, 뿌리>줄기 >잎>꽃>종자의 순서로 나타났고, 칡에서 가장 함량이 많은 puerarin의 경우도 뿌리>줄기>잎>꽃> 종자 순서로 함유되어 있었다. Phytochemical들의 에스트로겐 활성도 측정 결과 효능(potency)은 daidzein>genistein>>biochanin A> formononetin>puerarin>genistin >> glycitein = daidzin = glycitin 순이었다.
- Phytochemical 함량을 분석한 결과 칡의 대표적 에스트로겐성 물질인 daidzein의 경우, 뿌리>줄기 >잎>꽃>종자의 순서로 나타났고, 칡에서 가장 함량이 많은 puerarin의 경우도 뿌리>줄기>잎>꽃> 종자 순서로 함유되어 있었다. Phytochemical들의 에스트로겐 활성도 측정 결과 효능(potency)은 daidzein>genistein>>biochanin A> formononetin>puerarin>genistin >> glycitein = daidzin = glycitin 순이었다. 17β-estradiol에 대한 1 uM에서의 상대 효율(relative efficiency)은 genistein>biochanin A>daidzein >genistin>formononetin>puerarin » glycitein = daidzin = glycitin 순이었다.
- 있었다. 또한 estrogen receptor dependent transcriptional expres sion assay를 이용하여 이들의 에스트로겐 활성을 평가한 결과, 그 효능에서 는 daidzein, genistein0] 가장 강력하였고, 효율은 genistien이 가장 높았으며, biochanin A, formononetin, dadizein 순 으로 높았다. 칡의 부위별 에스트로겐성을 측정한 결과 뿌리에서 가장 높게 나타났고 줄기, 잎, 꽃, 열매 등에서도 에스트로겐성이 나타났다.
- 이러 한 차 이 는 사용한 세포 및 세 포에서의 uptake, 대사 등의 차이에 기인한다고 할 수 있다. 본 연구 결과 daidzein, genistein, glycitin의 배당체인 genistin, daidzin, glycitein 등이 transactivation 활성을 증가시켰다. 배당체가 체내 위장관에서 흡수되는지에 대해서는 논란이 많은데, Piskula 등(27)은 실험쥐의 위장에서 daidzein 과 genistein은 흡수되지만, daidzin과 genistin은 흡수되지 않는다고 주장하였고, 반대로 Hollman과 Katan(28)은 양파에 있는 quercetin rutinoside가 인체 에서 그 aglycone인 quercetin보다 더 잘 흡수됨을 보고하기도 하였다.
- 2는 칡을 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 등 부위별로 에스트로겐성을 산가수분해 샘플(H)과 가수분해하지 않은 샘플 (N)에 대해 estrogen receptor dependent transcriptional expression assay 시스템을 이용하여 측정한 결과이다. 산 가수분해 샘플(H)에서는 뿌리에서 가장 높게 나타났고 줄기 에서도 높은 에스트로겐 활성을 나타냈으며 잎, 꽃, 열매 등에서도 에스트로겐성이 나타났다. 가수 분해하지 않은 샘플(N) 에서도 가수분해한 샘플과 비슷한 경향을 보여주었다.
- 효능(potency)은 수용체에 대한 친화성 (affinity) 및 수용체를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 능력과 연관이 있다(24, 25).시험한 phytochemicals 중에서 daidzein(4.9 X 10 & M)과 genistein(5.6 × 10 * m)의 효능이 가장 컸는데, 17P-estradiol(7.3xl012 M)과 비교하여 각각 1.5 × 10 *배, 1.3x10-4 배였다. 그 다음으로 biochanin A, formon onetin, puerarin, genistin 순이었는데, 이들은 17β-estradiol 과 비교하여 1.
- 또한 9종의 phytochemicals에 대해서도 용량-의존적으로 반응하였다. 이는 MCF7-ERE 시스템이 에스트로겐성 평가에 적합하게 적용될 수 있음을 보여주고 있다.즉, yeastbased estrogen receptor assay에서는 17(3-estradiol에 대한 ECso 이 2.
- 또한 지역별로도 칡의 에스트로겐성에서 차이를 보였다 : Mokpo>Ulsan> Je- cheon>Pochon>Taebaek>Punggi. 이상의 결과 칡에는 다양한 에스트로겐성 물질이 다량 함유되어 있으며, 뿌리 에 가장 많고, 줄기 등다른 부위에도 함유되어 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 연구결과 한국산 칡에는 에스트로겐성이 큰 puerarin, daidzein, genistein이 다량 함유되 어 있으며 , 뿌리뿐 아니라 줄기, 잎, 꽃, 씨 등에도 함유되어 있음을 알 수 있었다. 또한 estrogen receptor dependent transcriptional expres sion assay를 이용하여 이들의 에스트로겐 활성을 평가한 결과, 그 효능에서 는 daidzein, genistein0] 가장 강력하였고, 효율은 genistien이 가장 높았으며, biochanin A, formononetin, dadizein 순 으로 높았다.
- 이는 MCF7-ERE 시스템이 에스트로겐성 평가에 적합하게 적용될 수 있음을 보여주고 있다.즉, yeastbased estrogen receptor assay에서는 17(3-estradiol에 대한 ECso 이 2.3X10 10 M이었는데(17), 반면에 본 assay 시스템에서는 ECso이 7.3X10 12 M이 므로 본 시스템이 더 민감하게 반응함을 알 수 있다.
- 칡의 부위별 에스트로겐성 분석 결과, 뿌리에서 에스트로겐성이 가장 높게 나타났고, 줄기, 잎, 꽃, 열매 등에서도 에스트로겐성이 확인되었다. 이는 Table 1에서 에스트로겐성 phytochemical들의 함량이 뿌리에서 가장 높은 결과와 일치한다.
- 또한 estrogen receptor dependent transcriptional expres sion assay를 이용하여 이들의 에스트로겐 활성을 평가한 결과, 그 효능에서 는 daidzein, genistein0] 가장 강력하였고, 효율은 genistien이 가장 높았으며, biochanin A, formononetin, dadizein 순 으로 높았다. 칡의 부위별 에스트로겐성을 측정한 결과 뿌리에서 가장 높게 나타났고 줄기, 잎, 꽃, 열매 등에서도 에스트로겐성이 나타났다.
- 3x10*배였다. 효율은 genistien이 가장 높았고, biochanin A, formononetin, dadizein 순으로 높았다. 그■러나 phytochemicals의 에스트로겐성 효능과 효율은 세포 및 시스템에 따라 다소 다른 결과를 보여 준다.
후속연구
- 채취 지역에 따른 칡의 에스트로겐성 분석 결과 지역별로 다소간의 차이를 나타냈지만, 이 결과는 칡의 채취 시기, 성장 정도, 건조방법 등 많은 요인에 의한 것으로 사료되며, 이에 대한 충분한 연구가 필요하다고 사료된다.
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