본 연구는 녹차의 혈중 콜레스테롤 저하 효과 및 녹차 추출물인 catechin과 EGCG가 hypocholesterolemic 효과에 미치는 정도를 식이로 고콜레스테롤혈증을 유도한 흰쥐에서 평가하고자 수행하였다. 4주령의 수컷 SD계 흰쥐를 난괴법에 따라 각 군당 5마리씩 무녹차섭취군(대조군), 4% 녹차분말군(GTP), 1% 녹차 catechin군(Catechin),0.5% 녹차 EGCG군(EGCG)의 4군으로 7주간 사육을 하였다. 녹차 첨가군은 모두 0.5% EGCG를 함유하도록 녹차 첨가량을 결정하였으며 모든 식이는 고콜레스테롤혈증을 유도하기 위하여 1% cholesterol과 0.5% cholic acid를 첨가하였다. 식이섭취량은 각 군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 혈청 총 및 LDL-콜레스테롤 수준은 Catechin군이 189.2 mg/dL, 166 mg/dL, EGCG군에서는 161.4 mg/dL, 138 mg/dL로 나타나 대조군(245 mg/dL, 222 mg/dL)에 비하여 유의적으로 감소되었고 (p<0.05), EGCG군에서 그 효과는 더욱 크게 나타났다. 혈청의 중성지방농도는 녹차섭취군이 대조군보다 낮았으며 EGCG군에서 가장 낮게 나타났다. HDL-콜레스테롤 수준은 유의적이지는 않았지만 녹차섭취군이 대조군보다 높은 경향을 보였고, HDL/LDL-콜레스테롤 비율은 대조군에 비하여 녹차섭취군에서 증가하여 EGCG군에서 가장 높았다. 이와 같은 결과는 녹차의 섭취가 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소하고, HDL-콜레스테롤은 증가시킴으로써 동맥경화 위험을 줄일 수 있는 가능성을 반영하고 있다. 간에서의 CYP7Al활성과 유전자 발현정도는 Catechin군, EGCG군이 대조군에 비하여 높게 나타났으며, EGCG군에서 가장 많이 증가하여 혈청에서의 지질수준 감소 경향과 일치하였다. 이상의 본 연구 결과들은 녹차 섭취군에서의 혈중 콜레스테롤 저하작용 특히 EGCG군에서의 현저한 hypocholesterolemic 효과는 CYP7Al 유전자 발현 및 효소의 활성증가에 따른 콜레스테롤의 담즙산으로의 배설 증가에 기인하는 것으로 추측된다.
본 연구는 녹차의 혈중 콜레스테롤 저하 효과 및 녹차 추출물인 catechin과 EGCG가 hypocholesterolemic 효과에 미치는 정도를 식이로 고콜레스테롤혈증을 유도한 흰쥐에서 평가하고자 수행하였다. 4주령의 수컷 SD계 흰쥐를 난괴법에 따라 각 군당 5마리씩 무녹차섭취군(대조군), 4% 녹차분말군(GTP), 1% 녹차 catechin군(Catechin),0.5% 녹차 EGCG군(EGCG)의 4군으로 7주간 사육을 하였다. 녹차 첨가군은 모두 0.5% EGCG를 함유하도록 녹차 첨가량을 결정하였으며 모든 식이는 고콜레스테롤혈증을 유도하기 위하여 1% cholesterol과 0.5% cholic acid를 첨가하였다. 식이섭취량은 각 군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 혈청 총 및 LDL-콜레스테롤 수준은 Catechin군이 189.2 mg/dL, 166 mg/dL, EGCG군에서는 161.4 mg/dL, 138 mg/dL로 나타나 대조군(245 mg/dL, 222 mg/dL)에 비하여 유의적으로 감소되었고 (p<0.05), EGCG군에서 그 효과는 더욱 크게 나타났다. 혈청의 중성지방농도는 녹차섭취군이 대조군보다 낮았으며 EGCG군에서 가장 낮게 나타났다. HDL-콜레스테롤 수준은 유의적이지는 않았지만 녹차섭취군이 대조군보다 높은 경향을 보였고, HDL/LDL-콜레스테롤 비율은 대조군에 비하여 녹차섭취군에서 증가하여 EGCG군에서 가장 높았다. 이와 같은 결과는 녹차의 섭취가 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소하고, HDL-콜레스테롤은 증가시킴으로써 동맥경화 위험을 줄일 수 있는 가능성을 반영하고 있다. 간에서의 CYP7Al활성과 유전자 발현정도는 Catechin군, EGCG군이 대조군에 비하여 높게 나타났으며, EGCG군에서 가장 많이 증가하여 혈청에서의 지질수준 감소 경향과 일치하였다. 이상의 본 연구 결과들은 녹차 섭취군에서의 혈중 콜레스테롤 저하작용 특히 EGCG군에서의 현저한 hypocholesterolemic 효과는 CYP7Al 유전자 발현 및 효소의 활성증가에 따른 콜레스테롤의 담즙산으로의 배설 증가에 기인하는 것으로 추측된다.
Green tea, which is high in polyphenols, is thought to have hypocholesterolemic effects. The present study was performed to further elucidate the hypocholesterolemic actions of green tea, specially the catechin and (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) for their effects on the diet-induced hypercholes...
Green tea, which is high in polyphenols, is thought to have hypocholesterolemic effects. The present study was performed to further elucidate the hypocholesterolemic actions of green tea, specially the catechin and (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) for their effects on the diet-induced hypercholesterolemia in rats. Male Sprague-Dawley rats were fed with green tea-free diet (control), diets containing 4% green tea powder (GTP), 1.0% green tea catechin (catechin) or 0.5% epigallocatechin gallate (EGCG) for 7 wks. All diets that were provided green tea contained approximately 0.5% EGCG Hypercholesterolemia was induced by adding 1% cholesterol and 0.5% cholic acid to all diets. There were no differences in food intake among groups. The green tea treatments showed significant improvement in the serum levels of total cholesterol, LDL-cholesterol, triacylglycerides and atherogenic index in the following order; EGCG>Catechin>GTP (p<0.05). The serum HDL-cholesterol level was highest in the EGCG-treated group. The catechin or EGCG diet up-regulated by 5 times the enzyme activity of hepatic cholesterol 7$\alpha$ -hydroxylase (CYP7Al) compared to control diet (p<0.05). Hepatic CYP7Al mRNA level paralleled tile increases in the CYP7Al activity. These results suggest that the EGCG in the green tea may account for the hypocholesterolemic effect by the induction of CYP7Al gene expression.
Green tea, which is high in polyphenols, is thought to have hypocholesterolemic effects. The present study was performed to further elucidate the hypocholesterolemic actions of green tea, specially the catechin and (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) for their effects on the diet-induced hypercholesterolemia in rats. Male Sprague-Dawley rats were fed with green tea-free diet (control), diets containing 4% green tea powder (GTP), 1.0% green tea catechin (catechin) or 0.5% epigallocatechin gallate (EGCG) for 7 wks. All diets that were provided green tea contained approximately 0.5% EGCG Hypercholesterolemia was induced by adding 1% cholesterol and 0.5% cholic acid to all diets. There were no differences in food intake among groups. The green tea treatments showed significant improvement in the serum levels of total cholesterol, LDL-cholesterol, triacylglycerides and atherogenic index in the following order; EGCG>Catechin>GTP (p<0.05). The serum HDL-cholesterol level was highest in the EGCG-treated group. The catechin or EGCG diet up-regulated by 5 times the enzyme activity of hepatic cholesterol 7$\alpha$ -hydroxylase (CYP7Al) compared to control diet (p<0.05). Hepatic CYP7Al mRNA level paralleled tile increases in the CYP7Al activity. These results suggest that the EGCG in the green tea may account for the hypocholesterolemic effect by the induction of CYP7Al gene expression.
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문제 정의
본 연구는 녹차의 혈중 콜레스테롤 저하 효과 및 녹차 추출물인 catechin과 EGCG가 hypocholesterolemic 효과에 미 치는 정도를 식이로 고콜레스테롤혈증을 유도한 흰쥐에서 평가하고자 수행하였다. 4주령의 수컷 SD계 흰쥐를 난괴 법에 따라 각 군당 5마리씩 무녹차섭취군(대조군), 4% 녹차 분 말군(GTP), 1% 녹차 catechin군(Catechin), 0.
효소 활성 에 의하여 조절된다(22). 본 연구에서 는 실험 동물 식 이에 녹차 및 녹차 추출물의 첨 가가 동맥경화의 주요 위 험 인자 중의 하나인 콜레스테롤 대사에 미 치는 영향과 그 기전을 규명하기 위하여 녹차 섭취시 CYP7A1 효소의 활성 및 유전자 발현을 측정하여, 녹차의 콜레스테롤 저하기 전을 CYP7A1 유전자 발현 측면에서 살펴보고자 하였다.
가설 설정
1)Diets were AIN-76 semipurified, and given in powdered form.
2)NS: not significant.
2)Values in a column with different superscripts are significantly different, p<0.05.
3)NS: not significant.
제안 방법
수행하였다. 4주령의 수컷 SD계 흰쥐를 난괴 법에 따라 각 군당 5마리씩 무녹차섭취군(대조군), 4% 녹차 분 말군(GTP), 1% 녹차 catechin군(Catechin), 0.5% 녹차 EGCG 군(EGCG)의 4군으로 7주간 사육을 하였다. 녹차 첨가 군은 모두 0.
확인된 클로닝 벡터는 EndoFree Plasmid kits (QIAGEN, Germany)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하였다. 간조직 에서의 total RNA을 guanidium을 이용하여 추출하였다(26). 분리한 RNA는 formaldehyde# 이용한 RNA의 depasturing gel electrophoresis를 실 시 하고, denatured RNA 를 nitro-cellulose filter(Hybond-N+, Amersham)에 trans fere} 후, P32-random primed cDNA probe를 첨가하여 Northern hybridization과정을 행하였다.
고콜레스테롤혈증을 유도하기 위하여 모든 식이는 1% 콜레스테롤과 0.5% cholic acid를 첨가하여 조제하였다.
5% 녹차 EGCG 군(EGCG)의 4군으로 7주간 사육을 하였다. 녹차 첨가 군은 모두 0.5% EGCG를 함유하도록 녹차 첨가량을 결정 하였으며 모든 식이는 고콜레스테롤혈증을 유도하기 위하여 1% cholesterol과 0.5% cholic acid를 첨 가하였다. 식 이 섭 취 량은각 군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
녹차첨가군은 모두 0.5% EGCG를 함유하는 양으로 계산하여 무첨가군(Control), 4% 녹차분말군(GTP), 1% 녹차 catechin군(Catechin), 0.5% 녹차 EGCG군(EGCG)의 4군으로 나누었다.
간조직 에서의 total RNA을 guanidium을 이용하여 추출하였다(26). 분리한 RNA는 formaldehyde# 이용한 RNA의 depasturing gel electrophoresis를 실 시 하고, denatured RNA 를 nitro-cellulose filter(Hybond-N+, Amersham)에 trans fere} 후, P32-random primed cDNA probe를 첨가하여 Northern hybridization과정을 행하였다. -70℃에서 membrane을 X-ray film에 16~24시간 노줄시켜 현상하여 autoradiography!- 하였다.
원심분리(1,500xg, 10분)한 후 동위원소 표지된 cholesterol을 chloroform으로 2회 추출하였다. 상층액 1 mL 을 scintillation counter(COBRA Ⅱ, A Packard Bioscience Company, USA)에서 radioactivity를 측정하였다.
생 후 4주령 의 male Sprague-Dawley rats(SLC, Japan)을동물사육실(실내온도 22±2℃, 상대습도 55 + 5%, 12 hour light-dark cycle)에서 물과 AIN-76 diet(Harlan Teklad, Madison, USA)(23)를 제한없이 먹이면서 일주일간 환경에 적응시켰다. 적응 기간 후 체중에 따른 난괴법으로 5마리씩 4군으로 나누어 각 군의 식이를 ad-libitum으로 7주간 사육하였다.
37℃ 에서 30분간 반응시 킨 후 20% TCA 6 mL을 가하여 반응을 중지시켰다. 원심분리(1,500xg, 10분)한 후 동위원소 표지된 cholesterol을 chloroform으로 2회 추출하였다. 상층액 1 mL 을 scintillation counter(COBRA Ⅱ, A Packard Bioscience Company, USA)에서 radioactivity를 측정하였다.
적응 기간 후 체중에 따른 난괴법으로 5마리씩 4군으로 나누어 각 군의 식이를 ad-libitum으로 7주간 사육하였다.
간으로부터 조제한 microsomee 효소 활성 측정 직전에 가용화하여 Hiroaki 등(25)의 방법으로 측정 하였다. 즉, 가용화한 microsomal protein 2 mg/mL 2 mL 에 최 종농도 0.1 M potassium phosphate buffertpH 7.4), 0.1 mM EDTA, 50 mM NaF, 2 mM NADPH, 20 mM cysteamine, 200 11M cholesterol, 1.5 mg/mL Tween 80, 6 uCi [7(n)-H3] cholesterol (Amersham, UK)을 첨 가하였다. 37℃ 에서 30분간 반응시 킨 후 20% TCA 6 mL을 가하여 반응을 중지시켰다.
확인된 클로닝 벡터는 EndoFree Plasmid kits (QIAGEN, Germany)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하였다. 간조직 에서의 total RNA을 guanidium을 이용하여 추출하였다(26).
대상 데이터
본 연구에 사용한 녹차추출물(catechin과 EGCG)은 태평양기술연구원(경기도 용인 소재)에서 녹차로부터 추출한 것 (순도 80% 이 상)을, 녹차분말은 (주)태평 양 제품을 사용하였다. 녹차첨가군은 모두 0.
데이터처리
모든 실험결과는 실험군당 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치 분산분석(one -way analysis of variance)을 한 후 Duncan's multiple range test로 general linear model (GLM)을 이용하여 p<0.05수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
혈청의 총콜레스테롤, 중성지질 및 HDL-콜레스테롤 정량은 효소비 색법을 이용한 kit(Sigma, USA)를 사용하여 분석하였匸" LDL 콜레스테롤 함량은 Friedewalde 공식(24)를 이용하여 구하였다.
분리하였다. 간으로부터 조제한 microsomee 효소 활성 측정 직전에 가용화하여 Hiroaki 등(25)의 방법으로 측정 하였다. 즉, 가용화한 microsomal protein 2 mg/mL 2 mL 에 최 종농도 0.
간조직 은 teflon pestle01 달린 Potter- Elvehjem homogenizer를 이용하여 균질화하고 microsomee 차별원심 분리법으로 분리하였다. 간으로부터 조제한 microsomee 효소 활성 측정 직전에 가용화하여 Hiroaki 등(25)의 방법으로 측정 하였다.
성능/효과
3)Values in a column with different superscripts are significantly different, p<0.05.
녹차섭 취군에서 CYRWJ의 높은 활성증가가 나타났으며 특히 Catechin과 EGCG군은 대조군에 비하여 5배 가량 증가하였다. CYP7A1 mRNA 유전자 발현정도에서는 Catechin군과 EGCG 군에서 발현이 증가하였으며, 효소활성 증가와 유사하게 EGCG 군에서 가장 높은 발현을 보였다. Yang과 Koo(17)의 연구에서는 고콜레스테롤 식이를 한 흰쥐에 2% catechin 급여는 cholesterol 7 a -hydroxylase 활성 에서 유의 적 인 효과가 없 었으나 4% Catechin군에서는 분변으로 답즙산과 콜레스테롤 배설이 증가하였는데 이는 간에서의 CYP7A1 활성증가에 기인한 것이라고 보고하였다.
를 측정한 결과는 Table 3과 같다. Catechin, EGCG 군에서 혈청 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 중성지방함량이 유의적으로 감소되었다(p<Q.05). 녹차섭취에 따른 혈청내 지질 수준의 감소 효과는 EGCG>Catechin>GTP군의 순으로 나타났다.
혈청의 중성 지 방농도는 녹차섭 취 군이 대 조군보다 낮았으며 EGCG 군에서 가장 낮게 나타났다. HDL-콜레스테롤 수준은 유의적이지는 않았지만 녹차섭취군이 대조군보다 높은 경향을 보였고, HDL/LDL-콜레스테롤 비율은 대조군에 비하여 녹차 섭취 군에서 증가하여 EGCG군에서 가장 높았다. 이와 같은 결과는 녹차의 섭취가 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소하고, HDL-콜레스테롤은 증가시킴으로써 동맥경화 위험을 줄일 수 있는 가능성을 반영하고 있다.
이와 같은 결과는 녹차의 섭취가 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소하고, HDL-콜레스테롤은 증가시킴으로써 동맥경화 위험을 줄일 수 있는 가능성을 반영하고 있다. 간에서의 CYP7A1 활성 과 유전자 발현정도는 Catechin군, EGCG군이 대조군에 비하여 높게 나타났으며, EGCG군에서 가장 많이 증가하여 혈청에서의 지질수준 감소 경향과 일치하였다. 이상의 본 연구 결과들은 녹차 섭취군에서의 혈중 콜레스테롤 저하작용 특히 EGCG군에서의 현저한 hypocholesterolemic 효과는 CYP7A1 유전자 발현 및 효소의 활성증가에 따른 콜레스테롤의 담즙산으로의 배설 증가에 기인하는 것으로 추측된다.
1, 2와 같다. 녹차섭 취군에서 CYRWJ의 높은 활성증가가 나타났으며 특히 Catechin과 EGCG군은 대조군에 비하여 5배 가량 증가하였다. CYP7A1 mRNA 유전자 발현정도에서는 Catechin군과 EGCG 군에서 발현이 증가하였으며, 효소활성 증가와 유사하게 EGCG 군에서 가장 높은 발현을 보였다.
Matsuda 등(30)이 고지방 식이를 섭취한 mice를 대상으로 tea catechins이 혈청 지질에 미치는 영향 연구에서 (-) -EGCG와 (-)-ECG의 경구투여가 혈청과 간의 콜레스테롤을 유의적으로 감소시켰음을 보고하였다. 동맥경화를 개선시켜주는 요인으로 알려져 있는 HDL-콜레스테롤함량은 본 실험 에서 군간에 유의적인 차이는 없었으나 EGCG군에서 다소 증가하였으며 HDL/LDL 비는 모든 녹차 첨 가군에서 증가하여 EGCG군에서 가장 큰 효과를 나타내었다. HDL은 말초조직으로부터 과잉의 콜레스테롤을 간으로 이동시키고 거품세포형 성을 방해하여 동맥 경 화의 진행과정을 늦추는 역 할을 하는 것으로 알려져 있다(31).
또한 HDL/U) Lf콜레스테롤비율은 동맥경 화에 의한 사망률과 높은 관계가 있고 발생위험을 예측하여 적절한 조치를 취하는 유용한 지표로 사용되므로(32) 본 실험의 결과로 녹차의 섭취가 식이로 고콜레스테롤을 유도한 경우에도 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤을 감소시키고 HDL-콜레스테롤을 상승시키는 결과를 가져와 심장순환계질환의 예방과 치료에 효과적일 것으로 사료된다. 또한, 녹차 섭취에 따른 혈중 콜레스테롤 저하효과는 주로 EGCG에 기 인하고 있음을 알 수 있었다.
간에서의 CYP7A1 활성 과 유전자 발현정도는 Catechin군, EGCG군이 대조군에 비하여 높게 나타났으며, EGCG군에서 가장 많이 증가하여 혈청에서의 지질수준 감소 경향과 일치하였다. 이상의 본 연구 결과들은 녹차 섭취군에서의 혈중 콜레스테롤 저하작용 특히 EGCG군에서의 현저한 hypocholesterolemic 효과는 CYP7A1 유전자 발현 및 효소의 활성증가에 따른 콜레스테롤의 담즙산으로의 배설 증가에 기인하는 것으로 추측된다.
식 이 섭 취 량은각 군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 혈청 총 및 LDL-콜레스테롤 수준은 Catechin군이 189.2 mg/dL, 166 mg/dL, EGCG군에서는 161.4 mg/dL, 138 mg/dL로 나타나 대조군 (245 mg/dL, 222 mg/dL) 에 비하여 유의적으로 감소되 었고 (p<0.05), EGCG군에서 그 효과는 더욱 크게 나타났다. 혈청의 중성 지 방농도는 녹차섭 취 군이 대 조군보다 낮았으며 EGCG 군에서 가장 낮게 나타났다.
후속연구
녹차의 혈중 콜레스테롤 저하 기전을 분자적 수준에서 살펴본 연구는 이 제까지 없었으므로 본 연구의 결과를 바탕으로 녹차와 녹차 성분이 CYP7A1 유전자의 전사를 조절하는 인자와 기전을 규명하는 것이 금후의 과제일 것이다.
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