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문제 정의
- 본 실험은 콩 단백질을 기 질로 단백 분해 효소를 작용시켜 저분자 peptide를 제조하여 실용적이면서도 인체에 무해한 항균제를 개발하고 식품 소재로서 사용하기 위한 기 초자료를 얻고자 수행하였다. 콩 단백질에 여러 종류의 단백질 가수 분해 효소를 가하여 반응시켜 얻어진 peptide를 분자량별로 분획 한 후 MIC (Minimum inhibitory concentration)4 첨 가 량에 따른 균의 생육도 및 항균활성을 측정하고 분자량별 활성 분획을 HPLC로 분취하여 얻어진 peptide의 항균 활성을 측정하였다.
제안 방법
- 본 실험은 콩 단백질을 기 질로 단백 분해 효소를 작용시켜 저분자 peptide를 제조하여 실용적이면서도 인체에 무해한 항균제를 개발하고 식품 소재로서 사용하기 위한 기 초자료를 얻고자 수행하였다. 콩 단백질에 여러 종류의 단백질 가수 분해 효소를 가하여 반응시켜 얻어진 peptide를 분자량별로 분획 한 후 MIC (Minimum inhibitory concentration)4 첨 가 량에 따른 균의 생육도 및 항균활성을 측정하고 분자량별 활성 분획을 HPLC로 분취하여 얻어진 peptide의 항균 활성을 측정하였다.
- 즉, 분리 콩 단백질 시료 10 g에 증류수를 약 10배 가량 가하여 균질화한 다음, 90℃의 물에서 10분간 중탕하여 살균 처리하고, 냉각시킨 후 기질 : 효소 비율이 50: l(w/w)이 되 도록 효소를 첨가하여 각 효소의 최적 반응 온도인 37℃에서 shaking water bath를 이용하여 가수분해 시 켰다. 3시 간, 6시 간, 12시 간, 24시 간마다 채 취 한 시료를 80℃에서 5분간 열 처 리하여 효소반응을 정지시킨 다음 12,000xg에서 15분간 원 심분리한 후 상징액을 취하여 사용하였다.
- 항균활성 검 색에 사용한 균주는 10 mL nutrient broth 배지 에 접종하고 37"C에서 18~24시간씩 2회 계대 배양하여 사용하였다. 항균성 시험용 평판 배지의 조제는 nutrient broth에 1.5%의 agar를 가하여 살균한 후 petri dish에 15 m止씩 분주하여 기 층 배지로 하고, 이에 0.75% agar함유 nutrient 배지를 각각 2.5 mL씩 시험관에 분주하여 멸균한 후 45℃의 수욕상에 보존 하면서 각종 시험균액 0.1 mL을 무균적으로 첨가하여 잘 혼합 한 후 기층용 배지 위에 고르게 퍼 지도록 도포한 뒤 응고시 켜 2중의 균 접종 평판배지를 만들어 사용하였다.
- 시료의 항균력 검 색은 한천배지 확산법 (disc, plate meth- od)으로 즉정하였다. 즉, 각각의 시료용액을 0.45 Pm membrane filter로 여 과하여 제 균하고, 멸균된 paper disk에 50 11L 씩을 loading하여 흡수시 킨 후 건조시 킴 을 반복하여 시 험용 평 판배지 위에 밀 착시 킨 후, 75UL의 멸균된 증류수를 paper disk 위에 떨어뜨려 확산시 킨 다음 4℃ 냉 장고에서 1 시간 방치 후 37"C incubator에서 16~24시간 배양 후 disk주변의 inhibition clear zone의 직경을 mm단위로 측정하여 비교하였다.
- 최소저 해농도(MIC: Minimum inhibitory concentration) 측정은 고체배지의 한천배지 확산법(agar diffusion method) 으로 측정 하였는데, 항균활성을 나타낸 반응물을 동결 건조 하여 이를 고형 분으로 하여 그 함량이 각각 0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 5 mg/mL이 되도록 조절한 고체배지를 petri dish에 부어 고르게 펴서 응고시 킨 후 배양된 균 현탁 액을 0.1 mL씩 접 종한 다음 37℃에서 24시간 배 양하여 육안 적으로 증식이 되지 않는 농도로 결정하였다.
- 항균활성을 나타내는 반응물을 동결건조하고, 고형 분 함 량을 각각 0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 5 mg/mL의 농도구간으로 조절한 액체배지를 준비하여 균 현탁액을 각각 0.1 mL씩 접종하고 37℃에서 배 양하여 6시간 간격으로 36시 간까지 배양한 후, 620 nm에서 흡광도를 측정하여 균 증식이 나타나지 않는 농도로 결정하였다.
- 한외여과장치 (Amicon Co.)를 사용하였으며, 여과한계량 (molecular weight cut-off, MWC0)이 각각 10, 000, 3, 000, 1,000인 membrane filter를 장착하고 질소가스로 60 psi의 압력을 가하여 한외 여 과 하고, 분리 된 각 분획의 항균활성을 측정하였다.
- Gel Permeation Chromatography(GPC)에 의해 분리된 분획 중 항균활성을 갖는 분획 을 선택하여 농축한 후, HPLC 를 이용하여 분리 하였으며, HPLC 조건은 Table 1, 2와 같다. 유출 시 간별 peak의 유출물을 수집하여 항균활성을 측정하였다.
- Gel Permeation Chromatography(GPC)에 의해 분리된 분획 중 항균활성을 갖는 분획 을 선택하여 농축한 후, HPLC 를 이용하여 분리 하였으며, HPLC 조건은 Table 1, 2와 같다. 유출 시 간별 peak의 유출물을 수집하여 항균활성을 측정하였다.
- 그래서, 가장 활성이 크다고 판단된 Asp. saitoi protease만 을 사용하여 작용 pH를 달리 하여 콩 단백질을 가수분해하였다. 10 mM glycine-HCl buffer를 사용하여 , pH를 3~7까지 조정한 다음 37℃에서 6시간 진탕 반응 시켜 얻어진 가수분 해물의 항균활성을 Staphylococcus aureus ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 10536에 대하여 측정한 결과는 다음 Table 4와 같았다.
- 항균활성을 가지는 콩 단백질 가수분해물을 용액 상태로 한 다음 항균 peptide의 열에 대한 안전성을 실험하기 위하여 80℃에서 10분간, 100℃에서 10분간, 121℃에서 15분간 각각 열처리한 후, 그람 양성균인 항균활성을 측정하여 비교한 결과는 Table 7과 같았다.
- 콩 단백 효소 가수분해물의 실용성을 검토하기 위하여 가 수분해 물을 동결 건조하여 액 체 배 지 에 일 정 농도로 첨가하여 공시균주를 접종하고 시간에 따른 생육정도를 측정한 결과는 Fig. 2, 3과 같았다.
- 콩 단백질 에 Asp. saitoi protease로 작용시 킨 가수분해 물 의 항균성 물질을 분리, 정 제하기 위하여 ultrafiltration 분 획, HPLC를 행한 결과는 다음과 같았다.
- High performance liquid chromatography : 분자량별 활성 분획 의 HPLC chromatograme Fig. 5(a, b)과 같았으며 각 peak의 유출물을 여러 차례 반복하여 분취 하고 이 의 항균 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 분리콩 단백질은 미국, IC Food사 제품을 사용하였으며 그 일반성분은 단백질이 91.5%, 지방이 0.5%, 조섬유가 0.2%, 회분이 4.0%이었다.
- Trypsin을 비 롯한 단백질 가수분해 효소는 Sigma Aldrich 사 제 품, Ultrafiltration celle Amicon사 제 품, membranee regenerated cellulose(molecular weight cut-off 10, 000 3, 000 1,000, Millipore사 제품), 항균활성 측정용 paper disc(8 mm) 는 Toyorhoshi사 제품, HPLC 용매로는 Sigma Aldrich사 제품, 기타 모든 시약은 1급 이상 제품을 사용하였다.
- 항균활성 즉정에 사용된 Gram(-) 균은 Salmonella ty- phimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC10536, Escherichia coli 0157:h7 ATCC43894이 었고 Gram( + )균은 Bacillus subtilis ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 6633, Strptococcus faecslis ATCC 13301 을 사용하였으며 항균활성 측정용 배지는 Difco사의 nutrient agar를 기층용 배 지, Mueller Hinton medium을 중층용 배 지, nutrient broth 배지는 계대 배양용 액체배지로 사용하였다.
- 항균 활성은 paper disc법 (22)으로 측정하였다. 항균활성 검 색에 사용한 균주는 10 mL nutrient broth 배지 에 접종하고 37"C에서 18~24시간씩 2회 계대 배양하여 사용하였다. 항균성 시험용 평판 배지의 조제는 nutrient broth에 1.
이론/모형
- 항균 활성은 paper disc법 (22)으로 측정하였다. 항균활성 검 색에 사용한 균주는 10 mL nutrient broth 배지 에 접종하고 37"C에서 18~24시간씩 2회 계대 배양하여 사용하였다.
- 시료의 항균력 검 색은 한천배지 확산법 (disc, plate meth- od)으로 즉정하였다. 즉, 각각의 시료용액을 0.
성능/효과
- 1에서 보는 것과 같이 분리 콩 단백질 효소 가수분해 물의 항균력은 Asp. saitoi protease로 가수분해 시 킨 것이 가장 높았으며 효소의 종류에 따른 항균활성 에 차이가 보였다. 미생물 기원의 단백질 가수분해 효소가 분리 콩 단백질에 작용하여 항균성 물질을 생산하는 것으로 보아, 콩 단백질 가수분해물은 곰팡이를 이용하는 고 단백질 함유 식품의 보존에 유용한 보존제로서의 가능성이 있을 것으로 생각되었다.
- saitoi protease로 가수분해 시 킨 것이 가장 높았으며 효소의 종류에 따른 항균활성 에 차이가 보였다. 미생물 기원의 단백질 가수분해 효소가 분리 콩 단백질에 작용하여 항균성 물질을 생산하는 것으로 보아, 콩 단백질 가수분해물은 곰팡이를 이용하는 고 단백질 함유 식품의 보존에 유용한 보존제로서의 가능성이 있을 것으로 생각되었다.
- 1) Escherichia coli ATCC 10536, EHeEscherichia coli 0157- H7 ATCC 43894, SA-Staphylococcus aureus ATCC 6633, SF= Streptococcus faecalis ATCC 13301, BS=Bacillus subtilis ATCC 11778, ST=Salmonella typhimurium ATCC 14028.
- pH - 5가지 다른 종류의 pmtease를 사용하여 분리 콩 단 백질을 가수분해 한 결과 Asp. saitoi protease를 사용한 분 리 콩 단백질 가수분해물의 항균력이 가장 큰 결과를 얻었다. 그래서, 가장 활성이 크다고 판단된 Asp.
- saitoi protease의 제조사 제품 설명서를 따르면, Asp saitoi protease는 37℃의 최적 온도와 약 3의 최적 pH를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 실험 결과, 최적 pH를 벗어 난 범위인 pH 6에서 최고의 향균활성을 나타내었으며 pH 3보다 pH가 높은 쪽의 항균력이 높았다.
- Manachini 등(23)의 Bac. licheniformis protease가 50~ 60"C에서 잘 작용한다는 보고와 비교해 볼 때, 효소의 종류 에 따른 작용 최적 온도가 각기 다름을 알 수 있었다.
- 7, 37℃에서 진탕 반응시키면서 반응 시간에 따른 항균활성을 측정한 결과는 Table 6과 같았다. 두 균주 모두 시간이 경과할수록 항균활성이 증가하였으며 12~24시간 반응시켰 을 때가 제일 높은 항균활성을 보였다.
- 콩 단백질을 가수분해하였을 때 생산되는 항균성 peptide 의 열에 대한 안정성을 실험해 본 결과, 열에 대해 대단히 안정 함을 알 수 있었다. 즉, 100℃에서 10 min의 열처리와 121℃ 에서 15 min 열처리에 의해서도 두 균주의 생육 저해환의 크기가 대 조구와 비슷한 것으로 보아 콩 단백 질의 Asp.
- 분자량 1,000 이 하의 fractione 3, 000 이 하의 fraction보다 항균활성이 작았으므로 콩 단백질 가수분해물의 항균활성 peptide는 그 분자량이 분자량 1,000 이상 3, 000 이하임을 알 수 있었다. 또한, 각 분획물의 수율은 효소반응 원액이 반응 기질에 대하여 56.
- 분자량 1,000 이 하의 fractione 3, 000 이 하의 fraction보다 항균활성이 작았으므로 콩 단백질 가수분해물의 항균활성 peptide는 그 분자량이 분자량 1,000 이상 3, 000 이하임을 알 수 있었다. 또한, 각 분획물의 수율은 효소반응 원액이 반응 기질에 대하여 56.8%, 분자량 10, 000 이하의 분획물이 32.6%, 분자량 3, 000 이하 분획 물이 26.3%, 분자량 1,000 이하 분획 물이 20.5%로서 비교적 높은 수준이었다.
- 액체배지에서 측정한 최소저해농도와 비슷한 수준인 <0.8 mg/mL 의 농도에서 균의 증식을 억 제하는 결과를 보 였으며, 그람 양성, 음성 모든 균주에 대해서 생장을 저해하는 것으로 보였다.
후속연구
- 본 실험의 결과는 값이 저렴한 식물성 단백질과 미생물 기원의 protease를 이용하여 항균성 peptide를 생산하는데 기초 연구자료로서 활용될 것이며, 분리 콩 단백질 가수분해 물의 항균성에 대한 지금까지 타 연구자들의 연구 시도가 이루어진 버}.가 없어 연구 결과의 비교가 어려웠다.
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