충북지역 토마토 시설재배지의 풋마름병균(Ralstonia solanacearum) 오염도 및 분리균주의 특성 Contamination Level of Ralstonia solanacearum in Soil of Greenhouses Cultivating tomato Plants in Chungbuk Province and Characteristics of the Isolates원문보기
충북지역 토마토 시설재배지 토양의 풋마름병 병원균(Ralstonia solanaceaum)의 오염도 및 분리균의 특성을 조사하였다. 총 133개 조사 토양 중 27개 토양에서 선택배지로부터 R. solanacearum이 분리되어, 전체 시설재배지 토양의 20.3%가 풋마름병균에 오염되어 있음을 나타냈다. 오염 토양에서 병원균의 밀도는 토양 g당 $10^{2.4}$ cfu로 조사되었다. 병든 토마토로부터 분리한 12균주를 포함한 총 71개의 분리균주는 모두 레이스 1이었고, 35개 균주가 생리형 3으로, 36개 균주가 생리형 4로 구분되었다. 전체 분리균의 88% 이상이 각각 oxolinic acid 0.5$\mu\textrm{g}$/ml, streptomycin 25 $\mu\textrm{g}$/ml, tetracycline 5 $\mu\textrm{g}$/ml and cupric sulfate 375 $\mu\textrm{g}$ml(1.5 mM)을 함유한 nutrient agar에서 생장이 억제되었고, 전체균주의 11.3%, 4.2% and 5.6%가 각각 감수성균주의 최소억제농도보다 10배 이상의 oxolinic acid, streptomycin, tetracycline가 함유된 배지에서 생장하였다. 5개 균주는 2개의 살세균제에 동시에 그리고 1개 균주는 3개의 살세균제 모두에 저항성을 보였다.
충북지역 토마토 시설재배지 토양의 풋마름병 병원균(Ralstonia solanaceaum)의 오염도 및 분리균의 특성을 조사하였다. 총 133개 조사 토양 중 27개 토양에서 선택배지로부터 R. solanacearum이 분리되어, 전체 시설재배지 토양의 20.3%가 풋마름병균에 오염되어 있음을 나타냈다. 오염 토양에서 병원균의 밀도는 토양 g당 $10^{2.4}$ cfu로 조사되었다. 병든 토마토로부터 분리한 12균주를 포함한 총 71개의 분리균주는 모두 레이스 1이었고, 35개 균주가 생리형 3으로, 36개 균주가 생리형 4로 구분되었다. 전체 분리균의 88% 이상이 각각 oxolinic acid 0.5$\mu\textrm{g}$/ml, streptomycin 25 $\mu\textrm{g}$/ml, tetracycline 5 $\mu\textrm{g}$/ml and cupric sulfate 375 $\mu\textrm{g}$ml(1.5 mM)을 함유한 nutrient agar에서 생장이 억제되었고, 전체균주의 11.3%, 4.2% and 5.6%가 각각 감수성균주의 최소억제농도보다 10배 이상의 oxolinic acid, streptomycin, tetracycline가 함유된 배지에서 생장하였다. 5개 균주는 2개의 살세균제에 동시에 그리고 1개 균주는 3개의 살세균제 모두에 저항성을 보였다.
Contamination level and characteristics of Ralstonia solanacearum in soil of greenhouses cultivating tomato plants in Chungbuk province was determined. R. solanacearum was isolated with the semiselective media in 27 greenhouse soil samples out of 133 greenhouses soil investigated, which indicates 20...
Contamination level and characteristics of Ralstonia solanacearum in soil of greenhouses cultivating tomato plants in Chungbuk province was determined. R. solanacearum was isolated with the semiselective media in 27 greenhouse soil samples out of 133 greenhouses soil investigated, which indicates 20.3 ％ of tomato cultivating greenhouses in Chungbuk contaminated with the bacterial wilt pathogen. Density of R. solanacearum was estimated to 10$^{2.4}$ cfu/g in the contaminated soil. All 71 isolates of R. solanacearum which containing 12 isolates from the diseased tomato plants were race 1, ann 35 isolates of them were biovar 3 and 36 isolates were biovar 4. More than 88％ of 71 isolates were inhibited growth on nutrient agar containing oxolinic acid 0.5 $\mu\textrm{g}$/ml, streptomycin 25 $\mu\textrm{g}$/ml, tetracycline 5 $\mu\textrm{g}$/ml and cupric sulfate 375 $\mu\textrm{g}$/ml (1.5 mM). The 11.3％, 4.2％ and 5.6 ％ of the isolates can grow on nutrient agar containing 10 times more oxolinic acid, streptomycin, tetracycline than minimal inhibitory concentration of the sensitive strains. Five isolates were resistant to 2 bactericides and one isolates was resistant to all 3 bactericides.
Contamination level and characteristics of Ralstonia solanacearum in soil of greenhouses cultivating tomato plants in Chungbuk province was determined. R. solanacearum was isolated with the semiselective media in 27 greenhouse soil samples out of 133 greenhouses soil investigated, which indicates 20.3 ％ of tomato cultivating greenhouses in Chungbuk contaminated with the bacterial wilt pathogen. Density of R. solanacearum was estimated to 10$^{2.4}$ cfu/g in the contaminated soil. All 71 isolates of R. solanacearum which containing 12 isolates from the diseased tomato plants were race 1, ann 35 isolates of them were biovar 3 and 36 isolates were biovar 4. More than 88％ of 71 isolates were inhibited growth on nutrient agar containing oxolinic acid 0.5 $\mu\textrm{g}$/ml, streptomycin 25 $\mu\textrm{g}$/ml, tetracycline 5 $\mu\textrm{g}$/ml and cupric sulfate 375 $\mu\textrm{g}$/ml (1.5 mM). The 11.3％, 4.2％ and 5.6 ％ of the isolates can grow on nutrient agar containing 10 times more oxolinic acid, streptomycin, tetracycline than minimal inhibitory concentration of the sensitive strains. Five isolates were resistant to 2 bactericides and one isolates was resistant to all 3 bactericides.
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제안 방법
) 그리고 tetracycline (Sigma Chemical Co)> 첨가하여 원하는 농도의 살세균제 배지를 만들었 다. NA에서 하룻밤 배양한 분리균을 멸균수로 현탁한 후 현탁액의 흡광도를 600nm = 0.1 로 조정하였다. 이 현탁 액 3 를 살세균제배지에 점적하고 건조시킨후 25-28℃ 배양기에 3일간 배양한 후 세균의 생장여부를 조사하여최 소생 장억 제 농도(MIC: minimal inhibitory concentration)를 조사하였다.
살세균제 최소억제농도(MIC) 결정. 멸균한 nutrient agar (NA: beef extract 3 g, peptone 5 g, agar 15 g/1 /)를 50- 55℃로 식힌 후 cupric sulfate (CuSO4 - 5H2O, Sigma Chemical Co.), oxolinic acid (Sigma Chemical Co.), streptomycin (Sigma Chemical Co.) 그리고 tetracycline (Sigma Chemical Co)> 첨가하여 원하는 농도의 살세균제 배지를 만들었 다. NA에서 하룻밤 배양한 분리균을 멸균수로 현탁한 후 현탁액의 흡광도를 600nm = 0.
배양 3일 후에 M-SMSA에 나타난 전형적인 R. solanacearum 콜로니를 세고, 콜로니 중 하나를 TTC배지에 다시 streak하여 순수배양하여 초저온냉동고(-70℃)에 저 장하였다. 분리균의 병원성은 토마토 유묘(품종: 서광 102) 의 잎자루에 상처접종하여 확인하였다.
본 연구에서는 충북지역의 토마토 시설재배지 토양에서 선택배지를 이용하여 풋마름병균 R. solanacearum를 분리하고, 분리균의 병원성 확인을 통하여 오염도를 파악 하였고, 분리균의 레이스와 생리형을 결정하고, 배지에서 살세균제의 효과를 검정하여 병원균의 특성을 알아보았다.
solanacearum 콜로니를 세고, 콜로니 중 하나를 TTC배지에 다시 streak하여 순수배양하여 초저온냉동고(-70℃)에 저 장하였다. 분리균의 병원성은 토마토 유묘(품종: 서광 102) 의 잎자루에 상처접종하여 확인하였다. 토양으로부터 분 리한 병원균과는 별도로 병든 토마토로부터 병원균을 분 리하여 균의 특성을 밝히는 실험에 사용하였다.
분리균의 레이스(race)는 이(1999)의 방법으로, 생리형(biovar)은 Hayward (1964)의 방법으로 결정하였다. 분리균의 생리형 결정을 돕 기 위해 생리형 특이적 PCR 검정을 실시하였다. 분리균주의 total DNA는 DNeasy Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하였고, biovar 2에 특이적 primers(DIV2F: 5'CGCTTCGGTTAATACC TGGAG37DIV2R: 5'CTGCCG TGGTAATCGCCCCCC3')와 biovar 3, 4에 특이적 primers (DIV IF: 5'CGC ACTGGTTAATACCTGGTG3'/DIV 1R: C1ACCGTGG1AATCGCCCTCC3') (농촌진흥청, 2002)를 사용하여 PCR를 수행하였다.
분리균의 생리형 결정을 돕 기 위해 생리형 특이적 PCR 검정을 실시하였다. 분리균주의 total DNA는 DNeasy Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하였고, biovar 2에 특이적 primers(DIV2F: 5'CGCTTCGGTTAATACC TGGAG37DIV2R: 5'CTGCCG TGGTAATCGCCCCCC3')와 biovar 3, 4에 특이적 primers (DIV IF: 5'CGC ACTGGTTAATACCTGGTG3'/DIV 1R: C1ACCGTGG1AATCGCCCTCC3') (농촌진흥청, 2002)를 사용하여 PCR를 수행하였다. PCR 반응 혼합액은 분리균 주의 total DNA (10 ng/p.
1 로 조정하였다. 이 현탁 액 3 를 살세균제배지에 점적하고 건조시킨후 25-28℃ 배양기에 3일간 배양한 후 세균의 생장여부를 조사하여최 소생 장억 제 농도(MIC: minimal inhibitory concentration)를 조사하였다.
한 시설하 우스 내에서 3곳으로부터 약 300 g의 토양을 플라스틱 봉지에 채집하고 저온실(5-8℃에 보관하여 실험에 사용하였다. 채집한 토양 10g을 100mH 넣고 상온에서 30- 40분 동안 진탕한 후(150-200 rpm), 이 현탁액 100ul를 세 가지 선택배지(Denny and Hayward, 2001), TTC(casamino acid 1 g, peptone 10 g, glucose 5 g, 5 m/의 1% 2, 3, 5- triphenytetrazolium chloride, agar 15 g/1 /), SM-1(TTC배지 1 /에 0.1% merthiolate tincture 5 |1/, crystal violet 50 mg, polymixin P sulfate 100 mg, tyrothricin 20 mg, Chloromycetin 5 mg, cycloheximide 50 mg을 첨가), M-SMSA(glucose 5 g 대신에 5 m/의 glycerol를 포함한 TTC배지에 crystal violet 5 mg, polymixin p sulfate 100 mg, bacitracin 25 mg, Chloromycetin 5 mg, penicillin 0.5 mg, cycloheximide 100 mg을 첨 가)에 도말하고 25-28℃ 배 양기 에 두었다.
충북지역 토마토 시설재배지 토양의 풋마름병 병원균 (Ralstonia solanacearum)^] 오염도 및 분리균의 특성을 조사하였다. 총 133개 조사 토양 중 27개 토양에서 선택 배지로부터 R.
분리균의 병원성은 토마토 유묘(품종: 서광 102) 의 잎자루에 상처접종하여 확인하였다. 토양으로부터 분 리한 병원균과는 별도로 병든 토마토로부터 병원균을 분 리하여 균의 특성을 밝히는 실험에 사용하였다. 병든 토 마토의 갈색으로 변색된 도관 부분을 멸균한 칼로 2-5 mm 크기로 자른 다음 1 ml 멸균수가 든 microfuge tube에 넣 고 상온에서 약 30분간 방치한 후 멸균막대로 마쇄하여 얻은 현탁액을 M-SMSA에 도말하여 병원균을 분리하였다.
대상 데이터
충북 10개의 시 . 군의 총 133개 토마토 시설하우스에서 토양을 채집하였다. 한 시설하 우스 내에서 3곳으로부터 약 300 g의 토양을 플라스틱 봉지에 채집하고 저온실(5-8℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
병원균의 분리 및 동정. 충북 10개의 시 . 군의 총 133개 토마토 시설하우스에서 토양을 채집하였다.
군의 총 133개 토마토 시설하우스에서 토양을 채집하였다. 한 시설하 우스 내에서 3곳으로부터 약 300 g의 토양을 플라스틱 봉지에 채집하고 저온실(5-8℃에 보관하여 실험에 사용하였다. 채집한 토양 10g을 100mH 넣고 상온에서 30- 40분 동안 진탕한 후(150-200 rpm), 이 현탁액 100ul를 세 가지 선택배지(Denny and Hayward, 2001), TTC(casamino acid 1 g, peptone 10 g, glucose 5 g, 5 m/의 1% 2, 3, 5- triphenytetrazolium chloride, agar 15 g/1 /), SM-1(TTC배지 1 /에 0.
이론/모형
병든 토 마토의 갈색으로 변색된 도관 부분을 멸균한 칼로 2-5 mm 크기로 자른 다음 1 ml 멸균수가 든 microfuge tube에 넣 고 상온에서 약 30분간 방치한 후 멸균막대로 마쇄하여 얻은 현탁액을 M-SMSA에 도말하여 병원균을 분리하였다. 분리균의 동정은 Miller의 방법(1982)에 따라서MIDI(microbial identification system, MIDI library version3.90)을 이용하여 수행하였다.
분리균의 레이스 및 생리형 결정. 분리균의 레이스(race)는 이(1999)의 방법으로, 생리형(biovar)은 Hayward (1964)의 방법으로 결정하였다. 분리균의 생리형 결정을 돕 기 위해 생리형 특이적 PCR 검정을 실시하였다.
성능/효과
3% 가 풋마름병균에 오염되어 있는 것으로 나타났다(Table 1). 20.3%의 오염율은 시설재배지 5곳 중 1개의 토양이 병원균으로 오염되어 있음을 의미하는 것으로 이미 상당히 많은 시설재배지 토양에 병원균이 오염되어 있음을 말 해주고 있다. 지역별로 보면 주요 토마토 시설재배지인청주(35.
6%가 각각 감수성균주의 최소억제농도보다 10배 이상의 oxolinic acid, streptomycin, tetracycline가 함유된 배지에서 생장하였다. 5개 균주는 2개의 살세균제에 동시에 그리고 1개 균주는 3개의 살세균제 모두에 저항성을 보였다.
M- SMSA에서는 생장속도와 선택성이 모두 우수하였다. M- SMSA에서 배양 3일 후 R. solaiMtcearume 중앙은 선홍 색이며 둘레는 우윳빛을 띤 부정형의 콜로니를 형성하였으며, 이 콜로니는 배지에서 형성된 다른 콜로니와 쉽게 구별할 수 있었다(Fig. 1).
지역별 분리비율은 지역별 조사재배사 의 수가 다르므로 직접 비교하는 것은 무리가 있지만 토 마토의 시설재배지가 많은 곳에서 분리비율이 높게 나타나는 경향이었다. M-SMSA 배지에 형성된 전형적인 R. solanacearum 콜로니 수를 세어 계산한 토양 g당 병원균 의 밀도는 102-4 cfh이었다.
배지에서 살세균제에 대한 감수성. 농약으로 가장 흔 히 사용되는 4가지 살세균제의 최소억제농도(MIC)을 조사 한 결과 oxolinic acid는 0.5 |ig/mZ 이 하에서 전체균주의88.7%, streptomycincr 25μg/ml이하에서, 그리고 tetracyclinee 5 μg/m/이하에서 전체 균주의 90.2%가 생장이 억제되었다. 구리 의 경우는 375 |ig/mZ( 1.
6%)가 각각 해당 살세균제에 저항성균주로 볼 수 있다. 두 가지 이상의 살세균제에 대한 반응을 분석해보면 기개 균주 중 2개 균주가 streptomycin과 oxolinic acid에 저항성을 나타냈으며, 5개 균주가 tetracycline와 oxolinic acid에, 1개 균주가 tetracycline과 streptomycin에 뿐만 아니라 oxolinic acid에 까지 세가지 모두에 저항성을 나타내었다. 세가지 모두에 저항성을 보인 균주는 oxolinic acid, tetracycline, streptomycin의 살세균 작용기작이 다르다는 점과 또한 현재 이들 살세균제 성분은 국내에서 풋마름병 방 제용 농약으로 사용되고 있지는 않다는 것을 감안할 때 그 저항성의 유래가 매우 흥미로운 점이라고 생각한다.
오염 토양에서 병원균의 밀도는 토양 g 당 IO" cfu 로 조사되었다. 병든 토마토로부터 분리한 12균주를 포함한 총 기개의 분리균주는 모두 레이스 1이었고, 35개 균 주가 생리형 3으로, 36개 균주가 생리형 4로 구분되었다. 전체 분리균의 88% 이상이 각각 oxolinic acid 0.
4%생장이 억제되었다. 살세균제의 살균효과의 절대농도로 보면 oxolinic acid가 가장 우수한 생장억제효과를, 그리고 구리가 가장 낮은 생장억제효과를 나타냈다(Fig. 2).
시설재배지 토양에서 분 리된 59개 균주 와 병든 토마토에서 분리된 12개 균주를 기주식물인 담배, 고추, 가지, 감자, 토마토에서 병원성을 조사하여 레이스를 검정한 결과 기개 모든 균주가 레이 스 1로 나타났다. 생리형 (biovar)은 토양분리균은 biovar 3 이 28균주, biovar 4가 31균주(Table 1), 식물분리균은 biovar 3이 7, 4가 5균주로 전체 기개의 분리 중 biovar 3이 35 균주, biovar 4는 36 균주로 구분되었다. 생리형 특이 PCR 검정에서도 조사한 기개 균주 모두 biobar 3, 4 특이적 primers에 의해 1, 033 bp의 DNA가 증폭되었다.
8em;">), 식물분리균은 biovar 3이 7, 4가 5균주로 전체 기개의 분리 중 biovar 3이 35 균주, biovar 4는 36 균주로 구분되었다. 생리형 특이 PCR 검정에서도 조사한 기개 균주 모두 biobar 3, 4 특이적 primers에 의해 1, 033 bp의 DNA가 증폭되었다. 우리나라 의 담배에서 레이스 1이 보고되었고(이 등, 1982), 감자 에서는 레이스 1, 3과 생리형 2, 3, 4가 존재하며(농촌진 흥청, 2002), 조사한 균주수가 많지 않았지만 이(1999)의 보고에 의하면 고추, 담배, 참깨에서 분리한 균주는 모두 생리형 3이었고, 토마토와 가지에서 분리한 균주는 생리 형 3과 4가 비슷하였다고 하여, 본 연구에서 생리형 3과 4가 비슷하다는 연구의 결과와 일치한다.
두 가지 이상의 살세균제에 대한 반응을 분석해보면 기개 균주 중 2개 균주가 streptomycin과 oxolinic acid에 저항성을 나타냈으며, 5개 균주가 tetracycline와 oxolinic acid에, 1개 균주가 tetracycline과 streptomycin에 뿐만 아니라 oxolinic acid에 까지 세가지 모두에 저항성을 나타내었다. 세가지 모두에 저항성을 보인 균주는 oxolinic acid, tetracycline, streptomycin의 살세균 작용기작이 다르다는 점과 또한 현재 이들 살세균제 성분은 국내에서 풋마름병 방 제용 농약으로 사용되고 있지는 않다는 것을 감안할 때 그 저항성의 유래가 매우 흥미로운 점이라고 생각한다.
8em;">분리균의 레이스 및 생리형. 시설재배지 토양에서 분 리된 59개 균주 와 병든 토마토에서 분리된 12개 균주를 기주식물인 담배, 고추, 가지, 감자, 토마토에서 병원성을 조사하여 레이스를 검정한 결과 기개 모든 균주가 레이 스 1로 나타났다. 생리형 (biovar)은 토양분리균은 biovar 3 이 28균주, biovar 4가 31균주(Table 1
병든 토마토로부터 분리한 12균주를 포함한 총 기개의 분리균주는 모두 레이스 1이었고, 35개 균 주가 생리형 3으로, 36개 균주가 생리형 4로 구분되었다. 전체 분리균의 88% 이상이 각각 oxolinic acid 0.5(ig/m/, streptomycin 25 μg/m/, tetracycline 5 |ig/mZ and cupric sulfate 375 p.g/m/(1.5 mM)-g- 함유한 nutrient agar에서 생 장이 억제되었고, 전체균주의 11.3%, 4.2% and 5.6%가 각각 감수성균주의 최소억제농도보다 10배 이상의 oxolinic acid, streptomycin, tetracycline가 함유된 배지에서 생장하였다. 5개 균주는 2개의 살세균제에 동시에 그리고 1개 균주는 3개의 살세균제 모두에 저항성을 보였다.
충북지역 토마토 시설재배지 토양의 풋마름병 병원균 (Ralstonia solanacearum)^] 오염도 및 분리균의 특성을 조사하였다. 총 133개 조사 토양 중 27개 토양에서 선택 배지로부터 R. 이 분리되어, 전체 시설재배 지 토양의 20.3%가 풋마름병균에 오염되어 있음을 나타 냈다. 오염 토양에서 병원균의 밀도는 토양 g 당 IO" cfu 로 조사되었다.
충북지역의 토마토 시설재배지 조사포장 133곳 중 27 곳에서 R. soZawcerwm이 분리되어 전체 포장 중 20.3% 가 풋마름병균에 오염되어 있는 것으로 나타났다(Table 1). 20.
토마토 시설재배지 토양의 오염도. 토양으로부터 풋 마름병균을 분리하기 위해서 세가지 선택배지를 비교한 결과 M-SMSA배지가 가장 우수하였다. R.
참고문헌 (12)
Buddenhagen, I. and Kelman, A. 1964. Biological and physiological aspects of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum. Annu. Rev Phytopathol. 2: 203-230
Denny, T. P and Hayward, A. C. 2001.II Gram-negative bacteria. Ralstonia. In Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. pp151-174. ed. by N. W. Schaad, J. B. Jones, and W. Chun, The American Phytopathological Society Press
Griep, R. A., van Twisk, C., van Beckhoven, J. R. C. M., van der Wolf, J. M. and Schots, A. 1998. Development of specific recombinant monoclonal antibodies against the lipopolysccharide of Ralstonia solanacearum race 3. Phytopathol. 88: 795-803
Ito, S., Ushijima, Y, Fujii, T, Tanaka, S., Kameya-Iwski, M., Yoshiware, S. and Kishi, F. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a serniselective medium and a PCR technique. Phytopathol. 146: 379-384
Miller, L. T 1982. Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole-cell fatty acid methyl esters, including hydroxyl acids. J. Clin. Microbiol. 16: 584-586
농림부. 2002. 농림통계연보. 107pp
농업과학기술원 작물보호부 2002. 감자 풋마름병 방제기술 개발 농촌진흥청
Weller, S. A., Elphinstone, J. G., Smith, N. c, Boonham, N. and Stead, D. E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2853-2858
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