[논문]버섯병원균에 대한 길항세균 Bacillus sp. SD-10이 생산하는 항균물질의 분리

이상원; 류현순; 갈상완; 박기훈; 김철호; 최영주

doi:10.5352/jls.2004.14.3.467

문제 정의

Bacillus sp. SD-10이 생산하는 항균물질을 이용하여 버섯의 갈색무늬병균 및 푸른곰팡이병균에 대한 천연물 버섯 병해 방제약재 개발을 위한 기초적 연구를 행하였다. Bacillus sp.
본 연구에서는 Bacillus sp. SD-lOo] 생산하는 항균물질이 갖는 T. virens의 균사 생육저해 농도 및 포자발아 억제농도 등을 검토하고 항균물질의 분리 및 동정을 행하여 천연물 버섯 병해 방제약재 개발을 위한 기초연구를 행하였다.
이러한 버섯의 질병은 배지의 수분과다 및 부족, 고온, 배지불량 등 버섯재배환경에 의해서 그 발병빈도가 증가하는 경향이 있지만, 버섯의 생물적 병해를 유발시키는 병원체들이 서식할 수 없는 버섯 생육 배지를 개발한다면 버섯재배 산업의 발전에 크게 기여할 것으로 생각하였다. 그렇기 때문에 본 연구자들은 버섯의 푸른곰팡이병 및 세균성갈색무늬병을 유발하는 병원성 곰팡이와 세균의 생육을 억제하여 버섯의 안정적 생산을 위한 최적 배지를 개발할 목적으로 전보μ]에서 버섯의 폐면배지로부터 CMCase 및 amylase 효소 분비력이 매우 우수하면서 Pse. tolaassi 및 T.

제안 방법

Bacillus sp. SD-1O0] 생산하는 항균물질을 LC를 이용하여 분리한 다음 'H-, "C-NMR을 통하여 구조를 분석 . 동정 한 결과를 Fig.
12~16을 회수하여 감압농축시켜 항균혼합물 180 mg을 얻었다. 항균혼합물 180 mg을 클로로포름/메탄올의 1 :1 조건에서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 횐색분말 112 mg을 얻어 UPX-1 이 라 명 명하고, 1H-NMR과 "c-NMR을 통하여 항균물질의 구조분석을 행하였다. ‘H-NMR과 nC-NMR 스펙트럼은 Bruker AW500 (500 MHz) 분광기를 사용하였으며 내부기준 물질로 TMS (tetramethylsilane)을 사용하였다.
이상의 결과로 Bacillus sp. SD-10균주의 배양온도는 균의 생육정도 및 항균물질의 생성에 큰 영향을 미치는 것으로 판단되어 이하의 실험에서는 배양온도를 35℃~40℃로 조정하여 수행하였다. 식품산업에 응용할 목적으로 류가[8] 분리한 Bacillus sp.
virense] 포자 발아력 검토는 Bacillus sp. SD-10의 배양액을 membrane filter로 여과 멸균한 후, 121에서 15분간 멸균하여 70로 냉각한 PDA배지에 0, 1, 5, 10%씩 각각 첨가하여 잘 혼합한 후 평판배지를 제조하였다. .
T.virens생육 및 보존을 위해서는 potato dextrose agar (PDA)배지를 사용하였으며, 포자발아 억제력 검토 시는 PDA 배지에 Triton X-100을 0.05% 첨가하여 30℃, 상대습도 80% 의 growth chamber에서 배양하였다. Bacillus sp.
발아정도를 관찰하였다. 대조구는 대장균의 배양액을 동일방법으로 처리하여 비교하였다.
, em와 포자.발아정도를 관찰하였다. 대조구는 대장균의 배양액을 동일방법으로 처리하여 비교하였다.
3 g을 얻은 다음, 100 mL의 메탄올을 첨가하여 용해하는 물질만을 회수(3회 반복실시)하였다. 회수한 물질을 모두 혼합하여 45에서 다시 감압농축시켜 메탄올 분획물 3.2 g을 얻은 후, 이 분획물을 230 ~ 400 mesh의실리카겔을 충진시킨 칼럼(3×30 cm)에 로딩하여 클로로포름 /패탄올을 조건으로 메탄올의 비율을 순차적으로 높여(0~ 100%)가며 칼럼크로마토그래피를 행하였다. 용리액은 150 mL씩 분획 회수(Fr.

대상 데이터

항균혼합물 180 mg을 클로로포름/메탄올의 1 :1 조건에서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 횐색분말 112 mg을 얻어 UPX-1 이 라 명 명하고, 1H-NMR과 "c-NMR을 통하여 항균물질의 구조분석을 행하였다. ‘H-NMR과 nC-NMR 스펙트럼은 Bruker AW500 (500 MHz) 분광기를 사용하였으며 내부기준 물질로 TMS (tetramethylsilane)을 사용하였다.
동정하여 보고한 Bacillus sp. SD-10을 사용하였다(1).
에 나타내었다. 대조구(A)는 E. coliS] 배양액을 0.2 ul 의 membrane filter로 여과하여 disc paper (직경 8 mm)에 50111 흡착시켜 사용하였는데 T. virens의 생육에는 전혀 영향을 미치지 못하였다. 그러나 Bacillus sp.
버섯에 푸른곰팡이병을 일으키는 병원성 곰팡이는 실험실에 보관 중인 T. virens를 사용하였으며, 길항세균은 본 연구자들이 발효된 버섯 폐면배지로부터 직접 순수분리 . 동정하여 보고한 Bacillus sp.

성능/효과

Bacillus sp. SD-10의 배양액으로부터 항균물질을 순수분리하여 UIX-1 으로 명명하고, UPX-1 을 ‘H- NMR과 "c-NMR 스펙트럼으로 구조를 동정한 결과 탄소 6 珀로 구성된 당 2개가 2당류 구조로 결합되어 있는 화합물 임기 밝혀졌다. UPX-1은 T.
동정한 Bacillus sp. SD- 10의 항균 미생물은 버섯 병원성 곰팡이의 균사 생장은 물론 포자의 발아까지도 억제하는 것으로 나타났다.
그러나 Bacillus sp. SD-10 배양액을 첨가하지 않은 Fig. 4의 1-A 시험 구에 비하여 1% 첨가한 B시험구는 약간의 저해가 일어난 반면에 5% 및 10%를 첨가한 C 및 D 시험구에서는 T. virens 곰팡이의 포자가 전혀 발아하지 못함을 관찰할 수 있었다.
그리고 각 배양온도에서 배양한 Bacillus sp. SD-10균주의 배양액이 나타내는 T. uirens의 생육에 대한 항균 활성을 조사하였던 바 20E에서는 60%의 낮은 항균 활성을 나타내었으나, 25℃에서는 86%, 30℃~45℃에서는 95% 이상의 항균활성을 나타내었으며, 50℃ 이상에서는 항균 활성이 급격하게 떨어졌다. 이상의 결과로 Bacillus sp.
SD-10균주의 생육 및 항균물질의 생산에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위하여 배양온도를 15℃에서 55E의 범위로 변화시키면서 24시간 180 rpm으로 진탕 배양한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 배양온도에 따른 미생물의 생육과 상대적인 항균 활성은 유사한 유형을 나타내었다. 미생물의 생육은 25莒이하와 5이상의 온도에서 현저하게 떨어졌으나 30℃에서 40 ℃의 범위에서는 왕성하게 생육하여 35℃에서 4.
4의 1번 줄은 Bacillus sp. SD-10의 배양액을 0.2 nl membrane filter로 여과한 후, 그 여과액을 미리 멸균하여 준비해둔 평판배지 성분에 0, 1, 5, 10%씩 농도별로 첨가하여 잘 혼합하고 petri dish에 분주한 다음, T. 의 포자현탁액을 100 ill씩 도말하여 30의 항온기에서 배양하면서 곰팡이 포자의 발아 억제력을 관찰한 결과이다. Fig.
그러나 Bacillus sp. SD-10의 배양액을 E. 以i의 배양액과 동일하게 처리한 후 10, 30 및 50 μ1씩 농도별로 각각 처리한 B, C, D에서는 처리 농도가 높을수록 T. Mrezzs의 생육이 현저하게 억제되었다. 10 μ1를 접종한 B 시험 구에서는 약간의 저해를 나타내었지만 30 μ1를 접종한 C시 험구와 50 ㎕를 접종한。시험구에서는 뚜렷하게 버섯의 T.
virens와 Pse. tolaassi 에 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고, 천연물 버섯 병해 방제약재로서 개발할 가치가 있는 것으로 판단되었다.
5) 이것은 anomei-탄소가 1개 존재하는 2탄당에서 관찰되는 전형적인 피크이었다. 또한 13C-NMR 스펙트럼에서 관찰된 10L9ppm의 피크는 알데히드성 탄소에서 기인된 것으로 생각되며, 97.2 ppm, 92.9 ppm의 피크는 anomerio탄소가 1개 있음을 나타내는 것으로 생각되었다. 1H-NMR 스펙트럼에서 관찰된 5.
SD-10은 35~40℃의 배양온도에서 30~40 hrs 배양하였을 때 가장 높은 항균활성을 나타내었다. 이 배양액을 이용하여 T. 의 균사 생육저해 및 포자발아 억제 농도를 검토한 결과, 균사생육은 30 111 이상 처리 시 뚜렷하게 저해되었으며 포자발아는 평판배지에 5%(v/v) 이상 첨가 시 완전흐]게 억제되었다. Bacillus sp.
에 처리한 결과인데 대조구에서는 전혀 활성을 나타내지 않은 반면에 UPX-1 물질을 10 ul, 20 ill 및 30 pl을 처리한 B, C 및 D 시험구에서는 아주 뚜렷한 clear zone을 나타내었다. 이상의 결과로 UPX-1 물질은 버섯의 재배에 있어서 빈번하게 발생하는 푸른곰팡이병 및 세균성 갈색무늬병을 유발하는 원인 미생물인 T. virens와 Pse. tolaassi 에 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고, 천연물 버섯 병해 방제약재로서 개발할 가치가 있는 것으로 판단되었다.
6). 이상의 분광학적인 자료를 종합하면 탄소 6 개를 가지는 당 2개가 2탄당 구조로 존재하는 화합물인 것으로 생각되었다(Fig. 7).
SD-10은 배양 5 hr까지 유도기로 나타났으며, 그 기후부터 급격한 균체의 증식 이 이루어져 배 양 20 hr을 전후하여 정상기에 도달하여 25 hr째부터 균체 수가 천천히 감소하기 시작하였다. 항균활성은 배양10 hr째에 약 15%를 나타내겄으나 그 이후부터 급격하게 항균활성이 증가하여 15 hr, 20 nr 및 25 hr째에 각각 40%, 65% 및 90% 정도의 활성을 나타내겄으며 배 양 30 hr ~40 hr째에 가장 높은 항균활성을 나타내 었다. 류가[12] 분리 동정 하여 보고한 Bacillus sp.

후속연구

koningii등에 의해서 발병하고 있다[10]. 이러한 버섯의 질병은 배지의 수분과다 및 부족, 고온, 배지불량 등 버섯재배환경에 의해서 그 발병빈도가 증가하는 경향이 있지만, 버섯의 생물적 병해를 유발시키는 병원체들이 서식할 수 없는 버섯 생육 배지를 개발한다면 버섯재배 산업의 발전에 크게 기여할 것으로 생각하였다. 그렇기 때문에 본 연구자들은 버섯의 푸른곰팡이병 및 세균성갈색무늬병을 유발하는 병원성 곰팡이와 세균의 생육을 억제하여 버섯의 안정적 생산을 위한 최적 배지를 개발할 목적으로 전보μ]에서 버섯의 폐면배지로부터 CMCase 및 amylase 효소 분비력이 매우 우수하면서 Pse.

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