[논문]초저온 저장이 다릅나무 종자의 발아와 유묘의 생장특성에 미치는 영향

한심희; 김찬수; 장석성; 이현주

문제 정의

다릅나무 종자의 탈수와 초저온저장은 동결보호제처리 유무, 동결된 종자의 해빙 속도, 동결보호제 노출시간 및 초저온 동결 저장기간에 따른 효과를 파악하기 위하여 구분하여 실시하였다. 탈수 과정에서 사용한 동결보호제는 전 세계적으로 널리 이용하고 있는 식πㆀ 유리화 용액 (plant vitrification solution, PVS2)을 사용하였으며, PVS2는 30%(w/v) glycerol, 15%(w/v) ethylene glycol과 15%(w/v) DMSO로 구성되었다(Sakai etaZ.
본 연구는 수목 종자를 대상으로 다양한 초저온 동결 조건을 적용하고, 초저온 저장 후에 나타나는 종자의 발아 특성 및 유묘의 생리적인 특성을 조사 함으로써, 향후 난 저장성 수목 종자의 초저 온저장기술을 개발하기 위한 기초 자료를 제공하고자 하였다.
(Stanwood, 1980). 본 연구에서 종자의 수분 함량이 높은 상태에서 초저온 저장을 시도한 것은 난 저장성 종자와 같이 탈수가 어려운 종자의 초저온 저장 기술을 개발하기 위한 것이다. 즉 수분 함량이 높은 종자의 경우, 본 연구 결과에서 보여 주는 것과 같이 초저온 저장 시 동결로 인한 심각한 피해를 받는 것을 알 수 있었다.

제안 방법

발아 시험이 종료된 후, 유묘들은 처리별로 포지에 이식하고, 초저온 동결로 인한 유묘의 생장 및 생리적 특성 변화에 관한 영향을 파악하기 위하여 수고, 잎 내 엽록소 함량 및 엽록소 형광반응을 측정하였다. 생장 특성은 이식 초기와 생장 종료 시점에 측정한 수고를 이용하여 상대수고생 장율을 구하였으며, 상대수고생장율은 [Ln(x₂)-Ln(x₁)]I(t₂-t_i)의 식으로 계산하였다(Beadle, 1993).
여기서 x₂와 x₁ 은 생장 종료후(t₂)와 이식 초기(t_i)의 수고를 나타낸다. 잎 내 엽록소 함량은 SPAD 502(Minolta, Japan)의 측정값을 이용하였으며, 엽록소 형광 반응은 잎을 30분동안 암상태 에 적응시킨 후, OS5-FL Modulated Fluorometer (OPTI - SCIENCES, USA)를 이용하여 PSⅡ의 광화학 효율을 결정하였으며, Fv/Fm의 비로 표현하였다(Bolhar-Nordenkampf and Oquist, 1993).
초저온 저장 후 해빙된 다릅나무 종자는 피트모스, 펄라이트 및 모래를 1 : 1 : 1로 혼합하여 만든 배양토에 처리 당 50립씩 3반복으로 파종하였으며, 온실내에 임의로 배치한후, 매일 관수하였다. 처리 방법에 따라 매일 발아된 종자의 수를 기록하여 발아율(germinaticm rate)과 발아지수(germination index, GI)를 계산하였다. 발아지수는 GI=∑T_iN_i/S의 식을 이용하였다(Scott et al.
초저온 저장 전 종자의 동결보호제 노출시간에 따른 효과를 파악하기 위하여 노출시간은 10분, 30 분, 60분, 120분으로 구분하였으며, 또한 초저온 동결 저장 기간에 따른 효과를 파악하기 위하여, 저장 기간은 1시간, 12시간, 24시간, 48시간, 96시간, 192시간으로 하였다. 유리화 절차는 다릅나무 종자를 25℃에서 동결보호제 15 ml가 담긴 50 ml 튜브에 넣고, 각각의 정해진 시간에 도달한 후 액체 질소에 저장하였으며, 또한 정해진 저장시간이 경과한 후, 액체질소 내 저장하였던 다릅나무 종자를 꺼내어 해빙하였다.
초저온 저장 후 해빙된 다릅나무 종자는 피트모스, 펄라이트 및 모래를 1 : 1 : 1로 혼합하여 만든 배양토에 처리 당 50립씩 3반복으로 파종하였으며, 온실내에 임의로 배치한후, 매일 관수하였다. 처리 방법에 따라 매일 발아된 종자의 수를 기록하여 발아율(germinaticm rate)과 발아지수(germination index, GI)를 계산하였다.
유리화 절차는 다릅나무 종자를 25℃에서 동결보호제 15 ml가 담긴 50 ml 튜브에 넣고, 각각의 정해진 시간에 도달한 후 액체 질소에 저장하였으며, 또한 정해진 저장시간이 경과한 후, 액체질소 내 저장하였던 다릅나무 종자를 꺼내어 해빙하였다. 해빙 방법은 실온 해빙(25℃)과 급속 해빙 (45℃)으로 구분하여 실시하였으며, 완전히 해빙된 다릅나무 종자는 수돗물로 세척 하였다.

대상 데이터

et Maxim)의 종자였다. 다릅나무 종자는 2001년 가을에 오대산에 채취하여 정선한 후, 4℃의 냉장고에 저장해온 것을 이용하였다. 실험전에 다릅나무 종자의 수분 함량은 20.
초저온 저장에 이용한 공시 재료는 우리나라의 표고 100~l,800m에 자생하며, 내한성, 내음성, 내조성 (耐潮性) 및 내건성이 강하고, 각종 공해에도 잘 견뎌 조경수로서 많이 식재하는 다릅나무(Maackia amurensis Rupr. et Maxim)의 종자였다. 다릅나무 종자는 2001년 가을에 오대산에 채취하여 정선한 후, 4℃의 냉장고에 저장해온 것을 이용하였다.
다릅나무 종자의 탈수와 초저온저장은 동결보호제처리 유무, 동결된 종자의 해빙 속도, 동결보호제 노출시간 및 초저온 동결 저장기간에 따른 효과를 파악하기 위하여 구분하여 실시하였다. 탈수 과정에서 사용한 동결보호제는 전 세계적으로 널리 이용하고 있는 식πㆀ 유리화 용액 (plant vitrification solution, PVS2)을 사용하였으며, PVS2는 30%(w/v) glycerol, 15%(w/v) ethylene glycol과 15%(w/v) DMSO로 구성되었다(Sakai etaZ., 1990).

데이터처리

amurensis by the exposure of cryoprotectant before plugging into liquid nitrogen and thawing rate after cryopreservation. The different letters indicate significantly different at the probability level of 5% by Duncan's multiple range test. A: control, B: without cryoprotectant + slow thawing (25℃), C: with cryoprotectant + slow thawing (25℃), D: without cryoprotectant + fast thawing (45℃), E: withcryoprotectant + fast thawing (45 "C).

성능/효과

7%로 1시간 동결 저장한 다릅나무 종자의 발아율과 큰차이를 보여 주지 않았다. 그러나 발아지수는 동결 저장 기간에 따라 차이를 보였으며, 1시간 동결 저장시보다 저장기간이 길어질수록 발아지수는 낮게 나타났다.
99로 크게 감소하였다. 그러나 초저온 동결 저장 전 동결보호제의 노출시간은 유묘의 생장과 생리적 특성에 영향을 주지않는 것으로 나타났다(Fig. 3).
다릅나무 종자는 동결보호제 노줄 시간이 길어지 면서 발아율과 발아지수가 크게 감소하였다(Fig. 2). 즉 동결 보호제에 10분간 노출된 다릅나무 종자의 발아율과 발아지 수는 각각 31.
3% 보다 2배 정도 증가하였다. 또한 다릅나무 종자는 동결 저장한 후, 해 빙 속도에 따라 발아 특성이 다르게 나타났는데, 동결보호제가 처리되지 않은 종자의 발아율은 25P에서 천천히 해빙될 경우 6%로 매우 낮았으나, 45℃에서 급속 해빙할 경우는 15%로 증가하였다. 또한 동결보호제가 처리된 종자의 발아율은 45℃에서 급속 해빙할 경우 22%에서 31.
또한 다릅나무 종자는 동결 저장한 후, 해 빙 속도에 따라 발아 특성이 다르게 나타났는데, 동결보호제가 처리되지 않은 종자의 발아율은 25P에서 천천히 해빙될 경우 6%로 매우 낮았으나, 45℃에서 급속 해빙할 경우는 15%로 증가하였다. 또한 동결보호제가 처리된 종자의 발아율은 45℃에서 급속 해빙할 경우 22%에서 31.3%로 증가하였으며 , 발아지수는 3.14에서 4.98로 증가하였다.
또한 초저온 동결 저장된 다릅나무의 종자로부터 생산된 유묘의 상대 수고생장율, 엽록소함량 및 상대적인 유묘의 활력 지표로 이용된 광화학효율도 저장 기간과 상관이 없는 것으로 나타났다(Fig. 5). 즉, 초저온 저장은 종자의 발아 특성에 약간의 영향을 미쳤을 뿐 유묘의 생장이나 생리적인 특성에는 전혀 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
본 연구에서 다릅나무 종자는 초기 수분 함량이 20%로 매우 높은 수분상태에서 동결 저장되었다. 일반적으로 종자의 수분 함량이 15% 이상인 경우, 초저온 저장 시 세포 내 얼음 결정이 형성되어 종자의 활력이 급격히 저하되는 것으로 알려져 있다.
, 2001). 본 연구의 결과에서도 해빙 속도가 빠른 경우, 높은 발아율을 얻을 수 있었다. 따라서 수분 함량이 높은 종자의 초저온 저장시 동결보호제의 이용은 필수적이며, 저장 후 급속해빙은 동결 조직의 재생력을 증가시킬 수 있을 것으로 판단된다.
1). 즉 대조구에서 다릅나무 종자의 발아율과 발아지수는 각각 50%와 5.9였으나, 액체질소 내 동결 보존된 다릅나무 종자의 발아율과 발아지수는 6.0%와 0.7까지 감소하였다. 그러나 동결 저장된 다릅나무 종자의 발아율과 발아지수는 동결보호제를 처리할 경우 증가되는 것으로 나타났다.
2). 즉 동결 보호제에 10분간 노출된 다릅나무 종자의 발아율과 발아지 수는 각각 31.3%와 4.98이 었으나, 120분 동안 동결보호제에 노출된 다릅나무 종자의 발아율과 발아지수는 21.3%와 1.99로 크게 감소하였다. 그러나 초저온 동결 저장 전 동결보호제의 노출시간은 유묘의 생장과 생리적 특성에 영향을 주지않는 것으로 나타났다(Fig.
그러나 동결 저장된 다릅나무 종자의 발아율과 발아지수는 동결보호제를 처리할 경우 증가되는 것으로 나타났다. 즉 동결보호제를 처리할 경우, 급속 해빙된 다릅나무 종자의 발아율은 31.3%로 동결보호제를 처리하지 않은 경우의 발아율 15.3% 보다 2배 정도 증가하였다. 또한 다릅나무 종자는 동결 저장한 후, 해 빙 속도에 따라 발아 특성이 다르게 나타났는데, 동결보호제가 처리되지 않은 종자의 발아율은 25P에서 천천히 해빙될 경우 6%로 매우 낮았으나, 45℃에서 급속 해빙할 경우는 15%로 증가하였다.
4). 즉 액체 질소 내 1시간 동안 동결 저장된 다릅나무 종자의 발아율은 31.3% 나타냈는데, 액체 질소 내 196시간(8일간) 동안 동결 저장한 다릅나무 종자의 발아율은 32.7%로 1시간 동결 저장한 다릅나무 종자의 발아율과 큰차이를 보여 주지 않았다. 그러나 발아지수는 동결 저장 기간에 따라 차이를 보였으며, 1시간 동결 저장시보다 저장기간이 길어질수록 발아지수는 낮게 나타났다.
5). 즉, 초저온 저장은 종자의 발아 특성에 약간의 영향을 미쳤을 뿐 유묘의 생장이나 생리적인 특성에는 전혀 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 따라서 수목 종자의 초저온 저장은 세포 조직의 변형이나 손상없이 장기간 저장이 가능한 현지 외 유전자원 보존 방법으로 적절히 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

후속연구

즉, 초저온 저장은 종자의 발아 특성에 약간의 영향을 미쳤을 뿐 유묘의 생장이나 생리적인 특성에는 전혀 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 따라서 수목 종자의 초저온 저장은 세포 조직의 변형이나 손상없이 장기간 저장이 가능한 현지 외 유전자원 보존 방법으로 적절히 이용될 수 있을 것으로 판단된다. (Engelmann, 1997).
본 연구의 결과에서도 해빙 속도가 빠른 경우, 높은 발아율을 얻을 수 있었다. 따라서 수분 함량이 높은 종자의 초저온 저장시 동결보호제의 이용은 필수적이며, 저장 후 급속해빙은 동결 조직의 재생력을 증가시킬 수 있을 것으로 판단된다.

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