Lactoperoxidase(LPO)를 농도를 측정하기 위한 ELISA을 개발하기 위해 LPO로 면역시킨 갈색 산란계의 계란에서 형성된 anti-LPO IgY 항체를 분리 정제하고, 분리된 anti-LPO IgY 항체의 특이성을 ELISA 와 double immunodiffusion 방법으로 조사한 후 indirect ELISA 방법을 이용한 표준곡선을 만들었다. 분리 정제된 anti-LPO IgY항체의 titer는 1:520,000이며, ELISA와 double immunodiffusion 방법 모두에서 $\alpha$-lactalbumin, $\beta$-lactoglobulin, casein 및 lysozyme하고는 교차반응을 하지 않고 LPO만 높은 특이성을 갖는 항체로 나타났다. Indirect ELISA방법에서 LPO의 coating 농도는 0.25 $\mu\textrm{g}$/mL이며 anti-LPO IgY 최적 희석배수는 1:8,000으로 나타났다. Indirect ELISA 방법으로 LPO를 측정할 수 있는 표준곡선에서 민감도의 범위는 0.0l-l $\mu\textrm{g}$/mL로 나타났다.
Lactoperoxidase(LPO)를 농도를 측정하기 위한 ELISA을 개발하기 위해 LPO로 면역시킨 갈색 산란계의 계란에서 형성된 anti-LPO IgY 항체를 분리 정제하고, 분리된 anti-LPO IgY 항체의 특이성을 ELISA 와 double immunodiffusion 방법으로 조사한 후 indirect ELISA 방법을 이용한 표준곡선을 만들었다. 분리 정제된 anti-LPO IgY항체의 titer는 1:520,000이며, ELISA와 double immunodiffusion 방법 모두에서 $\alpha$-lactalbumin, $\beta$-lactoglobulin, casein 및 lysozyme하고는 교차반응을 하지 않고 LPO만 높은 특이성을 갖는 항체로 나타났다. Indirect ELISA방법에서 LPO의 coating 농도는 0.25 $\mu\textrm{g}$/mL이며 anti-LPO IgY 최적 희석배수는 1:8,000으로 나타났다. Indirect ELISA 방법으로 LPO를 측정할 수 있는 표준곡선에서 민감도의 범위는 0.0l-l $\mu\textrm{g}$/mL로 나타났다.
To determine the concentration of Lactoperoxidase (LPO), an indirect enzyme-linked immunosorbant assay(ELISA) was developed. Anti-LPO egg yolk immunoglobulin(IgY) was transferred to egg yolk by immunizing of Brown hens with LPO. The titer of purified anti-LPO IgY was 1: 520,000. The immunological re...
To determine the concentration of Lactoperoxidase (LPO), an indirect enzyme-linked immunosorbant assay(ELISA) was developed. Anti-LPO egg yolk immunoglobulin(IgY) was transferred to egg yolk by immunizing of Brown hens with LPO. The titer of purified anti-LPO IgY was 1: 520,000. The immunological response of anti- LPO IgY with ${\alpha}$-lactalbumin, ${\beta}$-lactoglobulin, casein and lysozyme were evaluated, resulting that the anti-LPO IgY found to be a specific antibody toward LPO and no cross-reaction was observed against ${\alpha}$-lactalbumin, ${\beta}$-lactoglobulin, casein, and lysozyme in double immunodiffusion test and ELISA test. In indirect ELISA method, coating concentration of LPO and dilution rate of anti-LPO IgY was 0.25$\mu\textrm{g}$/mL and 1:8,000 respectively. Sensitivity in the standard curve of LPO was ranged from 0.01 to 1$\mu\textrm{g}$/mL using anti-LPO IgY.
To determine the concentration of Lactoperoxidase (LPO), an indirect enzyme-linked immunosorbant assay(ELISA) was developed. Anti-LPO egg yolk immunoglobulin(IgY) was transferred to egg yolk by immunizing of Brown hens with LPO. The titer of purified anti-LPO IgY was 1: 520,000. The immunological response of anti- LPO IgY with ${\alpha}$-lactalbumin, ${\beta}$-lactoglobulin, casein and lysozyme were evaluated, resulting that the anti-LPO IgY found to be a specific antibody toward LPO and no cross-reaction was observed against ${\alpha}$-lactalbumin, ${\beta}$-lactoglobulin, casein, and lysozyme in double immunodiffusion test and ELISA test. In indirect ELISA method, coating concentration of LPO and dilution rate of anti-LPO IgY was 0.25$\mu\textrm{g}$/mL and 1:8,000 respectively. Sensitivity in the standard curve of LPO was ranged from 0.01 to 1$\mu\textrm{g}$/mL using anti-LPO IgY.
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문제 정의
본 연구는 LPO 량을 측정하기 위해 산란계를 이용하여 LPO에 대한 IgY 항체를 생산 분리 정제한 후 항체의 면역학 지 특성을 검토하였으며 이를 이용하여, enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법을 개발한 연구이다.
제안 방법
Anti-LPO IgY 항체의 특이성을 측정하기 위해 ELISA와 Double immunodifRision을 이용하여 a-lactalbumin, P-lactog- lobulin, casein 및 lysozyme에 대한 교차 반응을 측정한 결과를 Fig. 5, 6에 나타내었다. ELISA 방법에서는 anti-LPO IgY 항체는 단지 LPO와 반응을 하고 다른 단백질인 a-lactalbumin, 0 .
Double immunodifusion Ouchterlony 와 Nilsson(1978)의 방법을 약간 변형하여 PBS에 1% agar(Difco, USA)와 2% polyethylene glycol(PEG: sigma, USA) 600을 첨가하여 두께 1 mm 정도의 gel을 형성시킨 다음 Punch(BIO-RAD, USA)을 사용하여 직경 1.5 ~3 mm의 구멍을 뚫고, 중심원에 anti-LPO IgY 항체 또는 LPO을 넣고 주변원에 LPO, casein, a-lactal- bumin, P-lactoglobulin 및 lysozyme 또는 anti-LPO IgY 항체를 채운 후 37℃에서 하룻밤 동안 유지시킨 후 0.5% Coo- massie brilliant blue R-250(BIO-RAD, USA) 용액으로 염색하였다.
LPO를 정량하기 위해 사용한 indirect ELISA 방법은 Clarke 등(1994) 방법을 약간 변형하여 사용하였다, 50 mM carbonate buffer(pH 9.6)로 LPO을 농도별로 96 well polystyrene plate에 100 μL씩 넣고 4℃에서 하룻밤 방치하여 coating시켰다. PBST로 4번washing시킨 후 2% BSA가 포함된 10 mM PBS(pH 7.
LPO을 정량하기 위한 indirect ELISA 방법의 조건을 잡기 위해 LPO의 coating 농도와 산란계에서 생산한 anti-LPO IgY 항체의 희석농도를 측정한 것이다. LPO의 coating 농도를 0.
Lactoperoxidase(LPO)를 농도를 측정하기 위한 ELISA을 개발하기 위해 LPO로 면역시킨 갈색 산란계의 계란에서 형성된 anti-LPO IgY 항체를 분리 정제하고, 분리된 anti-LPO IgY 항체의 특이성을 ELISA 와 double immunodiffusion 방법으로 조사한 후 indirect ELISA 방법을 이용한 표준곡선을 만들었다. 분리 정제된 anti-LPO IgY 항체의 titer는 1:520, 000이며, ELISA와 double immunodiffusion 방법 모두에서 a-lactal- bumin, P-lactoglobulin, casein 및 lysozyme하고는 교차반응을 하지 않고 LPO만 높은 특이성을 갖는 항체로 나타났다.
난황에 들어있는 특이 항체의 역가는 Lee 등(2000)이 사용한 ELISA 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 50 mM carbonate buffer(pH 9.
대상 데이터
25주령된 Hy-line Brown 산란계를 사용하여 LPO 500 ㎍ 오 생리적 식염수에 녹인 후 Complete Freund's adjuvant와 섞어 만든 immimogen을 닭의 가슴 근육에 주사한 후 Incomplete Freund's adjuvant를 사용하여 5번의 booster 주사를 Fig. 1에 나타낸 간격으로 실시하고, 계란은 면역시키는 동안 매일 수지하여 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
이론/모형
계란으로부터의 anti-LPO IgY 항체는 Akita와 Nakai(1992) 박법에 따라서 일단 lipoprotein을 침전시킨 다음 수용성 분획 으로부터 분리하였다.
성능/효과
25 ㎍/mL 이며 anti-LPO IgY 최적 희석배수는 1:8, 000으로 나타났다. Indirect ELISA 방법으로 LPO를 측정할 수 있는 표준곡선에서 민감도의 범위는 0.01-1 ㎍/mL로 나타났다.
5배 이상 높은 ELISA 값을 보여 준 반면 1:16, 000과 1:32,000배로 희석한 곡선에서 나타난 ELISA 값과는 거의 비슷한 수준을 나타내고 있다. 더우기 1:4, 000배로 항체를 희석한 경우 비특이 적 결합의 평균 ELISA 값이 0.18로 높게 나타났으나 1:8, 000배의 항체 희석 경우 비특이 적 결합의 ELISA 값의 평균은 0.05로 매우 적게 나타난 사실로 보아 1:4, 000배로 항체를 희석한 곡선보다 1:8, 000배로 항체를 희석한 곡선이 nonspecific binding이 적으므로 LPO를 정량하는 데 더 적합한 것으로 생각된다. 표준곡선을 작성시 LPO 농도 측정에 영향을 주는 slope의 경사 형태를 파악하기 위해 0.
이 중 가장 격차가 큰 기울기을 갖는 것은 1:8, 000으로 항체를 희석한 곡선이다. 따라서 항체를 1:8000배로 희석한 곡선이 1:16, 000배와 1:32000배로 희석한 곡선보다 더 경사가 있는 기울기를 갖고 있어 LPO 농도를 정량 시 측정된 ELISA 값에 따라 더 민감하게 LPO의 농도 차이를 측정할 수 있다고 생각된다.
De Ceuninck 등(2001)에 의하면 면역분석의 측정한계는 표준곡선에서 zero binding 시 평균 흡광도값에서 -2 SD (Standard deviation) 한 값이 낮은 농도에서 측정된 흡광도의 평균값에 + 2 SD을 한값과 비교해서 overlap 되지 않는 농도를 표준 곡선에서 detection limit로 결정된다고 하였다. 본 실험에서 1:8000으로 희석한 곡선에서 zero binding시 측정된 ELISA 값의 평균에 표준편차를 2배 한 값은 1.464±0.058이며, LPO 0.01 μg/mL에서 측정된 평균 ELISA 값에 표준편차를 2배 한 값은 L367±0.031 로 나타난 것을 고려해보면 LPO 농도의 detection limit는 0.01 ㎍/mL로 결정된다. 따라서 Fig.
Sauer와 Foulkes(1985)에 의하면 면역분석은 면역반응의 환경조건과 항체와 항원의 상호작용이 표준곡선을 만드는데 영향을 주므로 항체가 면역반응에 미치는 noise fhctoi와 non specific 반응을 줄이기 위해서는 항체 농도와 항원 농도에 따른 avidity 고려해야 한다고 하였다. 본 실험에서 indirect ELISA에서 coating하는 항원 농도를 항체와 반응하는 avidity 를 볼 때 LPO의 coating 농도가 0.25 #g/mL에서 비특이 적 결합이 적으면서 민감도가 높은 표준 곡선을 작성할 수 있다고 생각된다.
lactalbumin, p-lactoglobulin, casein 및 lysozyme에 대해서는침강 반응을 나타내지 않았다. 본 실험에서 생산한 anti-LPOIgY 항체는 ELISA와 double immunodiffusion 방법에서 a -lactalbumin, p-lactoglobulin, casein 및 lysozyme과 교차반응을 하지 않는 특이성이 높은 항체인 것으로 나타났다.
Lactoperoxidase(LPO)를 농도를 측정하기 위한 ELISA을 개발하기 위해 LPO로 면역시킨 갈색 산란계의 계란에서 형성된 anti-LPO IgY 항체를 분리 정제하고, 분리된 anti-LPO IgY 항체의 특이성을 ELISA 와 double immunodiffusion 방법으로 조사한 후 indirect ELISA 방법을 이용한 표준곡선을 만들었다. 분리 정제된 anti-LPO IgY 항체의 titer는 1:520, 000이며, ELISA와 double immunodiffusion 방법 모두에서 a-lactal- bumin, P-lactoglobulin, casein 및 lysozyme하고는 교차반응을 하지 않고 LPO만 높은 특이성을 갖는 항체로 나타났다.Indirect ELISA방법에서 LPO의 coating 농도는 0.
산란계에서 생산한 anti-LPO IgY 항체가 항원인 LPO와 면역반응을 조사하기 위해 실시한 결과(Fig. 3, 4) LPO 항원을 중심 well에 넣고 anti-LPO IgY 항체를 주변 well에 2배 희석법으로 희석하여 double immunodiffusion를 실시한 결과(Fig. 3)를 보면 1:4까지 명확하게 침강선을 보여주었고, anti-IPO IgY항체를 중심 well에 넣고 LPO 항원을 1 mg/mL 농드부터 2배 희석법으로 희석하여 주변 well에 넣은 결과(Fig. 4)를 보면 62.5 μg/mL까지 침 강선이 형성됨을 확인할 수 있었다.
05로 매우 적게 나타난 사실로 보아 1:4, 000배로 항체를 희석한 곡선보다 1:8, 000배로 항체를 희석한 곡선이 nonspecific binding이 적으므로 LPO를 정량하는 데 더 적합한 것으로 생각된다. 표준곡선을 작성시 LPO 농도 측정에 영향을 주는 slope의 경사 형태를 파악하기 위해 0.01 /zg/mL부터 1 ㎍/mL까지 나타난 평균 ELISA 값의 차이를 항체 농도를 1:8000, 1:16, 000 및 1:32,000배로 희석한 곡선에서 보면 각각 1.206, 0.808 및 0.549S.나타났다.
후속연구
Jenness(1982) 에 의하면 양과 염소에서 분리된 lactoperoxidase는 우유의 LPO로 만든 antibovine LPO로 immunodiffusion을 실시한 결과 우유의 LPO와는 차이가 없다고 보고한 것에 비추어 볼 때 본 논문에서 생산한anti-Lactoperoxidase IgY 항체로 양과 염소에 들어있는 LPO를 측정하는데도 이용할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 이 본 연구에서 난 황의 항체를 이용하여 개발한 Indirect ELISA 방법으로도 토끼의 항원을 이용한 ELISA 방법과 거의 비슷한 수준에서 LPO의 농도를 정량하는데 사용될 수 있는 가능성이 있으며, 이 indirect EUSA방법을 식품에 적용하기 위해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.
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