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문제 정의
- 하였다. 또한 자외선 돌연변이 선별 균주의 증식 곡선을 관찰하여 효소 생성관계를 조사하고, 배양조건을 최적화함으로써 선별균주로 하여금 lipase의 역가를 향상시키고자 하였다.
- 본 연구에서는 (주)강남유지로부터 채취한 폐유와 슬러지로부터 lipase를 생산하는 효모 균주를 분리하였으며, 분리된 균주의 자외선 돌연변이를 통해 lipase 생산성이 높은 균주를 개발하고자 하였다. 또한 자외선 돌연변이 선별 균주의 증식 곡선을 관찰하여 효소 생성관계를 조사하고, 배양조건을 최적화함으로써 선별균주로 하여금 lipase의 역가를 향상시키고자 하였다.
- 슬러지로부터 분리하였다. 분리된 균주를 이용, 자외선 돌연변이를 통해 lipase 생산성이 높은 균주를 개발하였으며 산업용 배양배지의 선별, 배양공정의 개선에 관한 연구를 수행하였다. 산업용 배지의 탄소원으로는 고과당, 질소원으로는 CSL이 각각 선정되었으며, 2%의 고과당, 1%의 CSL에서 배양조건을 최적화시키고자 하였다.
제안 방법
- Amylase 역가는 Bemfeld 방법(12)에 의해 측정하였다. 1% 산화전분 용액 0.5 mil] 0.4 mL의 0.05 M phosphate buffer (pH 6.8)와 0.1 mL의 효소액을 첨가하여 60℃에서 10분간 반응시킨 후, 1 mL의 DNS 시약을 첨가하여 분광광도계를 이용, 흡광도를 측정 (at 540 nm)하여 amylase 역가를 분석하였다.
- Bradford stock solution (95% 에탄올 10 mL + 8응% 인산 20 mL +Serva blue G 35 mg)과 Bradford working buffer (증류수 85 mL + 95% 에 탄올 3 mL + 88% 인산 6 mL + Bradford stock solution 6 mL)용액을 제조하였다. 배양액을 10000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액 威를 시험관에 넣고 1 mL의 Bradford working buffer를 가하여 혼합하였다.
- Cellulase의 역 가는 filter paper (Whatman No. 1)를 이용하여 분석하였다. filter paper를 50 mg (1 x 6 cirO이 되도록 자른 후 효소 0.
- Lipase 생산 향상을 위한 균주의 성장조건 확립을 위해, 탄소원 선별 실험을 수행하였다. 탄소원으로는 포도당, fructose, sucrose, galactose, 옥수수전분, 고과당, 저당, 산화전분이 이용되었으며, 이들의 농도는 모두 1%로 고정하였다.
- , Japan)를 이용, 30℃ 에서 36시간 동안 배양하였다. 배양 후 생성된 균체들은 0.1 %의 tetracycline을 포함한 PDB 평판배지 (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 2% agar)에 접종하여 배양한 후, 각 배지 상의 기름이 분해된 영역과 세포군체의 직경을 측정하여 세포군체의 직경에 대한 분해된 기름영역의 비율을 비교함에 의해 lipase 역가가 높은 변이주를 선별하였다.
- 배양배지의 초기 pH가 균체성장 및 lipase 역가에 미치는 영향을 조사하기 위하여 기본 배지의 초기pH를 4-9로 조절하여 실험을 수행하였다. Fig.
- , Korea)에서 200 rpm으로 1시간 동안 혼합한 후, 혼합액을 NA (Nutrient Agar) 배지와 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지에 분주하여 30℃ 에서 36시간 동안 배양하였다. 배양후 생성된 세포군체를 한천배지에서 순수분리 배양한 후 광학 현미 경 (CH-2, OLYMPUS Co., USA)으로 균주의 형태를 관찰하여 효모로 추정되어지는 균주를 선별하였다.
- 53 U/mL로 나타나 균체 의 접 종량이 균체 수와 lipase 역가에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 본 실험에서는 초기 접종량을4%로 고정하여 실험을 수행하였다.
- 분리된 균주를 이용, 자외선 돌연변이를 통해 lipase 생산성이 높은 균주를 개발하였으며 산업용 배양배지의 선별, 배양공정의 개선에 관한 연구를 수행하였다. 산업용 배지의 탄소원으로는 고과당, 질소원으로는 CSL이 각각 선정되었으며, 2%의 고과당, 1%의 CSL에서 배양조건을 최적화시키고자 하였다. 1%의 올리브유 첨가, 접종량 4%, 초기 pH 5, 그리고 배양온도 27℃에서 lipase의 생산성이 최대가 됨을 확인할 수 있었으며 이때 lipase 역가는 1.
- 50 U/mL으로-증가하여 lipase의 생산은 오일 첨가에 의해 유도되어짐을 알 수 있었다. 오일의 농도를 2% 이상 10%까지 증가시켰을 때 lipase 역가가 더이상 증가하지 않아 별 다른 경향성을 보이지 않았으며, 그러므로 본 실험에서는 배양시 1%의 올리브유를 첨가하여 실험을 수행하였다.
- 오일의 농도에 따른 lipase의 생산성을 알아보기 위해 올리브유의 농도를 0~10%로 첨가하여 lipase 역가를 비교하여 보았다(Fig. 4). 오일이 첨가되지 않았을 때에는 lipase 활성이 0.
- 탄소원으로는 포도당, fructose, sucrose, galactose, 옥수수전분, 고과당, 저당, 산화전분이 이용되었으며, 이들의 농도는 모두 1%로 고정하였다. 이 때, 질소원은 1% yeast extract로 동일하게 사용하였으며 1% 올리브유를 첨가하였다. Fig.
- 질소원 선정을 위해 4가지의 질소원 (대두박, com steep liquor, 산업용 양조효모, yeast extract)이 이용되었으며, 이들의 농도는 각각 0.5%로 고정하였다. 탄소원으로는 2%의 고과 당을 이용하였으며 1%의 올리브유를 첨가하였다.
- 5%로 고정하였다. 탄소원으로는 2%의 고과 당을 이용하였으며 1%의 올리브유를 첨가하였다. Fig.
- 활성 효모의 동물사료 첨가제로의 이용성을 증진시키기 위하여 lipase 생산성이 높은 효모를 (주)강남유지로부터 채취한 폐유와 슬러지로부터 분리하였다. 분리된 균주를 이용, 자외선 돌연변이를 통해 lipase 생산성이 높은 균주를 개발하였으며 산업용 배양배지의 선별, 배양공정의 개선에 관한 연구를 수행하였다.
대상 데이터
- Lipase 생산균의 분리를 위해 (주)강남유지로부터 채취한 폐유와 슬러지를 균 분리원으로 이용하였다. 슬러지 1 g과 폐유 1 mL, 그리고 증류수 50 mL를 진탕배 양기 (K.
- 62 U/mL)를 얻을 수 있었다. 본 실험에서는 1%의 CSL을 최종 질소원으로 선정하였다.
이론/모형
- Amylase 역가는 Bemfeld 방법(12)에 의해 측정하였다. 1% 산화전분 용액 0.
- 0) 1 mL를 첨 가하여 50℃ 에서 60분간 반응시켰다. 생성된 환원당 농도는 DNS 방법을 이용, 550 nm에서 분광광도계로 측정하였다.
성능/효과
- 산업용 배지의 탄소원으로는 고과당, 질소원으로는 CSL이 각각 선정되었으며, 2%의 고과당, 1%의 CSL에서 배양조건을 최적화시키고자 하였다. 1%의 올리브유 첨가, 접종량 4%, 초기 pH 5, 그리고 배양온도 27℃에서 lipase의 생산성이 최대가 됨을 확인할 수 있었으며 이때 lipase 역가는 1.12 U/mL를 얻을 수 있었다.
- 이 때, 질소원은 1% yeast extract로 동일하게 사용하였으며 1% 올리브유를 첨가하였다. Fig. 5에서 알 수 있듯이, 대조구로 사용한 PDB와 시약급 탄소원 (포도당, fructose, sucrose, galactose)에서는 비슷한 실험값을 얻었으며, 고과당 (균체수: 6.13 X 107 cells/mL, lapase 역가: 0.58 U/mL) 과산화전분 (균체수: 5.25 X 107 cells/mL, lapase 역가: 0.53 U/mL)을 이용했을 때, 비교적 높은 lapase 역가가 나타남을 확인할 수 있었다. Fig 6은 고과당과 산화전분의 농도에 따른 lipase 역가의 변화를 나타낸 것이다.
- 9는 초기 pH의 변화에 따른 균체 수와 lipase 역가의 변화를 나타낸 것이다. Fig. 9에서 볼 수 있듯이, pH 5에서 가장 높은 균체 수와 lipase 역가가 관찰되었으며, pH가 증가할수록 균체 수와 lipase 역가가 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 균체 수와 Upase 역가가 가장 높은 초기 pH 5를 최적의 pH 조건으로 결정하였으며, 이 때의 균체 수와 lipase 역가는 각각 6.
- 90 x 107 cells/mL으로 비슷한 값을 가졌으나, 27℃ 이상의 온도에서는 온도가 높아질수록 균체 수가 감소하는 경향을 나타내었다. lipase 역가는 27℃의 배양온도에서 가장 높은 값 (1.23 U/mL)을 얻을 수 있었으며, 27℃ 이상의 배양온도에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 균체 성장과 lipase 역가 모두를 고려한 최적 배양온도는 27℃로 결정하였다.
- 7은 각각의 질소원에 따른 균체수와 lipase 역가를 나타낸 것이다. 대조구에서는 균체수: 5.12 X 107 cells/mL, lapase 역가: 0.52 U/mL인데 비해, 산업용 양조효모 (균체수: 5.95 X 107 cells/mL, lapase 역가: 0.65 U/mL)와 CSL (균체수: 6.15 X 107 cells/mL, lapase 역가: 0.68 U/mL)에서 약간 높은 셀 수와 lipase 역가를 얻을 수 있었다. Fig.
- 8은 산업용 양조효모와 CSL의 농도에 따른 lipase 역가를 나타낸 것이다. 두 질소원 모두 1%에서 최대의 lipase 역가를 나타내었으며, CSL에서 다소 높은 lipase 역가 (0.62 U/mL)를 얻을 수 있었다. 본 실험에서는 1%의 CSL을 최종 질소원으로 선정하였다.
- Fig 6은 고과당과 산화전분의 농도에 따른 lipase 역가의 변화를 나타낸 것이다. 두 탄소원 모두 2%의 농도에서 가장 높은 lipase 역가를 나타내었으며, 고과당에서 좀 더 높은 lipase 역가 (0.67 U/ml)를 얻을 수 있었다. 본 실험에서는 2%의 고과당을 최종 탄소원으로 선정하였다.
- 9에서 볼 수 있듯이, pH 5에서 가장 높은 균체 수와 lipase 역가가 관찰되었으며, pH가 증가할수록 균체 수와 lipase 역가가 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 균체 수와 Upase 역가가 가장 높은 초기 pH 5를 최적의 pH 조건으로 결정하였으며, 이 때의 균체 수와 lipase 역가는 각각 6.10 X 107 cells/mL, 0.66 U/mL으로 대조구 (균체수: 4.95 X 107 cells/mL, lapase 역가: 0.49 U/mL)에 비해 약 30% 증가했음을 알 수 있었다.
- 1에 나타내었다. 본 실험에서는 자외선 (18.8 X iSwatt/顽) 투광시간을 120초로 한 5% 내의 생존된 균주를 대상으로 하여 lipase 역가를 측정하였으며, 각각의 균주에서의 lipase 역가를 비교한 결과, 12 m-70에서 세포군체의 직경에 대한 분해된 기름 영역의 비율이 2.33으로 다른 변이주들의 지방분해 활성에 비해 다소 높은 값을 가져 (Table 1), 이 균주를 lipase 생산 균주로 선별하였다.
- 선별균주의 lipase 생성을 위한 조건에서 배양시간에 따른 균의 증식과 효소 생성능을 조사한 결과, 균의 증식은 배양 8 시간 이후 급격하게 이루어져 배양시간 24시간에 5.15 X 107 cells/mL의 균체농도를 나타내었으며, lipase는 32시간에 0.50 U/mL로 최대에 도달하였다(Fig. 2). 배양액의 pH는 30시간까지 급격하게 감소하였으나 그 이후에는 일정하게 유지되었다.
- 4). 오일이 첨가되지 않았을 때에는 lipase 활성이 0.14 U/mL를 나타낸 반면, 1% 오일이 첨가되었을 때 lipase 활성이 0.50 U/mL으로-증가하여 lipase의 생산은 오일 첨가에 의해 유도되어짐을 알 수 있었다. 오일의 농도를 2% 이상 10%까지 증가시켰을 때 lipase 역가가 더이상 증가하지 않아 별 다른 경향성을 보이지 않았으며, 그러므로 본 실험에서는 배양시 1%의 올리브유를 첨가하여 실험을 수행하였다.
- 3)는 지질과 물의 현탁액 (emulsion)의 상태에서 triglyceride의 ester 결합을 가수분해하여 glycer이과 지방산을 생성하는 효소(1)를 총칭한다. 이 효소는 동물의 췌액에서 처음으로 발견된 이래, 동물의 폐, 신장, 부신, 지방 조직, 태반 등과 식물의 밀이나 아주까리, 콩 등의 종자 내에 존재함이 밝혀졌으며, 곰팡이, 효모, 세균 등에 존재하는 미생물성 lipase도 발견되어져 생물계 전반에 lipase가 널리 분포되어 있음이 확인되었다(2).
- 3은 접종량의 변화에 따른 균체의 성장과 효소 역가의 효과를 나타낸 것이다. 접 종량 2%에서 lipase 역 가와 균체 의 수가 각각 0.36 U/mL, 2.43 x l(fceiis/mL로 가장 적게 나타났으며, 4% 이상에서는 lipase 역가와 균체의 수가 각각 3.55-3.92 x 107 cells/mL, 4.14-0.53 U/mL로 나타나 균체 의 접 종량이 균체 수와 lipase 역가에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 본 실험에서는 초기 접종량을4%로 고정하여 실험을 수행하였다.
- 나타낸 것이다. 최적화된 조건에서의 amylase의 역가와 cellulase의 역가는 각각 0.37 U/mL, 0.04 U/mL로 대조구 (amylase 역가: 0.36 U/mL, cellulase 역가: 0.02 U/mL)와 비교하여 별 다른 차이를 나타내지 않았으나, 균체 수와 단백질 함량은 각각 두 배가 증가한 것을 확인할 수 있었다 lipase 역가 또한 최적배양조건에서 1.12 U/mL (대조구: 0.51 U/mL)까지 증가하여 배양조건 최적화를 통한 선별된 변이 균주의 lipase 생성능 향상을 확인할 수 있었다.
- 배양액의 pH는 30시간까지 급격하게 감소하였으나 그 이후에는 일정하게 유지되었다. 효소생 성은 균의 증식 과 함께 증가하였으나 배 양 24시간 이후에는 효소 실활이 일어남을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 실정이다(2). 또한 미생물성 lipase는 영양원의 급원에 따라 기질 특이성, 작용기작 등의 특이성이 다양하고 lipase의 역가 또한 배양조건에 따라 차이를 보이므로 미생물성 lipase 의 생산성에 관한 연구를 위해서는 우수균주의 분리 및 동정, 배양조건 및 효소역가 측정 등에 대한 전반적인 지식이뒷 받침 되어야 할 것이다.
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