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문제 정의
- 본 연구는 권백추출물의 항산화 효과 및 UVA에 의한 human dermal fibroblast에서 MMP-1 생성 억제 효과를 검색하여 항노화 소재로써의 이용 가능성을 검토하고자 하였다.
- 본 연구에서는 권백 추출물에 의한 항산화효과 및 HDF에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 영항을 관찰하였다. 권백 추출물의 DPPH와 superoxide radical 소거효과는 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거효과를 나타냈으며, 각각 250μ以에서 72%, lOOeg/m/에서 95%로 DPPH와 superoxide radical을 소거하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
제안 방법
- MTT(3-(4, 5-dimethythiazo2-gl)-2-5-diphenytetrazolium bromide) 정량은 Mosmann")의 방법을 변형하여 실시하였다. HDF를 2X104 cells/well 농도로 96-well plate의 well에 권벅 추출물을 세포에 투여하여 CO2 배양기에서 2那]간 배양하였다.
- 알려져 있다.幻)이러한 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 권백추출물이 미치는 영향을 알아보고자 HDF에 6.3J/cm2 UVA를 조사하고 권백추출물을 첨가하여 2" 간 배양한 후 MMP-1 발현저해 효과를 ELISA을 통해 알아보았다. 그 결과 권백추출물은 농도 의존적으로 MMP-1 발현저해 효과를 나타내었다.
- 유해산소라 불려지는 활성산소는 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 지질과산화 반응을 일으켜 체내 과산화 지질을 축적함으로 인해 생체 기능이 저하되고 동시에 노화 및 성인병 질환을 유발” 하는 것으로 알려져 있으며 다양한 종류의 식물성분 및 추출물에 의한 항산화 작용이 보고되어 있다.183)권백추출물의 항산화효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정하였다. 양성 대조군으로는 항산화 작용이 있는 것으로 알려진 vitamin C를 이용하여 권백추출물의 항산화 효과를 비교하였다.
- HDF를 2X104 cells/well 농도로 96-well plate의 well에 권벅 추출물을 세포에 투여하여 CO2 배양기에서 2那]간 배양하였다. MTT 용액(5 阐m/)을 첨가하고 4시간 후 원심분古하여 상등액을 제거하고 ]00g/ acid-isopropanol(0.04N HC1 in isopropanol)를 첨가한 후 570 nm에서 micro plate reader(Model ELX 800, BIO-TEK INSTRUMENTS INC, USA)로 흡광도를 측정하였다.
- 5분, 72℃ 1분, 25 cycles로 반응시켰다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% agarose gel에서 전기 영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band을 확인 하였다. 본 실험의 RT-PCR에 사용된 primer는 Table Ⅰ에 제시하였다.
- 5 uM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase(Qiagen, Germany)로 37℃에서 60분, 93℃에서 5분 heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase Chain Reaction(PCR)은 cDNA로부터 MMP-1, [3-actin를 증폭하기 위하여 IB cDNA, 0.5 uM의 5, 과 3' primer, 10 x buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 200 uM dNTR 25 mM MgCl2, 2.5 unit Taq polymerase(Qiagen, Germany)# 섞고 distilled water로 전체를 25 B로 맞춘 다음 PCR을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃ 0.
- 5X105 cells/m/의 농도로 35 mm dish에 배양, 약 8。%의 confluency에 도달할 때까지 배양한다. UV 조사 전에 원배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지내 serum 出분을 제거 후 6.3J/cm2 UVA(UVA F15T8.BLB, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. UVA 조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM/F12(3 :1) 배지에 권백추출물을 투여하여 24시간 배양하였다.
- BLB, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. UVA 조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM/F12(3 :1) 배지에 권백추출물을 투여하여 24시간 배양하였다.
- 권백추출물의 세포독성측정과 더불어 실험에 사용될 농도 범위결정을 위해서 MTT assay를 시행하였다. HDF 세포에 대한 권백추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 권백추출물은 129 gg/mZ 이하의 농도로 처리시 세포생존율은 90% 이하로 저하되었으며 그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되었다(Fig.
- 2에 나타내었다. 양성 대조군으로 BHA(3-^-butyl-4-hydroxyanisole)# 이용하여 권백추출물의 superoxide radical 소거효과를 비교흐}였다. 그 결과 권백추출물은 투여 농도 의존적으로 superoxide radical 소거작용을 나타내 1, 10, 50, 100ng/mZ의 농도로 처리한 경우 각 superoxide radical 소거능은 14.
- 183)권백추출물의 항산화효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정하였다. 양성 대조군으로는 항산화 작용이 있는 것으로 알려진 vitamin C를 이용하여 권백추출물의 항산화 효과를 비교하였다. 그 결과 vitamin C는 60 gM 에서 50%의 DPPH radical!; 소거하였으며 , 권백추출물은 투여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거작용을 나타냈다(Fig.
대상 데이터
- 구입 한 HDF를 DMEM/F12(3 :1) 배지 에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6~10세대 세포를 실험에 이용하였다. Anti-MMP-1 antibody anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase, phosphatase substrate 는 Sigma(USA)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 구입 한 HDF를 DMEM/F12(3 :1) 배지 에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6~10세대 세포를 실험에 이용하였다. Anti-MMP-1 antibody anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase, phosphatase substrate 는 Sigma(USA)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 제공 받아 사용하였다. 권백 100 g을 분쇄하여 70% EtOH 1000 m/로 환류하면서 3시간씩 2회 반복 추출하고 감압농축, 동결 건조하여 그 분말을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 권백은 Selaginella ta/naTiscina로서 중국북경대학에서 제공 받아 사용하였다. 권백 100 g을 분쇄하여 70% EtOH 1000 m/로 환류하면서 3시간씩 2회 반복 추출하고 감압농축, 동결 건조하여 그 분말을 사용하였다.
- 신생아의 포피조직에서 분리한 human dermal fibroblast(HDF)는 Modem Tissue lechnology(MTX Korea)로부터 구입하였다. 구입 한 HDF를 DMEM/F12(3 :1) 배지 에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6~10세대 세포를 실험에 이용하였다.
- 9|ig/m/의 소거능을 보여 우수한 superoxide radical 소거효과를 나타내었다. 양성대조군인 BHA는 0.2 mM 에서 50%의 superoxide radical을 소거하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균土표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 Student's t-testS. 하였으며 p 값이 0.
이론/모형
- 항산화 활성은 DPPH(Aldrich, USA)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과 (radical scavenging effect)를 측정하는 Blois 법")을 활용하였다. 0.
- 2 - Anti-oxidant effect of STE in the NBT assay. Superoxide radical was generated by a xanthine/xanthine oxidase system and measured by NBT reduction method. The results were expressed as the average of triplicate samples with S.
- Xanthine/xanthine oxidase 반응에서 형성된 superoxide radical 소거효과는 NBT(nitroblue tetrazolium) 방법에 의해 즉정하였다.⑸ 0.
성능/효과
- 위해서 MTT assay를 시행하였다. HDF 세포에 대한 권백추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 권백추출물은 129 gg/mZ 이하의 농도로 처리시 세포생존율은 90% 이하로 저하되었으며 그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되었다(Fig. 3). IC50값은 418 Rg/mZ이었다.
- 권백 추출물의 DPPH와 superoxide radical 소거효과는 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거효과를 나타냈으며, 각각 250μ以에서 72%, lOOeg/m/에서 95%로 DPPH와 superoxide radical을 소거하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다. HDF에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1의 발현저해효과는 권백추출물 100|ig/mZ에서 75.5%로 단백질 수준에서 우수한 발현저해효과를 나타냈으며, mRNA 수준에서도 권백추출물은 모두 농도 의존적으로 발현 저해효과가 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 권백추출물은 항산화효과와 UVA에 의한 MMP-1의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 항노화 소재로써 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- Superoxide radical was generated by a xanthine/xanthine oxidase system and measured by NBT reduction method. The results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. * 力 v0.05 compared with control (BHA : 0.2 mM 3-/-butyl-4-hydroxyanisole).
- 따라서 ROS로 유도된 피부의 광산화적 손상 위험은 증가하고 있다.对) 만성적 일광 손상을 입은 피부에서 볼 수 있는 현상은 진피의 상부쪽 교원질의 비정상적인 elastotic material의 침착(solar elastosis)아과 proteoglycan0] 증가되고 진피의 주 단백질인 콜라겐이 현저히 감소되는 것이다.7)일반적으로 진피층은 대다수의 type I collagen과 약간의 type Ⅲ collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin 등으로 구성되어 있다.
- 권백 추출물의 DPPH와 superoxide radical 소거효과는 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거효과를 나타냈으며, 각각 250μ以에서 72%, lOOeg/m/에서 95%로 DPPH와 superoxide radical을 소거하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다. HDF에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1의 발현저해효과는 권백추출물 100|ig/mZ에서 75.
- 1). 권백추출물을 10, 50, 100, 250μ以 成의 농도로 처리한 경우 각 DPPH radical 소거능은 12%, 47%, 69%, 72%로 나타났으며, 은 65.1|ig/mZ의 소거능을 보여 우수한 free radical 소거효과를 나타내었다.
- 3J/cm2 UVA를 조사하고 권백추출물을 첨가하여 2" 간 배양한 후 MMP-1 발현저해 효과를 ELISA을 통해 알아보았다. 그 결과 권백추출물은 농도 의존적으로 MMP-1 발현저해 효과를 나타내었다. 권백추출물을 10, 25, 50, 100卬g/m/의 농도로 처리한 경우 MMP-1 발현저해 효과는 5.
- 양성 대조군으로 BHA(3-^-butyl-4-hydroxyanisole)# 이용하여 권백추출물의 superoxide radical 소거효과를 비교흐}였다. 그 결과 권백추출물은 투여 농도 의존적으로 superoxide radical 소거작용을 나타내 1, 10, 50, 100ng/mZ의 농도로 처리한 경우 각 superoxide radical 소거능은 14.2%, 28.4%, 48.5%, 95%로 나타났으며, IC50은 40.9|ig/m/의 소거능을 보여 우수한 superoxide radical 소거효과를 나타내었다. 양성대조군인 BHA는 0.
- ) 결론적으로 권백추출물은 HDF에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 을 단백질 및 mRNA23-24) 수준에서 빌현을 저해하는 효과가 확인 되었으며 이는 기존 보고된 retinoic acid 보다 우수한 효과를 나타내었다. 또한 HDF에서 UVA로부터 ROS가 생성되며, ROSS 인한 MMP발현2526)이 촉진되는 것을 권백추출물이 ROS 소거작용을 통하여 MMP발현을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 생각된다.
- 4). 또한, HDF에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 mRNA에 권백추출물이 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행한 결과 농도 의존적으로 MMP-1 mRNA 발현을 저해하는 것을 알 수 있었다(Fig. 5. ) 결론적으로 권백추출물은 HDF에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 을 단백질 및 mRNA23-24) 수준에서 빌현을 저해하는 효과가 확인 되었으며 이는 기존 보고된 retinoic acid 보다 우수한 효과를 나타내었다. 또한 HDF에서 UVA로부터 ROS가 생성되며, ROSS 인한 MMP발현2526)이 촉진되는 것을 권백추출물이 ROS 소거작용을 통하여 MMP발현을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 5%로 단백질 수준에서 우수한 발현저해효과를 나타냈으며, mRNA 수준에서도 권백추출물은 모두 농도 의존적으로 발현 저해효과가 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 권백추출물은 항산화효과와 UVA에 의한 MMP-1의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 항노화 소재로써 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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