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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 부산시 강동동 지역에 발생한 들깨 균핵병의 발생정도를 조사하고, 이의 생물학적 방제를 위해 우수길항균으로 확인된 B. megaterium N4 균주를 미생물제 제로 제형화하여 이들의 방제효과를 구명하고자 하였다.
제안 방법
- 0 g, FeSO4 . 7HQ 0.1 g, MnCh .4HQ 0.02 g을 첨가하여 잘 섞은 다음, 철판에 엷게 깔고 55°C 에서 48시간 동안 건조 후 블라인더로 분쇄하여, 수화제형 미생물농약인 N4제제를 제조하였다.
- N4 균주의 N4제제에 의한 들깨 균핵병의 방제효과를 플 라스틱 하우스내의 포트검정을 통하여 화학농약과 비교하였다. 이때, 수화제형 미생물농약인 N4제제는 수돗물로 100배 희석(4X108 cells/ml)하였고, 대조구인 농약은 상추균핵병의 방제 약제로 품목고시된 벤지 미다졸계의 베노밀수화제 2000 배 희석액을 공시하여, 앞서의 예방 및 치료효과 검정과 동일한 방법으로 검정하였으며, 5포트씩 5반복으로 3회 평균하였다.
- 0% 이상의 방제가를 보여 치료 효과보다는 발병 예방효과가 효과적 인 것으로 확인되었다. 길항균 N4 균주를 Bergey's manual과 API system을 이 용하여 동정한 결과, Bacillus megaterium으로 동정되었으며, 이를 수 화제형인 미생물농약 N4제제로 제조하여 유기합성 농약인 베노밀수화제와 발병예방 및 치료효과를 비교하였다. 그 결 과, 병원균처리 3일 전에 처리할 경우 N4 수화형 제제의 방 제가가 98.
- 들깨 재배 하우스내에서 잎무름 증상 및 줄기썩음 증상을 띄고 있는 병든 들깨를 채집하고 각 발병부위로부터 병원균 을 분리하였다. 병든 조직 절편을 5.
- 우수 길항균으로 최종 선발되어 병원균에 대해 발병 억제효과가 가장 큰 것으로 확인된 N4 균주의 예방효과 및 치료효과를 규명하였는데, 먼저 길항균 N4 균주의 세균부유 액을 병원균 접종 3일, 2일, 1일, 0일 전에 각각 포트에 재식한 들깨잎의 앞, 뒷면에 골고루 분무접종하고, 병원균의 균사절편을 부착하여 접종한 후 발병도를 조사하여 예방효과를 검정하였다. 반면, 치료효과는 병원균 접종 후 0일, 1일, 2일, 3일 후에 각각 세균부유액을 처리하여 발병도를 조사하였다. 접종방법은 앞서의 생육상내 포트검정과 동일하게 수행 하였다.
- 1997년 1월부터 1998년 5월 중순까지 부산시 강서구 강동 동 지역의 들깨 재배 플라스틱하우스 내에서 들깨에 나타나는 균핵병의 병징을 수시로 관찰하였다. 발병율은 들깨잎 수확말기인 1998년 5월에 강동동 지역내의 2개 하우스 재배지 에서 1하우스당 6개 구역, 구당 120X100 cm를 임의 선정하 고 구역내의 총 들깨 조사 주수(약 230주X12구역)에 대한 이 병주율을 조사하였다.
- 들깨 재배 하우스내에서 잎무름 증상 및 줄기썩음 증상을 띄고 있는 병든 들깨를 채집하고 각 발병부위로부터 병원균 을 분리하였다. 병든 조직 절편을 5.25% sodium hypo- chloride에 약 1분간 표면살균 후 멸균수로 3회 세척하여 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco, USA) 평판 배지위 에 놓아 251, 암조건하에서 2일간 배양하였다. 신장한 균사절편 을 PDA 평판배지에 이식하고 3회 반복하여 순수분리하였 다.
- 부산시 강동동 지역의 들깨 플라스틱 하우스내 들깨잎과 근권토양에서 분리하여 이미 들깨 잿빛곰팡이병균 및 잎마름 병균에 대해 균사생장 억제효과가 우수한 것으로 보고 [20, 24]된 N1 균주 등 6균주를 공시하여 PDA 평판배지 상에서 균핵병원균과 대치배양 후 병원균의 균사생육 저지대를 조사하여 가장 효과적인 공시 두 균주를 일차로 선발하였다.
- 분리된 16 균주의 들깨에 대한 병원성을 검정하기 위해, PDA 평판배지에 1주일간 배양 후 직경 8 mm의 균사절편을 포트내 재식한 들깨 잎과 줄기에 접종하여 상대습도 90%이 상, 20±2°C 생육상에 보관하면서 접종 1일 후에 균사절편을 떼어내고 2일째부터 발병율을 조사하였다. 이때, 5포트씩 5 반복으로 3회 실시하였다.
- 선발된 길항세균을 동정하기 위해 배양, 생리 및 생화학적 특성을 Bergey's manual에 따라 조사하였고, 형태는 1% PTA Negative staining하여 투과전자현미 경(Transmission electron microscopy, TEM)으로 관찰하였으며, 아울러 API 20E와 50CHB kit를 동정에 이용하였다.
- 25% sodium hypo- chloride에 약 1분간 표면살균 후 멸균수로 3회 세척하여 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco, USA) 평판 배지위 에 놓아 251, 암조건하에서 2일간 배양하였다. 신장한 균사절편 을 PDA 평판배지에 이식하고 3회 반복하여 순수분리하였 다. 잎무름 증상 및 줄기썩음 증상을 띄는 병반으로부터 병원균 S1 등 16 균주를 분리하여 4°C 저온 배양기에 보존하면서 실험에 사용하였다.
- 우수 길항균으로 최종 선발되어 병원균에 대해 발병 억제효과가 가장 큰 것으로 확인된 N4 균주의 예방효과 및 치료효과를 규명하였는데, 먼저 길항균 N4 균주의 세균부유 액을 병원균 접종 3일, 2일, 1일, 0일 전에 각각 포트에 재식한 들깨잎의 앞, 뒷면에 골고루 분무접종하고, 병원균의 균사절편을 부착하여 접종한 후 발병도를 조사하여 예방효과를 검정하였다. 반면, 치료효과는 병원균 접종 후 0일, 1일, 2일, 3일 후에 각각 세균부유액을 처리하여 발병도를 조사하였다.
- 일차로 선발한 두 균주를 생육상내 포트 검정을 통해 방제효과가 가장 높은 균주를 우수길항균으로 최종선발하였다. 이때, 방제효과 검정은 NB (Nutrient Broth, Difco, USA) 배지에서 1일간 진탕배양하여 IO, cfu/紀로 조정한 세균부유 액을 들깨잎의 앞, 뒷면에 골고루 분무접종하고, 접종 1일 후 PDA 평판배지에서 1주일간 배양한 직경 8 mm의 공시 병원균의 균사절편을 잎의 뒷면에 부착하여 상대습도 90%이 상, 20±2°C의 생육상에서 보관하면서 접종 1일 후 균사절편을 떼어내고 2일 후부터 발병도를 조사하였다. 각 처리구는 5포트씩 5반복으로 3회 조사되었으며, 이하의 모든 실험에서 방제가는 다음과 같이 환산하였다[17].
- N4 균주의 N4제제에 의한 들깨 균핵병의 방제효과를 플 라스틱 하우스내의 포트검정을 통하여 화학농약과 비교하였다. 이때, 수화제형 미생물농약인 N4제제는 수돗물로 100배 희석(4X108 cells/ml)하였고, 대조구인 농약은 상추균핵병의 방제 약제로 품목고시된 벤지 미다졸계의 베노밀수화제 2000 배 희석액을 공시하여, 앞서의 예방 및 치료효과 검정과 동일한 방법으로 검정하였으며, 5포트씩 5반복으로 3회 평균하였다.
- 일차로 선발한 두 균주를 생육상내 포트 검정을 통해 방제효과가 가장 높은 균주를 우수길항균으로 최종선발하였다. 이때, 방제효과 검정은 NB (Nutrient Broth, Difco, USA) 배지에서 1일간 진탕배양하여 IO, cfu/紀로 조정한 세균부유 액을 들깨잎의 앞, 뒷면에 골고루 분무접종하고, 접종 1일 후 PDA 평판배지에서 1주일간 배양한 직경 8 mm의 공시 병원균의 균사절편을 잎의 뒷면에 부착하여 상대습도 90%이 상, 20±2°C의 생육상에서 보관하면서 접종 1일 후 균사절편을 떼어내고 2일 후부터 발병도를 조사하였다.
대상 데이터
- 1997년 1월부터 1998년 5월 중순까지 부산시 강서구 강동 동 지역의 들깨 재배 플라스틱하우스 내에서 들깨에 나타나는 균핵병의 병징을 수시로 관찰하였다. 발병율은 들깨잎 수확말기인 1998년 5월에 강동동 지역내의 2개 하우스 재배지 에서 1하우스당 6개 구역, 구당 120X100 cm를 임의 선정하 고 구역내의 총 들깨 조사 주수(약 230주X12구역)에 대한 이 병주율을 조사하였다.
- 1997년 1월부터 1998년 5월 중순까지 부산시 강서구 강동동 지역의 들깨 플라스틱 하우스 내에 자연발생한 균핵병의 피해정도를 조사하기 위해, 2개의 플라스틱 하우스(강동I, 강 동【【)를 임의 선정하여 각 6구(A, B, C, D, E, F)씩 총 12구를 대상으로 발병율을 조사하였다. 그 결과, 최소 8.
- 이때, 5포트씩 5 반복으로 3회 실시하였다. 병원성 검정 결과, 병원성이 가장 강한 균주의 형태적, 배양적 특성 등을 조사하여 이를 동정 하고 이하의 모든 실험에 공시 균주로 이용하였다.
- 신장한 균사절편 을 PDA 평판배지에 이식하고 3회 반복하여 순수분리하였 다. 잎무름 증상 및 줄기썩음 증상을 띄는 병반으로부터 병원균 S1 등 16 균주를 분리하여 4°C 저온 배양기에 보존하면서 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 공시 길항균인 N1 균주 등 6균주의 본 병원균에 대한 균사생육 억제효과를 대치배양을 통해 검정한 결과, N1 과 N4 균주에 의한 저지대가 각각 22.0 mm와 28.0 tnm로 가장 높아 이들 두 균주를 길항균으로 일차 선발하였다(Table 2, Fig.3). 일차 선발된 이 두 균주의 생육상내 포트에서 방제효과 검정 결과, N4 균주의 방제가가 89, 5%로 N1 균주의 방제가 55.
- 길항균 N4 균주를 Bergey's manual과 API system을 이 용하여 동정한 결과, Bacillus megaterium으로 동정되었으며, 이를 수 화제형인 미생물농약 N4제제로 제조하여 유기합성 농약인 베노밀수화제와 발병예방 및 치료효과를 비교하였다. 그 결 과, 병원균처리 3일 전에 처리할 경우 N4 수화형 제제의 방 제가가 98.0%로 베노밀수화제에 의한 78.0%보다 방제가가 높았다.
- 1997년 1월부터 1998년 5월 중순까지 부산시 강서구 강동동 지역의 들깨 플라스틱 하우스 내에 자연발생한 균핵병의 피해정도를 조사하기 위해, 2개의 플라스틱 하우스(강동I, 강 동【【)를 임의 선정하여 각 6구(A, B, C, D, E, F)씩 총 12구를 대상으로 발병율을 조사하였다. 그 결과, 최소 8.1%에서 최대 28.3%까지 평균 13.9%의 발병율이 조사되었다(Table 1). 들깨 균핵병의 병징을 관찰한 결과, 처음에는 들깨 어린 줄기의 지제부와 잎에 수침상의 병반이 형성되어 차츰 갈색 내지 흑갈색으로 변하다가, 습도가 높아지면서 잎의 무름 증상과 줄기 잘록 현상이 심해져 병반이 차츰 확대되었고, 병반부는 흰색의 균사로 뒤덮혀 결국 주 전체가 고사하였다.
- 0% 이상의 발병율을 나타내었다. 그 중 병 원성 이 가 장 강한 S2 균주를 공시선발하고, 형태적 및 배양적 특성 등 을 조사하여 동정 한 결과, 들깨 균핵 병균 Sclerotinia sclerotiorum 으로 동정되었다. 생물학적 방제를 위해 길항세균인 N1 등 6균주를 공시하고 병원균 S2균주와 균사생육 억제효과 및 생육상내 포트검정을 통해 방제효과를 검정한 결과, N4 균 주에 의한 균사생육 억제효과와 방제효과가 가장 우수하였 으며, 발병예방 및 치료효과 검정시 길항균을 병원균처리 1〜3일 전에 처리할 경우 80.
- 5). 동정의 정확성을 기하기 위해 API system으로 동정한 결과, 역시 유사도 833%로 Bergey's manual의 결과와 일치하였다.
- 9%의 발병율이 조사되었다(Table 1). 들깨 균핵병의 병징을 관찰한 결과, 처음에는 들깨 어린 줄기의 지제부와 잎에 수침상의 병반이 형성되어 차츰 갈색 내지 흑갈색으로 변하다가, 습도가 높아지면서 잎의 무름 증상과 줄기 잘록 현상이 심해져 병반이 차츰 확대되었고, 병반부는 흰색의 균사로 뒤덮혀 결국 주 전체가 고사하였다. 오래된 병든 줄기에는 흑색 균핵이 다수 형성하여 병든 잎이 탈락되거나 줄기가 꺽여 쓰러지면서 부근의 건전한 들깨와 접촉하여 감염되었다(Fig.
- 들깨 잎과 근권 토양에서 분리한 세균 균주 중 병원균과의 대치배양 및 생육상내 포트검정을 통해 균사생육 억제효과와 방제효과가 우수한 공시 길항균 B. megaterium N4 균주를 선 발하여 발병예방효과와 치료효과를 검정하였는데 이 경우, 병원균 처리 1〜3일 전에 길항균을 처리한 예방효과가 치료효 과보다 우수하였다. 이는 B.
- IB). 또한, 이들 각 병반으로부터 동일한 병원균이 재분리되었는데, 이들의 형태적, 배양적 특성을 조사한 결과, 조 등[기에 의해 이미 보고된 들깨 균핵병균 Sclerotinia sclerotiorum으로 동정 되었다. 따라서, 이하의 모든 실험에 S.
- 병원균과의 대치배양 및 생육상내 포트 검정을 통해 최종 선발된 우수길항균인 N4 균주를 배양, 생리 및 생화학적 특성 조사 및 투과전자현미경(TEM) 하에서의 형태의 관찰을 통해 Bergey's manual에 따라 동정한 결과, N4 균주는 Bacillus megaterium으로 동정되었다(Table 4, Fig. 5). 동정의 정확성을 기하기 위해 API system으로 동정한 결과, 역시 유사도 833%로 Bergey's manual의 결과와 일치하였다.
- 또한, 감염된 기주의 종류나 기주의 감염부위 그리고 환경조건에 따라 솜털썩음병(cottony rot), 횐 곰팡이병(white mold), 물렁썩음병(watery soft rot), 줄기썩 음병(안em rot), 초관썩음병 (crown rot), 꽃마름병 (blossom blight) 등의 다양한 병징을 나타낸다[2] 전형적인 균핵병의 초기 병징은 하얀 솜털 균사가 나타나고 시간이 지나면 여기 에 크고 단단한 휴면체인 균핵이 나타나며, 다즙성 식물의 줄기가 감염되면 초기에는 기부에 담갈색 또는 암갈색 병반 이 나타나다가 횐 솜털 같은 균사로 뒤덮히며, 만연하면 줄 기가 썩고 병반 위쪽의 잎이 빠르게 말라죽는데, 어떤 경우는 잎이 먼저 감염된 후 줄기로 이동하기도 한다[11]. 본 연 구에서 조사된 들깨 균핵병의 병징 역시 잎과 줄기에 갈색의 수침상 병반이 형성되고 무름증상과 썩음증상이 나타나며 흰색의 균사로 덮히는 등 전형적인 균핵병 증상을 보였다.
- 본 연구에서는 제제화를 위한 bio-gel을 천연고분자 재료 인 옥수수전분과 밀가루를 사용하였는데, 이는 전착제로서 의 기능 뿐 만 아니라 약효증진 및 길항균 생존에 필요한 영 양원으로도 작용하여 방제에 매우 효과적이었다고 생각된 다. 본 연구자에 의해 기보고된 들깨잿빛곰팡이병 방제용 soy 제제에서는 콩가루와 쌀가루를 이용하여 높은 방제효과 를 검정하였으며[15], 가지잿빛곰팡이병 방제용 미생물농약 제조에서는 콩가루, 밀가루, 비지가루, 옥수수전분, 쌀가루, 찹쌀가루 등을 다양하게 이용하여 이들의 우수함을 보고하 였다[21].
- 이들 3종을 결정하는데에는 자낭포자 의 길이와 폭의 비, 자낭포자내의 핵 수, 동일 자낭내 자낭포 자 크기 차이의 유무, 균핵의 내외부 형태 등에 따라 구분하 였다[14, 16, 23, 25]. 본 연구에서도 공시균인 S2 균주의 유성세 대인 자낭을 형성시켜 자낭과 자낭포자 등의 특징을 관찰한 결과, 자낭내에 8개의 자낭포자가 형성되고 자낭포자의 핵수는 2핵이었으며 자낭포자의 길이와 폭의 비는 2.2였고, 8개 자낭포자의 크기가 모두 동일하였다. 이 결과를 Sclerotinia속 3종의 특징과 비교해 보면[14], 자낭포자의 길이와 폭의 비가 S.
- 분리된 병원균 16균주의 들깨에 대한 병원성 검정에서 균사절편을 들깨 잎에 치상한 뒤 접종 1일 후부터 발병되기 시작하여 접종 7일 후에는 공시한 16 균주 모두 80% 이상의 발병율을 나타내었으며(Fig. 2), 이들 중 S2 균주가 병진전이 가장 빠르고 병원성이 강하였으며, 자연발병에서와 동일한 병징을 나타내었다(Fig. IB). 또한, 이들 각 병반으로부터 동일한 병원균이 재분리되었는데, 이들의 형태적, 배양적 특성을 조사한 결과, 조 등[기에 의해 이미 보고된 들깨 균핵병균 Sclerotinia sclerotiorum으로 동정 되었다.
- 그 중 병 원성 이 가 장 강한 S2 균주를 공시선발하고, 형태적 및 배양적 특성 등 을 조사하여 동정 한 결과, 들깨 균핵 병균 Sclerotinia sclerotiorum 으로 동정되었다. 생물학적 방제를 위해 길항세균인 N1 등 6균주를 공시하고 병원균 S2균주와 균사생육 억제효과 및 생육상내 포트검정을 통해 방제효과를 검정한 결과, N4 균 주에 의한 균사생육 억제효과와 방제효과가 가장 우수하였 으며, 발병예방 및 치료효과 검정시 길항균을 병원균처리 1〜3일 전에 처리할 경우 80.0% 이상의 방제가를 보여 치료 효과보다는 발병 예방효과가 효과적 인 것으로 확인되었다. 길항균 N4 균주를 Bergey's manual과 API system을 이 용하여 동정한 결과, Bacillus megaterium으로 동정되었으며, 이를 수 화제형인 미생물농약 N4제제로 제조하여 유기합성 농약인 베노밀수화제와 발병예방 및 치료효과를 비교하였다.
- 생육상내 포트검정에서 높은 발병억제 효과가 확인된 N4 균주에 의한 발병예방 및 치료효과를 검정한 결과, 길항균과 병원균을 동시 접종하거나 길항균을 병원균보다 1일〜3일 전처리할 경우 88.4〜91.5%로 모두 80.0% 이상의 방제가를 보여 발병 예방효과가 높았다. 하지만, 길항균을 후처리할 경 우 0〜14.
- 예비실험을 통해 B, megaterium N4 균주의 길항력 제고에 효과가 확인된 옥수수전분 등율 첨가하여 수화제형 N4제제 로 제제화하고 본 병원균에 대한 방제효과를 생육상내 포트 검정을 실시하였는데, 유기합성 농약인 베노밀수화제 처리 와 비교한 결과, 앞서의 발병예방 및 치료효과에서와 마찬가지로 치료효과는 높지 않았으나, N4 제제의 3일 전처리에 는 98.0%로 높은 방제가를 보여 베노밀수화제 처리보다 효과적이고 예방효과가 전반적으로 높았다(Table 5, Fig. 6).
- 9%였다. 이러한 증 상을 띄는 병반으로부터 분리된 16 균주를 균사절편 접종법 으로 병원성 검정한 결과, 접종 1일 후부터 발병되기 시작하 여 자연발생된 병징과 동일한 증상을 나타내었으며 16 균주 모두 80.0% 이상의 발병율을 나타내었다. 그 중 병 원성 이 가 장 강한 S2 균주를 공시선발하고, 형태적 및 배양적 특성 등 을 조사하여 동정 한 결과, 들깨 균핵 병균 Sclerotinia sclerotiorum 으로 동정되었다.
- 3). 일차 선발된 이 두 균주의 생육상내 포트에서 방제효과 검정 결과, N4 균주의 방제가가 89, 5%로 N1 균주의 방제가 55.5% 보다 월등히 우수하여, N4 균주를 본 들깨 균핵병원균 S2 균주에 대한 우수길항균으로 최종 선발하였다(Fig. 4).
- 0 보다 작다. 자낭내 핵 수는 S. 와 S. trijoliomm은 4핵인데 반해 S. sclerotionim은 2핵이었으며, 자낭내 8개 자낭포자의 크기에 대해서도 S. tTcfolioTiini은 자낭포자 크기가 대, 소 2종이 4:4의 비로 나타 난 반면, S. minor와 S. sclerotioun은 모두 동일하다고 기술 하였는데, 이상의 모든 특징들을 종합하여 보면, 본 공시균인 S2 균주는 S. sderotiomm으로 동정되었으며 이미 보고된 들 깨 균핵병균과 동일하였다[7].
후속연구
- 미생물 농약을 상품화하고 실용화되기 위해서는 반드시 보관상의 안정성과 안전성 등에 관한 조사가 수반되어야 하는데, 장기간 보존을 위한 보조제 사용에 관한 실험과 약효 . 약해 검정 등이 추후 보완되어야 할 것이다.
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