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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 L-threonine 생산량을 증가시키기 위해 같은 aspartate 계열의 아미노산인 L-lysine에서 생산량 증가를 위해 시도된 바 있는 pyruvate carboxylase 유전자 [11, 12]를 plasmid 형태(pPYC)로 L-threonine 생산 균주인 E. coli MT201에 도입하여 재조합 균주인 E. coli MT/pPYC를 획득하였다. 그렇지만 재조합 균주인 E.
제안 방법
- 4 kb의 DNA 단편을 획득하였다. 이들 PCR 산물의 확인은 plasmid pUC19의 HizzdⅢ부위에 cloning 증]" 여 DNA sequencing을 통하여 pyc유전자의 ORF임를 확인하였다(결과 미제시). 한편 4.
- coli MT/pPYC를 획득하였다. E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산성을 확인하기 위해 모균 주인 E. coli MT201의 배양 조건과 동일한 조건으로 유가식 배양을 실시하였다. 유가식 배양 결과 균체의 증식(OD660)은 총 배양 122시간에 약 41까지 증가하였고 L-threoninee 최고 36.
- E. coli MT201과 E. coli MT/pPYC의 생육 및 L-threonine 생산에 필요한 탄소 원으로 포도당만을 첨가한 경우와 포도당과 sodium citrate를 함께 첨가한 경우를 각각 플라스크 상에서 비교하였다. 플라스크 배양에 사용된 탄소 원은 각각 포도당(5%), 그리고 포도당(3%) + sodium citrate (2%) 으로 하였다.
- E. coll 배양을 위한 일반 배지는 Luria-Bertani 배지를 약간 변형한 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl)와 M9 최소배지 (6 g/1 Na2HPO4, 3 g/1 KH2PO4/ 0.5 g/1 NaCl, 1 g/1 NHtCl, 0.002 M MgSO% 0.4% 포도당, 0.0001 M CaCl2) 를 사용하였으며, 필요에 따라 ampicillin을 50 mg/1 첨가하여 사용하였다. 형질 전환용 배지는 SOC 배지(2% tryptone, 0.
- 2). Koffas 등[4]과 Peters-Wendisch 등[13]의 논문을 참조하여 양 말단에 HindHI 제한효소부위를 지니는 primer를 각각 제작하였다. 이들 primer로 Corynebacterium glutamicum으로부터 정제.
- L-Hueonine의 생산을 위한 플라스크용 배지는 liter 당 70 g 포도당, 2 g yeast extract, 20 g (NHQ2SO4, 1 g MgSO4, 1.5 g KH2PO4, 10 mg FeSQ, 30 g CaCO3, 10 mg MnSCQ 를 첨가한 배지를 사용하였고, 발효조 배양을 위한 종균 배지는 liter 당 10 g 포도당, 10 g tryptone, 7 g yeast extract, 1 g (NH4)2SO4, 10 g NaCl, 2 g KH2PO4의 조성으로 된 배지를 사용하였다. 발효조에서 L-threonine 생산에 사용된 배지는 liter 당 50 g 포도당, 2.
- L-Threonine 생산 균주인 E. coli MT201의 생육 및 L- threonine 생산량을 확인하기 위해 탄소 원이 포도당으로 구성된 발효배지에서 유가식 배양을 실시하였다. 5 liter 발효 조를 이용하여 유가식 배양을 실시한 결과 E.
- TCA 회로상의 중간대사 산물을 공급함으로써 E. coli MT/pPYC의 생육 및 L-threonine 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 citric acid를 포도당과 함께 공급하였다. 배 양액 중의 pH를 고려하여 sodium citrate와 ammonium citrate의 영향을 각각 조사한 결과로부터 sodium 염이 ammonium 염보다 균체 증식 및 생산에 효율적임을 알 수 있었다(결과 미제 시).
- coli MT/pPYC에 대한 탄소 원으로 포도당과 sodium citrate를 혼합한 배양이 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 있어 효과적임을 확인하였다. 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 영향을 주는 탄소 원의 최적 농도를 결정하기 위해 포도당과 sodium citrate를 5% 이내에서 다양한 농도비로 첨가하였다.
- )에 첨가하였다. 배양 온도는 30℃, pH는 25% NHQH를 사용하여 6.0으로 일정하게 조절하였고 교반 속도와 통기 속도는 용존 산소의 농도가 20% 이상 유지되도록 적절하게 조절하였다.
- 상기 실험에서 확인된 최적의 포도당과 sodium citrate의 첨가비 (35L5)를 이용하여 5 liter 발효조에서 유가식 배 양에 의한 재조합 균주 E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산량을 확인하였다. 첨가 배지는 탄소 원인 포도당의 농도가 발효조 내에서 5 g/1 이하로 되었을 때 간헐적으로 공급하였다.
- L-Threonine의 대량생산을 위해서는 전구물질인 oxalo- acetate의 과량생성이 필요하다. 이를 위하여 해당 과정의 py- ruvate로부터 직접 oxaloacetate를 생성하는 pyruvate carboxylasee 과량생산을 위한 발현용 plasmid, pPYC를 제작하였다(Fig. 2). Koffas 등[4]과 Peters-Wendisch 등[13]의 논문을 참조하여 양 말단에 HindHI 제한효소부위를 지니는 primer를 각각 제작하였다.
- coli MT/pPYC는 포 도당을 첨가한 배지에서 모 균주인 E coli MT201보다 더 낮은 성장과 L-threonine 생산량을 보였다. 이를 해결하기 위해 새로운 기질로 sodium citrate를 선정하여 sodium citrate의 배지 중 적정농도 및 이를 이용한 배양 조건과 L-threonine 생산량에 관하여 연구하였다.
- 균체 농도는 배양액을 증류수로 적당히 희석한 후 spectrophotometer (JASCO V-530, JASCO Corporation, Japan)를 사용하여 660 nm에서 측정하였다. 포도당 농도는 YSI Glucose & Lactate Analyzer (YSI 2700 SELECT, Yellow Springs Instruments Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, L-threonine 농도는 Kase의 ninhydrin 방법 [3]을 변형하여 사용하였다.
- 이들 PCR 산물의 확인은 plasmid pUC19의 HizzdⅢ부위에 cloning 증]" 여 DNA sequencing을 통하여 pyc유전자의 ORF임를 확인하였다(결과 미제시). 한편 4.2 kb의 E. coil서 발현하는 plasmid pTrc99A를 먼저 제한효소 Ncol으로 절단하여 평활화시킨 후에 reading frame을 맞주기 위하여 HmdⅢ 링커 (Takara, Japan)를 부착하여 최종적으로 제한효소 Himdlll로 절단한 후에 이 부위에 상기의 pyruvate carboxylase 유전자를 포함하는 3.4 kb의 DNA 단편을 연결하여 7.5 kb의 expression plasmid pPYC를 제작하여 agarose gel 상에서 확인하였다(결과 미제시).
대상 데이터
- 5 g KH2PO4, 10 mg FeSQ, 30 g CaCO3, 10 mg MnSCQ 를 첨가한 배지를 사용하였고, 발효조 배양을 위한 종균 배지는 liter 당 10 g 포도당, 10 g tryptone, 7 g yeast extract, 1 g (NH4)2SO4, 10 g NaCl, 2 g KH2PO4의 조성으로 된 배지를 사용하였다. 발효조에서 L-threonine 생산에 사용된 배지는 liter 당 50 g 포도당, 2.5 g yeast extract, 10 g (NHeSO% 1 g MgSO4, 2 g KH2PO4, 10 mg FeSQ, 5 mg MnSQ를 첨가한 배지를 사용하였고 유가식 배양을 위한 첨가 배지의 조성은 liter 당 40 g 포도당, 0.2 g methionine, 0.25 g KH2PO4이 었 다. 필요에 따라 ampicilline 50 mg/1의 농도로 첨가하였다.
- 상기의 방법으로 제작된 plasmid를 E. coli MT201에 도입하여 형질 전환된 균주인 E. coli MT/pPYC를 획득하였다. E.
- coli MT/pPYC의 생육 및 L-threonine 생산에 필요한 탄소 원으로 포도당만을 첨가한 경우와 포도당과 sodium citrate를 함께 첨가한 경우를 각각 플라스크 상에서 비교하였다. 플라스크 배양에 사용된 탄소 원은 각각 포도당(5%), 그리고 포도당(3%) + sodium citrate (2%) 으로 하였다.
- 0001 M CaCl2) 를 사용하였으며, 필요에 따라 ampicillin을 50 mg/1 첨가하여 사용하였다. 형질 전환용 배지는 SOC 배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCh, 20 mM 포도당)를 사용하였다.
- 이들 primer로 Corynebacterium glutamicum으로부터 정제. 회수된 염색체 DNA로부터 Takara LA Taq kit (Takara, Japan)를 이용하여 Delta Cycler II system (Ericompz USA)으로 Takara사의 실험법에 따라 실시하여 pyc 유전자를 포함하며 Hindill의 제한효소 부위를 양 말단에 지니는 약 3.4 kb의 DNA 단편을 획득하였다. 이들 PCR 산물의 확인은 plasmid pUC19의 HizzdⅢ부위에 cloning 증]" 여 DNA sequencing을 통하여 pyc유전자의 ORF임를 확인하였다(결과 미제시).
성능/효과
- coli MT201의 생육 및 L- threonine 생산량을 확인하기 위해 탄소 원이 포도당으로 구성된 발효배지에서 유가식 배양을 실시하였다. 5 liter 발효 조를 이용하여 유가식 배양을 실시한 결과 E. coli MT201의 경우에 총 배양 112시간 동안에 균체량은 흡광도(OD660)을 기준으로 약 52까지 증가하였고, 배양 중 L-threordnee 최고 57 g/1가 생산되었다(Fig. 1A).
- L-Threonine 생산량과 마찬가지로 균체의 생육 역시 포도당과 sodium citrate의 농도비 35:1.5의 비율로 첨가되었을 때 L-threonine 생산 균주의 생육이 가장 좋았다(Table 4). 그렇지만 포도당과 sodium citrate의 농도비가 2:3의 비율로 첨가되었을 때에는 배양 32시간 이후부터 생육이 감소하는 경향을 보였는데 이는 포도당의 고갈에 의한 것으로 추측된다(Table 4).
- 5, 2:3)를 다르게 하여 배양을 실시한 결과 균주의 생육은 배양 전반에 걸쳐 유사한 증식 형태를 보였다. L-Threonine 생산성을 검토하면 sodium citrate의 농도가 높을수록 초기 L-threonine 생산량은 증가되었으나 특히 포도당과 sodium citrate의 농도비가 3.5:L5의 비율로 첨가되었을 때 가장 높은 생산량(5.14 g/1)을 보였다(Table 3).
- coli MT201을 이용한 배양의 경우와 유사한 결과를 보였다. 따라서 L-threonine 생산량 증대를 목적으로 형질 전환 된 E. coli MT/pPYC 균주에 대해서 sodium citrate의 첨가 가 L-threonine 생산량뿐만 아니라 균체 증식(OD660)에 대해 서도 포도당만을 탄소 원으로 사용한 경우에 비해 더 좋은 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- coli MT/pPYC의 생육 및 L-threonine 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 citric acid를 포도당과 함께 공급하였다. 배 양액 중의 pH를 고려하여 sodium citrate와 ammonium citrate의 영향을 각각 조사한 결과로부터 sodium 염이 ammonium 염보다 균체 증식 및 생산에 효율적임을 알 수 있었다(결과 미제 시).
- coli MT201의 배양 조건과 동일한 조건으로 유가식 배양을 실시하였다. 유가식 배양 결과 균체의 증식(OD660)은 총 배양 122시간에 약 41까지 증가하였고 L-threoninee 최고 36.5 g/1까지 생산되었다(Fig. IB)
- 플라스크 배양 결과 모 균주인 E. coli MT201에서 탄소원으 로 포도당만을 사용한 배양에서는 0.99 g/1의 L-threonine0] 생산된 반면 2%의 sodium citrate를 같이 첨가한 배양에서는 탄소 원으로 포도당만을 첨가한 경우보다 훨씬 높은 4.18 g/1의 I-threonine이 생산되었다. L-Threonine 생산량의 증가뿐만 아니라 균체의 증식 (OD660) 역시 3.
- 플라스크 배양에서 E. coli MT/pPYC에 대한 탄소 원으로 포도당과 sodium citrate를 혼합한 배양이 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 있어 효과적임을 확인하였다. 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 영향을 주는 탄소 원의 최적 농도를 결정하기 위해 포도당과 sodium citrate를 5% 이내에서 다양한 농도비로 첨가하였다.
- 플라스크 상에서 포도당과 sodium citrate의 농도비(4:1, 3.5:15, 3:2, 252.5, 2:3)를 다르게 하여 배양을 실시한 결과 균주의 생육은 배양 전반에 걸쳐 유사한 증식 형태를 보였다. L-Threonine 생산성을 검토하면 sodium citrate의 농도가 높을수록 초기 L-threonine 생산량은 증가되었으나 특히 포도당과 sodium citrate의 농도비가 3.
- 형질전환 균주 E. coli MT/pPYC는 glucose하에서 E. coli MT201보다 균체 증식 및 L-threonine 생산량 모두가 감소되었다. 이는 포도당이 해당 과정을 거쳐 TCA 회로를 회전하면서 생육에 필요한 전구체인 중간대사 산물을 공급해 주어야 하는데 pyruvate carboxylase에 의해서 oxaloacetate로의 공급은 원활하였으나 상대적으로 TCA 회로의 중간 대사산물의 공급이 원활하지 않아 균체의 생육이 억제받았으며 이로 인하여 일 차대 사산 물인 L-threonine 생산량이 감소한 것으로 추측된다.
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